雙水相萃取分離紅高粱色素工藝研究

　　摘要：以雙水相法萃取分離紅高粱色素，選取聚乙二醇(PEG)/(NH4)2SO4組成的雙水相體系從高粱粒中萃取紅高粱色素，確定雙水相的組成成分PEG/(NH4)2SO4對色素的影響。采用單一變量法，分別測定PEG分子量、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水浴溫度、粗提取液體積萃取紅高粱色素的最佳值，按照方案進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到萃取高粱色素的最佳條件：PEG2000質(zhì)量為1.8g，(NH4)2SO4質(zhì)量為1g，水浴溫度為30℃，粗提取液體積為1.0mL，加蒸餾水定量到10g時，紅高粱色素的萃取率最高。

　　關(guān)鍵詞：紅高粱色素;雙水相;單一變量法;響應(yīng)面分析法

　　高粱紅色素，屬于黃酮類色素，含有多個酚羥基，具有特別強(qiáng)的抗氧化活性，可以用于食品、醫(yī)藥、化妝品和染色劑等領(lǐng)域[1-4]。雙水相萃取技術(shù)是一種新型的萃取分離技術(shù)，它的優(yōu)點(diǎn)在于所需設(shè)備簡單、易于操作、傳質(zhì)速度快、條件較溫和、分相時間較短、易于工藝放大和連續(xù)進(jìn)行操作[5-9]。關(guān)晴月等[10]采用超聲波法和響應(yīng)面分析法對紫甘薯色素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化;姜彬等[11]采用雙水相法萃取食用色素檸檬黃;王紅艷等[12]以PEG/(NH4)2SO4為雙水相體系對食用色素進(jìn)行萃取分離，結(jié)果表明體系具有溶劑價格低廉、毒性較低、較易揮發(fā)而不需要反萃取等特點(diǎn)。

　　因此，研究雙水相法萃取分離高粱紅色素的最佳工藝條件是非常有意義的。本文確定雙水相體系，進(jìn)行單因素測定，確定PEG分子量、PEG質(zhì)量、(NH4)2SO4質(zhì)量、水浴加熱溫度、粗提取液體積的最佳值。采用響應(yīng)面分析法進(jìn)行分析，得出萃取條件的最優(yōu)值。

　　1實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

　　1.1試劑及儀器

　　95%乙醇(AR)、AB-8大孔樹脂(AR)、PEG(1000，2000，4000，6000)、(NH4)2SO4(AR)：天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠。722G可見分光光度計(jì)上海儀電分析儀器有限公司;高速萬能粉碎機(jī)天津泰斯特儀器有限公司;TD4臺式低速離心機(jī)湖南赫西儀器裝備有限公司;BL6-180A超聲波清洗機(jī)上海比朗儀器有限公司;RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

　　1.2高粱色素純品的制備

　　取適量的AB-8大孔樹脂[13-14]于帶塞三角瓶中，再加入無水乙醇沒過大孔樹脂，在室溫下密封浸泡8h，然后用蒸餾水多次沖洗，直到AB-8大孔樹脂無醇味后備用。準(zhǔn)確稱取5g預(yù)處理好的高粱粉末于錐形瓶中，再加入90mL40%乙醇和pH9的氫氧化鈉10mL，將溫度設(shè)置為50℃，超聲提取30min，過濾后取上清液，然后將事先處理好的AB-8大孔樹脂裝入洗凈晾干的層析柱中，用蒸餾水水洗，緩慢加入上清液進(jìn)行吸附，吸附完全后，用30%乙醇洗脫，重復(fù)以上的過程，得到純化后的高粱色素。將純化后的高粱色素，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)出乙醇，得到純的高粱色素固體，然后放入干燥箱中干燥至色素粉末，備用。

　　1.3高粱色素波長的測定

　　取紅高粱色素[15]精制品0.0500g用18mL40%乙醇和pH9的氫氧化鈉溶液2mL充分混合后，用40%乙醇定容到20mL，使用可見分光光度計(jì)測定200～800nm范圍內(nèi)的吸光度。波長逐漸增加，吸光度值出現(xiàn)先增加后減少的趨勢，最高點(diǎn)出現(xiàn)在494nm處，故最佳波長為494nm。

　　1.4高粱色素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　取0.0412g的高粱色素完全溶解于40%乙醇中，然后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，加入10mL濃度為0.01mol/L的NaOH溶液，用40%乙醇定容至100mL，再用移液管移取5，10，15，20，25mL至5個100mL容量瓶中，用乙醇的堿溶液(乙醇與堿的比例為9∶1)定容至100mL，在494nm的波長下測定吸光度值。在0～100mg/L范圍內(nèi)，濃度與吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為：A=-0.00283+0.00990c，相關(guān)系數(shù)R2=0.9996。

　　1.5雙水相體系的確定

　　用移液管移取1mL高粱紅色素溶液于10mL刻度離心管內(nèi)，再加入適量的PEG和(NH4)2SO4，最后加入蒸餾水至10g。上下?lián)u動，使其完全溶解，放入離心機(jī)中以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，形成雙水相，上相是PEG萃取的色素相，下相為鹽相，倒入分液漏斗后靜置，使其上下相分離，測定上下相的體積并記錄，然后在494nm的波長下測定上下相的吸光度值，計(jì)算萃取率。萃取率：Y=上相色素含量/總含量。

　　1.6PEG種類和濃度及(NH4)2SO4濃度對色素吸光度的影響在10mL刻度離心管中加入1mL的色素，分別加入5%、10%、15%、20%的PEG，或者濃度為5%、10%、15%、20%、25%、30%的(NH4)2SO4，加入蒸餾水至10g，參比為不含色素的溶液，重復(fù)以上步驟，并分別測定不同濃度的PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000的吸光度值。在測定的范圍內(nèi)，PEG的分子量和濃度及(NH4)2SO4的濃度對色素的吸光度影響不大，所以可用相應(yīng)的溶液作參比來消除產(chǎn)生的影響。

　　2超聲波輔助雙水相萃取紅高粱色素的工藝研究

　　2.1聚乙二醇分子量對萃取效果的影響在10mL刻度離心管中加入1mL的色素溶液，再加入不同種類的1.8gPEG(PEG的種類分別為PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000)和1.5g(NH4)2SO4，用蒸餾水定容至10g，以30℃的溫度水浴加熱10min，放入離心機(jī)中以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，可以明顯地看到，刻度離心管內(nèi)分成兩相，倒入分液漏斗內(nèi)靜置后，測定上層和下層的體積(參比液為不加色素的雙水相溶液)，在494nm的波長下測定吸光度值，代入萃取率的公式得出萃取率。PEG2000的萃取率最高，所以采用PEG2000的分子量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，故在下面的測定過程中選擇PEG2000作為測定標(biāo)準(zhǔn)。

　　2.2聚乙二醇質(zhì)量對萃取效果的影響在10mL刻度離心管中加入1mL的色素，再加入不同質(zhì)量(1.2%、1.5%、1.8%、2.1%、2.4%)的PEG2000和1.5g的(NH4)2SO4，用蒸餾水定容至10g，參比為不含色素的雙水相溶液，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)步驟，在494nm的波長下測定吸光度值。隨著PEG2000質(zhì)量逐漸增加，體系的萃取率呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，可能是質(zhì)量增加過高時，PEG2000部分很難溶解，不能很好地形成雙水相體系，導(dǎo)致萃取率降低。所以1.8gPEG2000和1.5g(NH4)2SO4形成的雙水相萃取率最高，故在下面的測定過程中選擇1.8gPEG2000作為測定標(biāo)準(zhǔn)。

　　2.3(NH4)2SO4質(zhì)量對萃取效果的影響在10mL刻度離心管中加入1mL的色素，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.8gPEG2000和不同質(zhì)量(1.0，1.5，2.0，2.5g)的(NH4)2SO4，用蒸餾水定容至10g，參比液為不含色素的雙水相溶液，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)步驟，在494nm的波長下測定吸光度值。當(dāng)鹽的質(zhì)量大于1g時，由于鹽效應(yīng)的影響，PEG相變渾濁且萃取率略有降低，當(dāng)質(zhì)量低于1g時，鹽的濃度過低，雙水相為渾濁溶液，不分層。所以選擇加入質(zhì)量為1.8g的PEG2000和質(zhì)量為1g的(NH4)2SO4形成的雙水相體系萃取率最高，故在下面的測定過程中選擇1g(NH4)2SO4作為測定標(biāo)準(zhǔn)。

　　2.4溫度對萃取效果的影響在PEG的質(zhì)量為1.8g、(NH4)2SO4的質(zhì)量為1g時，將10mL刻度離心管放入恒溫水浴鍋內(nèi)加熱10min，將每次的溫度分別設(shè)置為20，30，40，50，60℃，加熱10min后取出，參比液為不含色素的雙水相溶液，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟，在494nm的波長下測定吸光度值。隨著溫度的升高，色素能更好地溶于PEG相中，但當(dāng)溫度超過50℃時，PEG相與(NH4)2SO4互溶，出現(xiàn)不分層現(xiàn)象，當(dāng)溫度低于20℃時，雙水相的分層也不明顯，故溫度為30℃時萃取效果最佳。

　　2.5粗提取液體積對萃取效果的影響在10mL刻度離心管中加入1.8gPEG2000、1g(NH4)2SO4，再加入不同體積的粗提取液(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL)，加蒸餾水至10g，用不含色素體積的相同溶液做參比，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)步驟，在494nm的波長下測定吸光度值。隨著粗提取液的增加，萃取率先增加后減少，當(dāng)提取液的體積大于1.0mL時，雙水相萃取色素的體積有限，則沒被萃取的色素殘留在下層，所以萃取率降低。當(dāng)提取液的體積小于0.5mL時，雙水相上下層分離不明顯，原因是色素含量較低，所以粗提取液的體積為1.0mL時萃取率最高。

　　2.6提取條件的優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)采用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面的設(shè)計(jì)[16-18]。選取PEG2000的質(zhì)量、(NH4)2SO4的質(zhì)量、粗提取液的體積、加熱溫度，在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以萃取率為響應(yīng)值來設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。

　　農(nóng)學(xué)技術(shù)評職知識： 天然產(chǎn)物提取論文投稿的中文期刊

　　3結(jié)論

　　采用雙水相法萃取分離紅高粱色素，首先純化粗提取的紅高粱色素，制作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定回歸方程。然后確定494nm為其最大吸收波長，通過查閱資料確定雙水相體系的組成為PEG/(NH4)2SO4，考察PEG分子量、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水浴加熱溫度、粗提取液的體積對色素萃取率的影響，由此建立的多項(xiàng)回歸方程能較好地反映實(shí)際情況的萃取，得到最佳的萃取效果是：1.8g的PEG2000，1g的(NH4)2SO4，水浴加熱溫度為30℃，加入粗提取液1mL，加蒸餾水定量至10時，紅高粱色素的萃取效果最佳，為98.25%。

　　參考文獻(xiàn)：

　　[1]李竹英，毛紹春，戴榮珍，等.紅高粱色素的提取工藝及結(jié)構(gòu)的初步分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2010(17)：79-85

　　作者：張麗，劉娜，張彥青，張彥，曹利慧

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