本文摘要：摘要：基因編輯是一種能對(duì)生物體基因組特定目標(biāo)基因進(jìn)行修飾的一種基因工程技術(shù)。近年來，基因編輯技術(shù)不斷突破與發(fā)展，以CRISPR編輯系統(tǒng)為基礎(chǔ)的單堿基編輯和先導(dǎo)編輯引起了科研人員的關(guān)注，隨著基因編輯技術(shù)的不斷成熟，已成功應(yīng)用到各種動(dòng)、植物以及其他
摘要：基因編輯是一種能對(duì)生物體基因組特定目標(biāo)基因進(jìn)行修飾的一種基因工程技術(shù)。近年來，基因編輯技術(shù)不斷突破與發(fā)展，以CRISPR編輯系統(tǒng)為基礎(chǔ)的單堿基編輯和先導(dǎo)編輯引起了科研人員的關(guān)注，隨著基因編輯技術(shù)的不斷成熟，已成功應(yīng)用到各種動(dòng)、植物以及其他生物中，為基因治療和基因功能研究等方面提供了重要的技術(shù)支持。本文主要回顧了CRISPR/Cas技術(shù)、單堿基編輯技術(shù)以及最新開發(fā)的先導(dǎo)編輯三項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展歷程及應(yīng)用，并對(duì)未來在昆蟲中研究的發(fā)展和應(yīng)用作進(jìn)一步的展望。
關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas;堿基編輯技術(shù);先導(dǎo)編輯
昆蟲作為自然界中數(shù)量最多的生物，與農(nóng)林牧的生產(chǎn)息息相關(guān)，科學(xué)家們也在不斷地對(duì)其進(jìn)行深入的研究，基因組信息是深入研究分子和遺傳機(jī)制以及進(jìn)化過程的重要基礎(chǔ)。近年來越來越多的昆蟲基因組被測(cè)序。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年12月底在NCBI數(shù)據(jù)庫中已有331個(gè)基因組完成組裝拼接[1]，截至2020年月日增至497種。隨著昆蟲基因組信息的日益完善，基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)為昆蟲學(xué)的研究開辟了新思路，為昆蟲的基因功能研究提供了新的技術(shù)支持。經(jīng)典的基因組編輯工具包括zincfingernucleases(ZFNs)技術(shù)[2,3]和transcription activatorlikeeffectornucleases(TALENs)技術(shù)[46]，其已在果蠅Drosophila、家蠶Bombyxmori、蟋蟀Gryllulus等昆蟲的研究中獲得成功[711]。
昆蟲研究方向論文：寬帶全極化垂直昆蟲雷達(dá)設(shè)計(jì)及校準(zhǔn)關(guān)鍵技術(shù)研究
隨后發(fā)現(xiàn)了由RNA指導(dǎo)Cas蛋白進(jìn)行DNA識(shí)別及編輯的Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPRassociated(Cas)技術(shù)[12]，并廣泛應(yīng)用于臨床試驗(yàn)、動(dòng)植物、細(xì)菌、真菌等研究領(lǐng)域[1319]。以上三種基因編輯技術(shù)作為功能基因組研究的重要工具在昆蟲的研究中已得到了應(yīng)用[20,21]，為今后進(jìn)行昆蟲功能基因組研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。為了防止雙鏈斷裂(doublestrandbreak，DSB)引起的潛在危害，保證基因組的完整性，近年來，一系列無DSB的單堿基編輯工具——胞嘧啶堿基編輯器(cytosinebaseeditors，CBE)、腺嘌呤堿基編輯器(adeninebaseeditors，ABE)和先導(dǎo)編輯(primeediting)已經(jīng)在多種物種中被廣泛開發(fā)，并對(duì)其編輯技術(shù)的精確性及廣適性進(jìn)行了驗(yàn)證。
CRISPR/Cas系統(tǒng)CRISPR/Cas系統(tǒng)最初是由日本大阪大學(xué)(OsakaUniversity)于1987年在研究大腸桿菌EscherichiacoliK12體內(nèi)堿性磷酸同工酶的iap(AlkalinePhosphatase)基因的核苷酸序列時(shí)發(fā)現(xiàn)的，其中一段由重復(fù)短序列間隔排列組成的片段引起了研究者的注意[12]。2002年，Jansen等[22]將這段序列命名為clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)以此來反映這一簇有規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列的特征，并在研究中確定了四個(gè)CRISPR相關(guān)基因cas1、cas2、cas3和cas4，cas基因始終位于CRISPR位點(diǎn)附近，說明二者之間具有功能相關(guān)性。
研究證明，CRISPR基因座存在于大量細(xì)菌和古細(xì)菌中[2226]。根據(jù)Cas基因核心元件序列的多樣性，將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為兩類六型[27]：第一類是多亞基效應(yīng)復(fù)合物，需要多個(gè)Cas蛋白相互作用[2829]，才能發(fā)揮CRISPR系統(tǒng)的作用，包括類型、類型III和類型IV，前兩種類型在古細(xì)菌中出現(xiàn)的頻率較高，類型IV較罕見。第二類是單蛋白效應(yīng)器，該復(fù)合物由一個(gè)單一的、大的、多結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)組成，CRISPR/Cas位點(diǎn)的組織結(jié)構(gòu)更簡(jiǎn)單、更統(tǒng)一，其類型包括類型II、類型、類型VI，該類系統(tǒng)中的Cas9、Cas12a(Cpf1)和Cas12b(C2c1)的靶向目標(biāo)是DNA，Cas13a(C2c2)、Cas13b的靶向目標(biāo)是RNA。
Cas9基因最早是在2007年噬菌體侵染嗜熱鏈球菌的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的，研究發(fā)現(xiàn)該基因能很好的抵抗噬菌體的入侵，并證實(shí)了原核生物已進(jìn)化出基于核酸的“免疫系統(tǒng)”，其特異性由CRISPR間隔區(qū)的含量決定，而抗性由Cas酶機(jī)制提供[30]，隨后CRISPR/Cas9系統(tǒng)便在動(dòng)植物等的研究中被廣泛應(yīng)用。在分子水平上，CRISPR的作用過程可以分為三個(gè)階段：整合新的間隔物到CRISPR陣列中，表達(dá)和處理CRISPRRNAs(crRNAs)，以及CRISPR干涉[31]。
第一階段，當(dāng)外源質(zhì)粒入侵時(shí)，識(shí)別PAM(ProtospacerAdjacentmotif)序列，將protospacer與CRISPR間隔序列同源的噬菌體基因序列[32,33]插入到CRISPR位點(diǎn)從而來抵抗入侵的質(zhì)粒和噬菌體，進(jìn)而使細(xì)胞快速適應(yīng)環(huán)境中的入侵者，因此這個(gè)階段被稱為CRISPR功能的適應(yīng)階段。其獲取間隔物的機(jī)制以及CRISPR如何識(shí)別噬菌體或質(zhì)粒DNA是入侵性的尚未明確。第二階段，一旦在CRISPR位點(diǎn)上建立了一個(gè)隔離子，它就為CRISPR通路的防御階段提供了特異性。這個(gè)過程的關(guān)鍵是由重復(fù)序列和間隔序列編碼的小crRNAs產(chǎn)生。
為了進(jìn)行成功的防御，該CRISPR陣列被轉(zhuǎn)錄生成CRISPRRNA，該RNA作為向?qū)NA(gRNA)，用于識(shí)別與Cas蛋白結(jié)合的核糖核酸復(fù)合物中的互補(bǔ)外源DNA/RNA，從而降解靶標(biāo)，阻止入侵。第三階段，在Cas蛋白復(fù)合復(fù)的參與下進(jìn)行靶向和干擾入侵的噬菌體DNA序列[3437]。通過這樣的過程細(xì)胞成功抵御了噬菌體或質(zhì)粒的入侵。從2012年CRISPR/Cas9技術(shù)正式問世到現(xiàn)在，這一生物技術(shù)被廣泛應(yīng)用到人體臨床試驗(yàn)、動(dòng)植物、細(xì)菌、真菌等的基因的研究上，解決了眾多科學(xué)問題。在對(duì)果蠅、家蠶、埃及伊蚊Aedesaegypti等昆蟲的研究中得到了充分應(yīng)用[3847]。
通過在ATP依賴的結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(白色)中產(chǎn)生一系列框移突變，證明了CRISPR/Cas介導(dǎo)的昆士蘭實(shí)蠅Bactroceratryoni眼色基因突變，產(chǎn)生經(jīng)典的白眼表型，為今后開發(fā)基因性菌株進(jìn)行蟲害防治提供了可能[48]。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)棉鈴蟲Helicoverpazea基因組進(jìn)行編輯，采用核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)復(fù)合物，將合成的gRNA與經(jīng)過核定位信號(hào)設(shè)計(jì)的純化Cas9核酸酶結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)vermillion眼色基因的高效編輯，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示胚胎注射或4μMRNP復(fù)合物時(shí)突變率高，編輯效果更好[49]。
中國科學(xué)院上海植物生理學(xué)與生態(tài)研究所利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了亞洲玉米螟OstriniafurnacalisArgonaute1(OfAgo1)突變體，揭示了OfAgo1在亞洲玉米螟角質(zhì)層色素沉著中的作用[50]。研究發(fā)現(xiàn)，以加勒比果蠅Anaststrephasuspensa為研究對(duì)象，首先以外源性轉(zhuǎn)基因多聚泛素調(diào)控的EGFP(polyubiquitinregulatedEGFP，PUbGFP)為靶點(diǎn)，通過注射Cas9蛋白，實(shí)現(xiàn)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯，使用單個(gè)sgRNA進(jìn)行可遺傳的非同源末端連接(nonhomologousendjoining，NHEJ)敲除。
多個(gè)缺失突變，從到個(gè)核苷酸范圍內(nèi)接近目標(biāo)位置，通過在轉(zhuǎn)基因果蠅中失去綠色熒光的表型鑒定，這些果蠅也被標(biāo)記為紅色。類似的條件用于內(nèi)源性別決定基因Astransformer(Astra)，使用兩個(gè)sgRNAs針對(duì)獨(dú)立的外顯子序列671 bp分開。在G0成年果蠅中，根據(jù)雌雄間生殖形態(tài)學(xué)鑒定的體細(xì)胞突變頻率為81%[51]。
以CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)，通過卵細(xì)胞靶向肽配體(BtKV)與Cas結(jié)合注射到煙粉虱Bemisiatabaci雌性成蟲卵黃中，可實(shí)現(xiàn)對(duì)后代基因進(jìn)行有效且可遺傳的編輯，為今后煙粉虱等害蟲的防治提供了新的參考防治策略[52]。在不同昆蟲中建立CRISPR/Cas9系統(tǒng)，為蟲害管理提供了新的視角。2020年月，西南大學(xué)馬三垣和夏慶友團(tuán)隊(duì)利用廣譜的piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，首次構(gòu)建了適合于昆蟲的CRISPR文庫構(gòu)建策略，并在家蠶細(xì)胞系中測(cè)試了其效果，結(jié)果顯示，測(cè)試的所有位點(diǎn)的敲除效率都達(dá)到了100%[53]。該研究為家蠶和其他昆蟲的相關(guān)研究和應(yīng)用提供潛在的靶標(biāo)，并實(shí)現(xiàn)了一系列生物與非生物脅迫的陽性篩選，推動(dòng)了昆蟲基因編輯技術(shù)的研究和應(yīng)用。
2堿基編輯系統(tǒng)
盡管CRISPR/Cas9技術(shù)迅猛發(fā)展，日益完善，但是傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要是通過gRNA的引導(dǎo)，使得Cas9蛋白結(jié)合到與gRNA互補(bǔ)配對(duì)的DNA鏈上，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行切割形成DNA雙鏈斷裂(DSB)，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)非同源末端連接(nonhomologousendjoining，NHEJ)和同源重組(homologousrecombination，HR)[54,55]，從而完成對(duì)基因的編輯。在編輯的過程中NHEJ與HR存在競(jìng)爭(zhēng)，NHEJ是一種有效地創(chuàng)制基因敲除突變體的途徑，其發(fā)生頻率較高，但修復(fù)方式不夠精確，常常在靶點(diǎn)處產(chǎn)生堿基的插入或缺失(insertions/deletions，indels);HR途徑是一種較為精確的修復(fù)方式，但效率非常低。因此在編輯的過程中往往達(dá)不到預(yù)期的基因修飾的目的，且不可避免的會(huì)對(duì)基因組造成損傷[5657]。
堿基編輯是基因組編輯的一種形式，它使一個(gè)堿基對(duì)在目標(biāo)基因組位點(diǎn)上直接、不可逆的轉(zhuǎn)換為另一個(gè)堿基對(duì)，而不需要雙鏈DNA斷裂(DSBs)、同源定向修復(fù)(HDR)過程或供體DNA模板[58,59]。與引入點(diǎn)突變的基因組編輯方法相比，堿基編輯可以更有效地進(jìn)行堿基的精準(zhǔn)插入和刪除以及堿基之間的轉(zhuǎn)換。堿基編輯系統(tǒng)(Baseditor)的誕生在保護(hù)了基因組的完整性的基礎(chǔ)上提高了編輯效率和精準(zhǔn)度，為基因修復(fù)提供了更加方便快捷的工具，有力推進(jìn)了基因組編輯的進(jìn)程。目前堿基編輯系統(tǒng)依據(jù)融合的不同堿基修飾酶分為兩類：一類是胞嘧啶堿基編輯器(cytosinebaseeditors，CBE)，另一類是腺嘌呤堿基編輯器(adeninebaseeditors，ABE)[60]。
3先導(dǎo)編輯(primeediting)
2019年11月，DavidR.Liu團(tuán)隊(duì)在原有的基因編輯技術(shù)的基礎(chǔ)上開發(fā)了一種新型的基因編輯技術(shù)——先導(dǎo)編輯[115]，此項(xiàng)技術(shù)相比于同源性導(dǎo)向的修復(fù)，提高了編輯效率以及產(chǎn)品純度;相比于堿基編輯，具有互補(bǔ)性優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)了堿基之間的顛換;在已知的Cas脫靶位點(diǎn)上，提供了比Cas核酸酶更低的脫靶率。先導(dǎo)編輯技術(shù)大大擴(kuò)展了基因組編輯的范圍和能力，原則上可以糾正大約89%的人類已知致病性基因變異。先導(dǎo)編輯主要的復(fù)合物包括Cas9酶(被修飾成僅切割DNA的一條鏈)、逆轉(zhuǎn)錄酶(以RNA為模板產(chǎn)生新的DNA鏈)，此外還需要一種特殊的gRNA——pegRNA(primeeditingguideRNA)，這種pegRNA不但能夠結(jié)合想要編輯的特定DNA區(qū)域，還會(huì)自帶“修改模板”，從而在精確編輯中發(fā)揮作用。
即pegRNA將編輯信號(hào)發(fā)送到靶標(biāo)處，引導(dǎo)Cas9切割DNA的一條鏈;隨后反轉(zhuǎn)錄酶讀取RNA并將相應(yīng)的堿基連接到被剪切的DNA鏈的末端，與此同時(shí)將編輯序列從pegRNA轉(zhuǎn)移到靶標(biāo)DNA上;細(xì)胞中的核酸內(nèi)切酶切除舊的DNA片段，將新的堿基組合到基因組中;此時(shí)靶標(biāo)位點(diǎn)只剩下一條已編輯的鏈和一條未編輯的鏈;為解決錯(cuò)配問題，有利于已編輯過的DNA永久安裝，一個(gè)不同的gRNA指引Primeeditor去剪切未編輯的鏈;剪切產(chǎn)生的缺口提示細(xì)胞以編輯過的鏈為模板，重新生成新的鏈，最終完成編輯[116]。
4堿基編輯系統(tǒng)的發(fā)展前景
2017年堿基編輯技術(shù)被Science雜志評(píng)為全球時(shí)代年度科學(xué)突破之一，2020年美國科學(xué)院公布未來10年農(nóng)業(yè)發(fā)展的五大方向中的“突破性的基因組學(xué)和精準(zhǔn)育種技術(shù)”是以基因編輯技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用作為核心技術(shù)導(dǎo)向，由此可見基因編輯系統(tǒng)的發(fā)展具有巨大的潛力。
隨著CRISPR/Cas技術(shù)、胞嘧啶堿基編輯技術(shù)、腺嘌呤堿基編輯技術(shù)、以及最近研發(fā)的先導(dǎo)編輯系統(tǒng)等基因編輯工具的不斷更新，編輯的范圍從原有的低精確度，到實(shí)現(xiàn)單堿基的轉(zhuǎn)換，再到可實(shí)現(xiàn)任意堿基之間的替換，不斷改進(jìn)的過程，indels也不斷降低，讓我們更加的堅(jiān)信在未來的基因治療、基因功能鑒定等方面會(huì)向著更加精準(zhǔn)化、有效化的方向展開，并將其應(yīng)用在動(dòng)植物，尤其是昆蟲的防治中去。堿基編輯技術(shù)在昆蟲中應(yīng)用，將為害蟲管理提供新的研究方向，以維持生態(tài)平衡為前提對(duì)有害生物等進(jìn)行有效防控，減少對(duì)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的不利影響，保證農(nóng)林牧等產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。
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作者：王曉迪，冀順霞，申曉娜，劉萬學(xué)，萬方浩，張桂芬，呂志創(chuàng)
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