瓜菜花粉細(xì)胞學(xué)觀察及活力測(cè)定概述

　　摘 要： 植物的生長(zhǎng)發(fā)育從花粉發(fā)育開(kāi)始，對(duì)植物花粉細(xì)胞學(xué)的觀察與活力測(cè)定是研究雄配子發(fā)育的工作基礎(chǔ)�；ǚ鄣纳�長(zhǎng)發(fā)育關(guān)系到瓜菜類作物自身的生活發(fā)育，花粉的活力為花粉發(fā)育、植株受精提供了保障，花粉細(xì)胞學(xué)觀察為更好利用掌握花粉發(fā)育過(guò)程進(jìn)而研究花調(diào)控的分子機(jī)制做準(zhǔn)備。但影響花粉整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段的因素有很多，為準(zhǔn)確地判斷花粉活力以及花粉發(fā)育關(guān)系到植株育性、花芽分化、結(jié)實(shí)率、光周期等，進(jìn)一步影響到分子育種及農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益，因此對(duì)花粉進(jìn)行活力測(cè)定與細(xì)胞學(xué)觀察必不可少。筆者對(duì)葫蘆科植物花粉細(xì)胞學(xué)以及活力測(cè)定方法進(jìn)行了綜述，重點(diǎn)介紹了花粉細(xì)胞學(xué)以及活力測(cè)定的方法，對(duì)各種相應(yīng)的方法在蔬菜中的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)，并對(duì)觀察測(cè)定的應(yīng)用進(jìn)行了一定程度的展望。所介紹的觀察測(cè)定方法為更好地選出適合判斷西瓜、甜瓜、黃瓜等花粉活力及細(xì)胞學(xué)觀察的方法提供了一定的參考，以便于開(kāi)展授粉育種工作。

　　關(guān)鍵詞： 瓜菜作物; 花粉細(xì)胞學(xué)觀察; 花粉活力測(cè)定

　　現(xiàn)所知的植物種類近30萬(wàn)種，開(kāi)花植物比例較大，占據(jù)90%以上，其中我國(guó)栽培的蔬菜包括20多個(gè)科，其中葫蘆科為8大科之一，包括苦瓜、冬瓜、絲瓜、黃瓜、西瓜、南瓜、西葫蘆等，在中國(guó)蔬菜生產(chǎn)中占有重要到地位[1]。根據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)統(tǒng)計(jì)資料顯示，全國(guó)2015年蔬菜總產(chǎn)量比糧食總產(chǎn)量高1.64億t，占農(nóng)作物播種面積1/10，創(chuàng)造了占種植業(yè)近1/3的產(chǎn)值。在蔬菜作物中瓜菜類作物種植面積也在隨之增長(zhǎng)，其中西瓜的種植面積就占到73%[2]。瓜菜中花作為整個(gè)生活史中重要的器官，承載著信息遺傳，但具有一定的遺傳保守性，對(duì)花發(fā)育過(guò)程的研究關(guān)系到植物的生殖過(guò)程，進(jìn)一步關(guān)系到植物的經(jīng)濟(jì)效益。從花粉的綜合性狀、大小、萌發(fā)孔樣式以及外部紋絡(luò)來(lái)進(jìn)行比較，存在著巨大的差異性，種間差異要大于品種、類型間差異。花粉的發(fā)育伴隨著花的外部形態(tài)的改變，隨著開(kāi)花時(shí)間環(huán)境的不同，花粉的發(fā)育狀態(tài)以及活力情況也不相同。對(duì)花粉細(xì)胞學(xué)觀察及活力測(cè)定一方面能更好地掌握花的發(fā)育過(guò)程，另一方面為更好利用花的調(diào)控機(jī)制為育種奠定基礎(chǔ)和判斷作用。當(dāng)前，對(duì)花粉的細(xì)胞學(xué)觀察及花粉活力的測(cè)定雖說(shuō)在不斷地進(jìn)步，在花粉細(xì)胞學(xué)觀察方法方面，主要包括切片法、壓片法、電鏡檢測(cè)等方法，以及對(duì)花粉活力測(cè)定的直接授粉法、染色法、離體培養(yǎng)法等均在不同的作物中進(jìn)行應(yīng)用驗(yàn)證，但對(duì)細(xì)胞學(xué)觀察以及花粉活力測(cè)定在瓜菜中的運(yùn)用方法并沒(méi)有系統(tǒng)性地進(jìn)行總結(jié)對(duì)比，在各類瓜菜中根據(jù)不同的種類觀察方法效果也不盡相同。筆者通過(guò)對(duì)瓜菜中已經(jīng)運(yùn)用的觀察測(cè)定方法進(jìn)行了概述，以找到適合西瓜花粉細(xì)胞學(xué)觀察與活力測(cè)定的方法并加以運(yùn)用。

　　1 有花植物花粉發(fā)育及觀察

　　在高等植物中花粉大致可分為二細(xì)胞型和三細(xì)胞型2類，花粉的發(fā)育可分為3個(gè)階段，從小孢子發(fā)生期到雄配子體形成期到花粉成熟期，其中小孢子發(fā)生期即造孢細(xì)胞的分化和減數(shù)分裂過(guò)程，雄配子體形成期即自由小孢子減數(shù)分裂后的發(fā)育這一系列的過(guò)程是細(xì)胞學(xué)研究的重點(diǎn)，主要涉及到的具體發(fā)育過(guò)程大致如下：花藥發(fā)育初期，未分化的孢原細(xì)胞進(jìn)行平周分裂為外層的周緣細(xì)胞和內(nèi)層的造孢細(xì)胞。繼而周緣細(xì)胞分裂形成藥室內(nèi)壁、中層及絨氈層，與花藥表皮共同構(gòu)成花粉囊壁包圍造孢細(xì)胞及其衍生細(xì)胞。另一方面，在周緣細(xì)胞分裂的同時(shí)，初生造孢細(xì)胞經(jīng)多次有絲分裂產(chǎn)生花粉母細(xì)胞，再經(jīng)減數(shù)分裂形成四分體。在花粉發(fā)育過(guò)程中，絨氈層逐漸向外分泌胼胝質(zhì)酶，分解胼胝質(zhì)，使未成熟的4個(gè)小孢子互相分離，慢慢形成小孢子，然后小孢子進(jìn)行第一次不對(duì)稱有絲分裂，產(chǎn)生細(xì)胞核-營(yíng)養(yǎng)核和生殖核。小孢子發(fā)育到一定階段，生殖細(xì)胞逐漸進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)的細(xì)胞質(zhì)中，形成成熟花粉粒[3]。在花粉成熟之后伴隨著外界環(huán)境以及自身的生長(zhǎng)發(fā)育，花粉的活力也隨之變化，對(duì)花粉細(xì)胞發(fā)育以及活力測(cè)定的研究可更好地為生產(chǎn)與育種做準(zhǔn)備。這些過(guò)程相對(duì)獨(dú)立但彼此又緊密聯(lián)系，并受眾多基因的調(diào)控。對(duì)花粉發(fā)育時(shí)期的觀察結(jié)合細(xì)胞學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝學(xué)為進(jìn)一步探究花調(diào)控相關(guān)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

　　隨著科研技術(shù)的提高，對(duì)花粉發(fā)育時(shí)期的劃分也更加詳細(xì)。對(duì)花粉發(fā)育時(shí)期的劃分方法也在不斷的完善。針對(duì)不同作物，花粉發(fā)育時(shí)期以及活力情況也不相同。在1921年Belling提出植物染色體壓片技術(shù)后，壓片觀察已成為植物染色體研究中最廣泛應(yīng)用的常規(guī)技術(shù)。Sanders等[4]根據(jù)擬南芥花藥發(fā)育過(guò)程中發(fā)生的主要代謝物將花藥發(fā)育分14個(gè)時(shí)期。在對(duì)擬南芥的花粉結(jié)構(gòu)觀察分析中將花粉發(fā)育時(shí)期劃分為15個(gè)時(shí)期，并對(duì)發(fā)育過(guò)程中花粉母細(xì)胞至成熟花粉粒進(jìn)行了特別關(guān)注[5]。隨后在水稻中Jun-Ichi Itoh將花藥的發(fā)育時(shí)期劃分為8個(gè)時(shí)期，主要分為兩大類——花藥孢子體發(fā)育時(shí)期、雄配子體發(fā)育時(shí)期[6]。在煙草中根據(jù)代謝途徑將配子體發(fā)育劃分為8個(gè)時(shí)期，并進(jìn)行了相關(guān)代謝通路驗(yàn)證[7]。近年來(lái)，人們對(duì)花粉發(fā)育基本過(guò)程的認(rèn)識(shí)有了很大的提高，其中許多信息來(lái)自于對(duì)雄性不育突變體的詳細(xì)研究，主要包括擬南芥[8-9]、油菜[10]、棉花[11]、大白菜[12]等植物。

　　另一方面，花粉活力的測(cè)定方法根據(jù)每種作物的不同習(xí)性來(lái)選擇，現(xiàn)有的測(cè)定方法主要包括花粉人工培養(yǎng)法、染色法、授粉法[13]。1982年對(duì)小麥的花粉采用TTC染色法進(jìn)行了活力測(cè)定以判斷花粉敗育及生理突變情況[14]。隨后在檢測(cè)甜椒貯藏花粉活力比較中采用熒光鏡檢新鮮花粉和紅四氮唑染色鏡檢貯藏花粉得到了不同溫度下花粉活力的變化情況[15]。胡適宜[16]對(duì)測(cè)定花粉生活力的經(jīng)典方法——離體萌發(fā)測(cè)定的方法及步驟進(jìn)行了詳細(xì)的介紹總結(jié)。除此之外，1994年在煙草中采用了TTC法、聯(lián)苯胺-α萘酚染色法、I-KI染色法3種方法對(duì)煙草花粉活力進(jìn)行測(cè)定，并與發(fā)芽率進(jìn)行了結(jié)合，系統(tǒng)地比較了3種染色法結(jié)果的差異性。整體來(lái)說(shuō)I-KI染色法的差異性較大。但在染色方法上明顯已經(jīng)有了進(jìn)一步的探究[17]。隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，在Randolph首次發(fā)現(xiàn)單倍體后，人們開(kāi)始對(duì)單倍體進(jìn)行研究，在這個(gè)過(guò)程中涉及到花藥、花粉的培養(yǎng)，確保培養(yǎng)的前提在于花粉具有一定的活性，2001在大田作物玉米中為進(jìn)行單倍體育種采用Sangduen N等[18]的0.5%稀醋酸洋紅染色方法進(jìn)行判斷，以染色為全紅的花粉粒判定為活性花粉用于單倍體加倍鑒定以獲得純合二倍體。隨后王欽麗等[19]分別比較了胡適宜的TTC測(cè)定法、p-苯二胺測(cè)定法的優(yōu)缺點(diǎn)。在模式植物擬南芥的花粉研究應(yīng)用中除了采用常用的TTC染色法之外，還用到了較為簡(jiǎn)便的Aexander染色法，其判斷花粉活力主要根據(jù)染液中的孔雀石綠對(duì)細(xì)胞壁的著色和酸性品紅與花粉原生質(zhì)著色深淺情況[20]。除了普通的染液染色觀察，熒光染色顯微觀察技術(shù)也在不斷發(fā)展應(yīng)用，對(duì)活力的測(cè)定運(yùn)用最多的是熒光素二醋酸酯(FDA)，在洋蔥、番茄等已成功多次運(yùn)用�；ǚ刍盍Φ臏y(cè)定方法經(jīng)常多種方法相互結(jié)合對(duì)比使用，以判斷出最適宜某種植物的方法。通過(guò)概述現(xiàn)已有的花粉活力的測(cè)定方法，對(duì)測(cè)定西瓜花粉活力的方法應(yīng)用有一定借鑒意義，對(duì)西瓜生產(chǎn)、選育等方面有一定的輔助作用。

　　2 瓜類作物花粉細(xì)胞發(fā)育及活力測(cè)定

　　在植物花的發(fā)育階段中可分為3個(gè)階段：成花誘導(dǎo)、形成花原基、花器官的形成及其發(fā)育。這3個(gè)發(fā)育階段按照花發(fā)育的分子生物學(xué)模型包含ABC模型、ABCDE模型。在最初的ABC模型中3個(gè)功能區(qū)域控制相關(guān)組織的產(chǎn)生，A類基因單獨(dú)控制萼片發(fā)育，A類和B類基因共同調(diào)控花瓣發(fā)育，B類和C類基因控制雄蕊的發(fā)育，C類基因單獨(dú)控制心皮的發(fā)育。之后在矮牽牛、擬南芥中發(fā)現(xiàn)了D功能基因控制胚珠發(fā)育，而E功能基因并不直接轉(zhuǎn)換花器官，而是一類特殊基因參與�；�因控制花器官形成過(guò)程中包含細(xì)胞的分化，在花芽分化的過(guò)程中，分化順序?yàn)榛ㄔ�基、萼片、花瓣、雌蕊原基、雄蕊原�?個(gè)時(shí)期[21]。在成花誘導(dǎo)的過(guò)程中與光照和溫度等因素密切相關(guān)，在外界環(huán)境合適的情況下伴隨著減數(shù)分裂、有絲分裂而發(fā)育。在花粉的形成發(fā)育過(guò)程中，從孢原細(xì)胞分化形成造孢細(xì)胞經(jīng)有絲分裂形成花粉母細(xì)胞，經(jīng)減數(shù)分裂形成四分體，四分體分離形成單核花粉，每個(gè)單核花粉發(fā)育伴隨著細(xì)胞核的運(yùn)動(dòng)，劃分為單核早期、單核中期、單核靠邊期，細(xì)胞核經(jīng)有絲分裂形成雙核(營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞核、生殖細(xì)胞核)最后發(fā)育形成成熟花粉粒。

　　2.1 瓜類作物花粉的細(xì)胞發(fā)育過(guò)程

　　在葫蘆科作物花粉發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞發(fā)育與其表觀性狀緊密相連。其花粉發(fā)育途徑為：小孢子母細(xì)胞-四分體時(shí)期-單核早期-單核中期-單核靠邊期-雙核早期-雙核中期-雙核晚期-三核期-成熟花粉時(shí)期。在花粉由花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂，胼胝質(zhì)包圍4個(gè)小孢子形成四分體，在不同時(shí)期下小孢子形狀也不相同。四分體從胼胝質(zhì)壁破裂釋放出外形不規(guī)則的小孢子，之后很快變成圓形或近圓形的單核花粉粒，隨著單核花粉粒的發(fā)育進(jìn)行有絲分裂形成1個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和1個(gè)生殖細(xì)胞的雙核花粉粒，雙核花粉粒發(fā)育到一定階段，生殖細(xì)胞進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)中形成成熟花粉粒。在對(duì)花粉發(fā)育時(shí)期的研究中多采用細(xì)胞鏡檢的方式進(jìn)行觀察研究，同時(shí)與植物外部形態(tài)進(jìn)行聯(lián)系。

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