本文摘要：摘要：基因編輯是一種能對生物體基因組特定目標基因進行修飾的一種基因工程技術。近年來，基因編輯技術不斷突破與發(fā)展，以CRISPR編輯系統(tǒng)為基礎的單堿基編輯和先導編輯引起了科研人員的關注，隨著基因編輯技術的不斷成熟，已成功應用到各種動、植物以及其他
摘要：基因編輯是一種能對生物體基因組特定目標基因進行修飾的一種基因工程技術。近年來，基因編輯技術不斷突破與發(fā)展，以CRISPR編輯系統(tǒng)為基礎的單堿基編輯和先導編輯引起了科研人員的關注，隨著基因編輯技術的不斷成熟，已成功應用到各種動、植物以及其他生物中，為基因治療和基因功能研究等方面提供了重要的技術支持。本文主要回顧了CRISPR/Cas技術、單堿基編輯技術以及最新開發(fā)的先導編輯三項技術的發(fā)展歷程及應用，并對未來在昆蟲中研究的發(fā)展和應用作進一步的展望。
關鍵詞：CRISPR/Cas;堿基編輯技術;先導編輯
昆蟲作為自然界中數(shù)量最多的生物，與農(nóng)林牧的生產(chǎn)息息相關，科學家們也在不斷地對其進行深入的研究，基因組信息是深入研究分子和遺傳機制以及進化過程的重要基礎。近年來越來越多的昆蟲基因組被測序。據(jù)統(tǒng)計，2018年12月底在NCBI數(shù)據(jù)庫中已有331個基因組完成組裝拼接[1]，截至2020年月日增至497種。隨著昆蟲基因組信息的日益完善，基因編輯技術的出現(xiàn)為昆蟲學的研究開辟了新思路，為昆蟲的基因功能研究提供了新的技術支持。經(jīng)典的基因組編輯工具包括zincfingernucleases(ZFNs)技術[2,3]和transcription activatorlikeeffectornucleases(TALENs)技術[46]，其已在果蠅Drosophila、家蠶Bombyxmori、蟋蟀Gryllulus等昆蟲的研究中獲得成功[711]。
昆蟲研究方向論文：寬帶全極化垂直昆蟲雷達設計及校準關鍵技術研究
隨后發(fā)現(xiàn)了由RNA指導Cas蛋白進行DNA識別及編輯的Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPRassociated(Cas)技術[12]，并廣泛應用于臨床試驗、動植物、細菌、真菌等研究領域[1319]。以上三種基因編輯技術作為功能基因組研究的重要工具在昆蟲的研究中已得到了應用[20,21]，為今后進行昆蟲功能基因組研究奠定了堅實的基礎。為了防止雙鏈斷裂(doublestrandbreak，DSB)引起的潛在危害，保證基因組的完整性，近年來，一系列無DSB的單堿基編輯工具——胞嘧啶堿基編輯器(cytosinebaseeditors，CBE)、腺嘌呤堿基編輯器(adeninebaseeditors，ABE)和先導編輯(primeediting)已經(jīng)在多種物種中被廣泛開發(fā)，并對其編輯技術的精確性及廣適性進行了驗證。
CRISPR/Cas系統(tǒng)CRISPR/Cas系統(tǒng)最初是由日本大阪大學(OsakaUniversity)于1987年在研究大腸桿菌EscherichiacoliK12體內(nèi)堿性磷酸同工酶的iap(AlkalinePhosphatase)基因的核苷酸序列時發(fā)現(xiàn)的，其中一段由重復短序列間隔排列組成的片段引起了研究者的注意[12]。2002年，Jansen等[22]將這段序列命名為clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)以此來反映這一簇有規(guī)則間隔的短回文重復序列的特征，并在研究中確定了四個CRISPR相關基因cas1、cas2、cas3和cas4，cas基因始終位于CRISPR位點附近，說明二者之間具有功能相關性。
研究證明，CRISPR基因座存在于大量細菌和古細菌中[2226]。根據(jù)Cas基因核心元件序列的多樣性，將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為兩類六型[27]：第一類是多亞基效應復合物，需要多個Cas蛋白相互作用[2829]，才能發(fā)揮CRISPR系統(tǒng)的作用，包括類型、類型III和類型IV，前兩種類型在古細菌中出現(xiàn)的頻率較高，類型IV較罕見。第二類是單蛋白效應器，該復合物由一個單一的、大的、多結構域的蛋白質(zhì)組成，CRISPR/Cas位點的組織結構更簡單、更統(tǒng)一，其類型包括類型II、類型、類型VI，該類系統(tǒng)中的Cas9、Cas12a(Cpf1)和Cas12b(C2c1)的靶向目標是DNA，Cas13a(C2c2)、Cas13b的靶向目標是RNA。
Cas9基因最早是在2007年噬菌體侵染嗜熱鏈球菌的實驗中發(fā)現(xiàn)的，研究發(fā)現(xiàn)該基因能很好的抵抗噬菌體的入侵，并證實了原核生物已進化出基于核酸的“免疫系統(tǒng)”，其特異性由CRISPR間隔區(qū)的含量決定，而抗性由Cas酶機制提供[30]，隨后CRISPR/Cas9系統(tǒng)便在動植物等的研究中被廣泛應用。在分子水平上，CRISPR的作用過程可以分為三個階段：整合新的間隔物到CRISPR陣列中，表達和處理CRISPRRNAs(crRNAs)，以及CRISPR干涉[31]。
第一階段，當外源質(zhì)粒入侵時，識別PAM(ProtospacerAdjacentmotif)序列，將protospacer與CRISPR間隔序列同源的噬菌體基因序列[32,33]插入到CRISPR位點從而來抵抗入侵的質(zhì)粒和噬菌體，進而使細胞快速適應環(huán)境中的入侵者，因此這個階段被稱為CRISPR功能的適應階段。其獲取間隔物的機制以及CRISPR如何識別噬菌體或質(zhì)粒DNA是入侵性的尚未明確。第二階段，一旦在CRISPR位點上建立了一個隔離子，它就為CRISPR通路的防御階段提供了特異性。這個過程的關鍵是由重復序列和間隔序列編碼的小crRNAs產(chǎn)生。
為了進行成功的防御，該CRISPR陣列被轉(zhuǎn)錄生成CRISPRRNA，該RNA作為向?qū)NA(gRNA)，用于識別與Cas蛋白結合的核糖核酸復合物中的互補外源DNA/RNA，從而降解靶標，阻止入侵。第三階段，在Cas蛋白復合復的參與下進行靶向和干擾入侵的噬菌體DNA序列[3437]。通過這樣的過程細胞成功抵御了噬菌體或質(zhì)粒的入侵。從2012年CRISPR/Cas9技術正式問世到現(xiàn)在，這一生物技術被廣泛應用到人體臨床試驗、動植物、細菌、真菌等的基因的研究上，解決了眾多科學問題。在對果蠅、家蠶、埃及伊蚊Aedesaegypti等昆蟲的研究中得到了充分應用[3847]。
通過在ATP依賴的結合盒轉(zhuǎn)運蛋白(白色)中產(chǎn)生一系列框移突變，證明了CRISPR/Cas介導的昆士蘭實蠅Bactroceratryoni眼色基因突變，產(chǎn)生經(jīng)典的白眼表型，為今后開發(fā)基因性菌株進行蟲害防治提供了可能[48]。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對棉鈴蟲Helicoverpazea基因組進行編輯，采用核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)復合物，將合成的gRNA與經(jīng)過核定位信號設計的純化Cas9核酸酶結合，從而實現(xiàn)對vermillion眼色基因的高效編輯，實驗結果顯示胚胎注射或4μMRNP復合物時突變率高，編輯效果更好[49]。
中國科學院上海植物生理學與生態(tài)研究所利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建了亞洲玉米螟OstriniafurnacalisArgonaute1(OfAgo1)突變體，揭示了OfAgo1在亞洲玉米螟角質(zhì)層色素沉著中的作用[50]。研究發(fā)現(xiàn)，以加勒比果蠅Anaststrephasuspensa為研究對象，首先以外源性轉(zhuǎn)基因多聚泛素調(diào)控的EGFP(polyubiquitinregulatedEGFP，PUbGFP)為靶點，通過注射Cas9蛋白，實現(xiàn)CRISPR/Cas9介導的基因編輯，使用單個sgRNA進行可遺傳的非同源末端連接(nonhomologousendjoining，NHEJ)敲除。
多個缺失突變，從到個核苷酸范圍內(nèi)接近目標位置，通過在轉(zhuǎn)基因果蠅中失去綠色熒光的表型鑒定，這些果蠅也被標記為紅色。類似的條件用于內(nèi)源性別決定基因Astransformer(Astra)，使用兩個sgRNAs針對獨立的外顯子序列671 bp分開。在G0成年果蠅中，根據(jù)雌雄間生殖形態(tài)學鑒定的體細胞突變頻率為81%[51]。
以CRISPR/Cas9為基礎，通過卵細胞靶向肽配體(BtKV)與Cas結合注射到煙粉虱Bemisiatabaci雌性成蟲卵黃中，可實現(xiàn)對后代基因進行有效且可遺傳的編輯，為今后煙粉虱等害蟲的防治提供了新的參考防治策略[52]。在不同昆蟲中建立CRISPR/Cas9系統(tǒng)，為蟲害管理提供了新的視角。2020年月，西南大學馬三垣和夏慶友團隊利用廣譜的piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，首次構建了適合于昆蟲的CRISPR文庫構建策略，并在家蠶細胞系中測試了其效果，結果顯示，測試的所有位點的敲除效率都達到了100%[53]。該研究為家蠶和其他昆蟲的相關研究和應用提供潛在的靶標，并實現(xiàn)了一系列生物與非生物脅迫的陽性篩選，推動了昆蟲基因編輯技術的研究和應用。
2堿基編輯系統(tǒng)
盡管CRISPR/Cas9技術迅猛發(fā)展，日益完善，但是傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要是通過gRNA的引導，使得Cas9蛋白結合到與gRNA互補配對的DNA鏈上，對目標基因進行切割形成DNA雙鏈斷裂(DSB)，誘發(fā)細胞內(nèi)非同源末端連接(nonhomologousendjoining，NHEJ)和同源重組(homologousrecombination，HR)[54,55]，從而完成對基因的編輯。在編輯的過程中NHEJ與HR存在競爭，NHEJ是一種有效地創(chuàng)制基因敲除突變體的途徑，其發(fā)生頻率較高，但修復方式不夠精確，常常在靶點處產(chǎn)生堿基的插入或缺失(insertions/deletions，indels);HR途徑是一種較為精確的修復方式，但效率非常低。因此在編輯的過程中往往達不到預期的基因修飾的目的，且不可避免的會對基因組造成損傷[5657]。
堿基編輯是基因組編輯的一種形式，它使一個堿基對在目標基因組位點上直接、不可逆的轉(zhuǎn)換為另一個堿基對，而不需要雙鏈DNA斷裂(DSBs)、同源定向修復(HDR)過程或供體DNA模板[58,59]。與引入點突變的基因組編輯方法相比，堿基編輯可以更有效地進行堿基的精準插入和刪除以及堿基之間的轉(zhuǎn)換。堿基編輯系統(tǒng)(Baseditor)的誕生在保護了基因組的完整性的基礎上提高了編輯效率和精準度，為基因修復提供了更加方便快捷的工具，有力推進了基因組編輯的進程。目前堿基編輯系統(tǒng)依據(jù)融合的不同堿基修飾酶分為兩類：一類是胞嘧啶堿基編輯器(cytosinebaseeditors，CBE)，另一類是腺嘌呤堿基編輯器(adeninebaseeditors，ABE)[60]。
3先導編輯(primeediting)
2019年11月，DavidR.Liu團隊在原有的基因編輯技術的基礎上開發(fā)了一種新型的基因編輯技術——先導編輯[115]，此項技術相比于同源性導向的修復，提高了編輯效率以及產(chǎn)品純度;相比于堿基編輯，具有互補性優(yōu)勢，實現(xiàn)了堿基之間的顛換;在已知的Cas脫靶位點上，提供了比Cas核酸酶更低的脫靶率。先導編輯技術大大擴展了基因組編輯的范圍和能力，原則上可以糾正大約89%的人類已知致病性基因變異。先導編輯主要的復合物包括Cas9酶(被修飾成僅切割DNA的一條鏈)、逆轉(zhuǎn)錄酶(以RNA為模板產(chǎn)生新的DNA鏈)，此外還需要一種特殊的gRNA——pegRNA(primeeditingguideRNA)，這種pegRNA不但能夠結合想要編輯的特定DNA區(qū)域，還會自帶“修改模板”，從而在精確編輯中發(fā)揮作用。
即pegRNA將編輯信號發(fā)送到靶標處，引導Cas9切割DNA的一條鏈;隨后反轉(zhuǎn)錄酶讀取RNA并將相應的堿基連接到被剪切的DNA鏈的末端，與此同時將編輯序列從pegRNA轉(zhuǎn)移到靶標DNA上;細胞中的核酸內(nèi)切酶切除舊的DNA片段，將新的堿基組合到基因組中;此時靶標位點只剩下一條已編輯的鏈和一條未編輯的鏈;為解決錯配問題，有利于已編輯過的DNA永久安裝，一個不同的gRNA指引Primeeditor去剪切未編輯的鏈;剪切產(chǎn)生的缺口提示細胞以編輯過的鏈為模板，重新生成新的鏈，最終完成編輯[116]。
4堿基編輯系統(tǒng)的發(fā)展前景
2017年堿基編輯技術被Science雜志評為全球時代年度科學突破之一，2020年美國科學院公布未來10年農(nóng)業(yè)發(fā)展的五大方向中的“突破性的基因組學和精準育種技術”是以基因編輯技術的發(fā)展應用作為核心技術導向，由此可見基因編輯系統(tǒng)的發(fā)展具有巨大的潛力。
隨著CRISPR/Cas技術、胞嘧啶堿基編輯技術、腺嘌呤堿基編輯技術、以及最近研發(fā)的先導編輯系統(tǒng)等基因編輯工具的不斷更新，編輯的范圍從原有的低精確度，到實現(xiàn)單堿基的轉(zhuǎn)換，再到可實現(xiàn)任意堿基之間的替換，不斷改進的過程，indels也不斷降低，讓我們更加的堅信在未來的基因治療、基因功能鑒定等方面會向著更加精準化、有效化的方向展開，并將其應用在動植物，尤其是昆蟲的防治中去。堿基編輯技術在昆蟲中應用，將為害蟲管理提供新的研究方向，以維持生態(tài)平衡為前提對有害生物等進行有效防控，減少對農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的不利影響，保證農(nóng)林牧等產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。
參考文獻
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作者：王曉迪，冀順霞，申曉娜，劉萬學，萬方浩，張桂芬，呂志創(chuàng)
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