亮腹釉小蜂產品的質量標準

　　摘要：本文對工廠化生產的亮腹釉小蜂Tamarixiaradiate(Waterston)成蟲產品進行了一系列檢測，檢測物種形態(tài)及分子特征、外觀(體色暗淡率、殘肢殘翅率)、產品數(shù)量、雌蜂率、寄生率及不同溫度下(15℃、25℃及30℃)亮腹釉小蜂貯存死亡率共7個質量指標，并根據(jù)檢測結果提出了亮腹釉小蜂產品的質量標準。結果表明，亮腹釉小蜂規(guī)模化生產的產品應符合以下標準：形態(tài)特征吻合，分子序列(COI、ITS1和ITS2)相似度≥97%，體色暗淡率≤2%、殘肢殘翅率≤1%、實際數(shù)量占標識數(shù)量的比率≥95%、雌蜂率≥70%、不同溫度下貯存死亡率均≤5%、寄生率≥90%。本標準各項指標的準確性和專屬性強、靈敏度高，具有較高可行性，可用于亮腹釉小蜂質量控制和質量管理。

　　關鍵詞：亮腹釉小蜂;質量標準;工廠化生產;產品

　　柑橘木虱DiaphorinacitriKuwayama是柑橘類植物的重要害蟲之一，也是柑橘毀滅性病害——柑橘黃龍病最主要的的傳播媒介，因此防控柑橘木虱是柑橘產業(yè)的關鍵舉措。亮腹釉小蜂Tamarixiaradiate(Waterston)是柑橘木虱的優(yōu)勢寄生蜂，常寄生柑橘木虱4～5齡的若蟲[1,2]。一頭亮腹釉小蜂通過取食和寄生的方式可殺滅柑橘木虱若蟲多達500頭。研究表明[3]，柑橘園釋放亮腹釉小蜂可有效控制柑橘木虱，在美國得克薩斯州，大量釋放亮腹釉小蜂可使柑橘木虱種群數(shù)量降低91.2%[4]。

　　目前，亮腹釉小蜂已被世界各地的柑橘種植區(qū)引入，用于防控柑橘木虱[57]，并在巴西[8]、墨西哥[9]、美國加利福尼亞州[10]、得克薩斯州[4]和佛羅里達州等地[11]實現(xiàn)工廠化生產。在中國，廣東省科學院動物研究所于2020年實現(xiàn)規(guī)�；�生產[12]。然而，不同地區(qū)生產的亮腹釉小蜂對柑橘木虱的寄生效率有明顯差異。在美國佛羅里達州，亮腹釉小蜂在春夏季寄生率相對較低，平均寄生率<20%，而在秋季平均寄生率可達60%以上[5];在巴西，寄生率為43.3%～88.8%[8];在墨西哥西部，平均寄生率達60.58%[14]。這可能受釋放地溫度、濕度等環(huán)境因素影響，也與亮腹釉小蜂的質量相關。尤其是同一釋放地區(qū)寄生率的大幅度波動，極可能與寄生蜂質量有直接關系。

　　因此，建立亮腹釉小蜂質量評價標準，對其生產和應用有重要意義。建立亮腹釉小蜂質量評價標準，首先要保證產品的純度，在形態(tài)特征和分子數(shù)據(jù)方面確認物種。研究表明，亮腹釉小蜂的寄生能力與其活動能力、發(fā)育狀態(tài)、個體大小及性別比例等因素息息相關[8]。體色光鮮、健全的亮腹釉小蜂才能有效寄生柑橘木虱，殘肢或殘翅的雌蜂存活困難，無法進行寄生活動。亮腹釉小蜂營兩性生殖，僅雌性可以寄生，雄性本身并無寄生能力。因此，維持較高水平的雌性比例(雌蜂率)，才能保證亮腹釉小蜂對柑橘木虱的防控效果。亮腹釉小蜂在20℃左右貯存3d，仍能保持較高的存活率和寄生能力，但在高溫條件下其死亡率大大升高[8]。

　　生產上獲得亮腹釉小蜂產品后，需盡快將其轉移至氣候箱保存，并盡快運送至田間釋放。但在實際生產中往往需要一定時間，檢測天敵產品短時間內不同溫度下的存活能力可反映產品質量。寄生能力是亮腹釉小蜂產品質量好壞最直接的表現(xiàn)。前人研究表明，亮腹釉小蜂在不同地區(qū)對柑橘木虱的寄生能力有明顯的差異，在菲律賓，田間的寄生率為15%～67%[7];在中國臺灣，寄生率為30%～87%[6];在美國，田間寄生率可高達91.2%[4];對亮腹釉小蜂產品的寄生能力進行檢測極有必要。

　　因此，本文選定亮腹釉小蜂的形態(tài)特征、分子特征、外觀(體色暗淡率和殘肢殘翅率)、包裝數(shù)量、雌蜂率、寄生率及不同貯存溫度條件下寄生蜂死亡率(15℃、25℃及30℃)共7個項目作為質量評價指標，以廣東省科學院動物研究所生產的亮腹釉小蜂為測試對象進行質量檢測，根據(jù)檢測結果建立和制定亮腹釉小蜂成蟲的產品質量標準。

　　1材料與方法

　　1.1寄主植物與供試蟲源

　　年橘CitrusreticuiataBlancocv.Nianju購自廣州，種植于廣州農業(yè)技術推廣中心溫室，室內陽光充足，定期澆水施肥，及時修剪，保證充足的嫩梢嫩枝供試驗使用。柑橘木虱種群采自廣東省科學院動物研究所實驗室，以年橘為植物載體飼養(yǎng)于網(wǎng)室內作為試驗用蟲。亮腹釉小蜂為廣東省科學院動物研究所生產產品，成蟲，每瓶200頭左右(瓶身標識：每瓶含亮腹釉小蜂200頭)。

　　1.2儀器設備

　　PCR儀(廣州市昊洋貿易有限公司)、DYY6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)、XW80A旋渦混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、MSHOT體視顯微鏡MZ62(廣州市明美光電技術有限公司)、恒溫恒濕培養(yǎng)箱(天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠)、60目防蟲袋、吸蟲器(湖北廣之應科技有限公司)

　　1.3物種形態(tài)特征

　　物種形態(tài)特征是物種種類鑒定的基礎。對亮腹釉小蜂產品質量進行評價首先應進行形態(tài)鑒定，保證物種形態(tài)特征與前人描述[8,15]相吻合。本文隨機選擇5瓶亮腹釉小蜂，每瓶取其中10頭(5頭雌、5頭雄)進行物種形態(tài)鑒定。

　　1.4物種分子特征

　　近年來利用基因序列對物種進行鑒定的方法得到廣泛的推廣和使用。目前在GeneBank上已能查到亮腹釉小蜂的多個基因序列特征，本文根據(jù)Folmer等[14]和Barr等[15]的試驗方法，分別利用細胞色素氧化酶I(cytochromeoxidasesubunitI，COI)的保守區(qū)域和內轉錄間隔區(qū)1、2(internaltranscribedspacer，ITS1、ITS2)進行物種分子鑒定。隨機抽樣選擇5瓶亮腹釉小蜂，每瓶取其中1頭進行總DNA的提取，試劑盒選用天根生物血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)，試驗步驟嚴格遵循試劑盒說明。

　　PCR反應使用50µL體系，DNA模板2µL，引物各0.5µmol/L，25µLMix(2XSanTaqPCRMix預混液，含藍染料，生工生物B532061)，用無菌水補足。反應條件：預變性94℃(5min)→變性94℃(30s)→退火50～60℃(30s)→延伸72℃(30～60s/kb)→延伸72℃(10min)→保存4℃(∞)，其中第2步變性至第4步延伸重復35個循環(huán)。

　　1.5雌蜂體色及殘疾檢測

　　利用體式顯微鏡觀察亮腹釉小蜂是否體色暗淡，是否殘翅殘肢。隨機選擇10瓶亮腹釉小蜂，每兩瓶為1個樣本，從兩瓶中取200頭雌性亮腹釉小蜂測試，記錄體色暗淡或出現(xiàn)殘翅殘肢的雌蜂數(shù)量，并分別統(tǒng)計體色暗淡和殘肢殘翅個體數(shù)量占總數(shù)的比率(體色暗淡率和殘肢殘翅率)，共檢測5次。

　　1.6數(shù)量檢測隨機選擇5瓶亮腹釉小蜂進行手動計數(shù)，記錄每瓶中亮腹釉小蜂的實際數(shù)量，計算每瓶亮腹釉小蜂數(shù)量占包裝瓶標識數(shù)量(200頭/瓶)的比率，每瓶為一個樣本，共檢測5個樣本。

　　1.7雌蜂率檢測本文隨機選擇5瓶亮腹釉小蜂，記錄其雌蜂數(shù)量，統(tǒng)計雌蜂率，重復5次。

　　1.8不同溫度下亮腹釉小蜂貯存死亡率檢測隨機選擇15瓶亮腹釉小蜂并分成3組，每瓶取100頭;將各組亮腹釉小蜂分別置于溫度15℃(低溫)、25℃(常溫)、30℃(高溫)，相對濕度50%～70%、光周期14L:10D的人工氣候箱中處理10h;記錄亮腹釉小蜂的死亡數(shù)量，統(tǒng)計死亡率。

　　1.9寄生率檢測

　　準備帶有嫩稍的年橘，選取合適位置套15cm×15cm的60目防蟲袋，在其中轉入100頭4齡末柑橘木虱若蟲。從1瓶亮腹釉小蜂產品中隨機選取10頭雌蟲轉入上述防蟲袋中，24h后移除亮腹釉小蜂。7～9d后檢查統(tǒng)計被寄生的柑橘木虱數(shù)量，統(tǒng)計寄生率。以上試驗在26℃，相對濕度為60%，光周期14L:10D的條件下進行，重復5次。

　　2結果與分析

　　2.1物種形態(tài)特征

　　(1)雌蜂

　　體長0.92～1.04mm，大部分黑褐色，復眼和單眼紅褐色，頭寬于長，上顎2齒及1截齒，下顎須和下唇須各1節(jié)。觸角8節(jié)(觸角式1，1，3，3)，具1小環(huán)狀節(jié);柄節(jié)長為寬的3.7倍;梗節(jié)等長或稍長于第1索節(jié);第1～3索節(jié)長比分別為11:10:9，分別具4～7個刺狀感覺器;棒節(jié)3節(jié)，末端具針狀突出，各棒節(jié)分別具7～11個刺狀感覺器。觸角基節(jié)暗褐色，柄節(jié)淺色，背緣暗色，其余各節(jié)暗黃色。中胸盾中葉近側緣具2對毛，小盾片亞中線外緣具2對毛，盤狀感覺器靠近前1對毛;并胸腹節(jié)褶不完整，具不規(guī)則的網(wǎng)狀紋。

　　翅透明，前翅長為寬的2.3倍;亞緣脈端部呈折斷痕，亞緣脈具1根剛毛，端部下方具2～3根毛;前緣室基部具1～2根細毛，端部具3～4根細毛;緣脈具7～9根剛毛。足跗節(jié)4−4−4，足淺黃色，基節(jié)和跗節(jié)末端暗褐色。腹部腹板黃色，第1～4節(jié)背板或第1～5節(jié)背中央大部分黃色，呈大黃色斑。第3產卵瓣暗褐色，產卵器從腹部第2腹節(jié)伸出，稍突出腹末端，產卵器為中足脛節(jié)長的1.6倍，第3產卵瓣為產卵器長0.2倍。

　　(2)雄蜂：體色與形態(tài)相似于雌蟲，體長0.84～1.05mm。觸角9節(jié)(觸角式1，1，4，3);柄節(jié)基向近2/5～1/2處具1小長圓形感覺區(qū);索節(jié)4節(jié)，各節(jié)分別具1排6～7根長剛毛;第1棒節(jié)1排剛毛稍短，棒節(jié)末端具針狀突出。腹部第1～2節(jié)背板中央大部分暗黃色，邊緣黑褐色，呈小暗黃色斑;腹部第1～3腹板大部分暗黃色，其余腹板黑褐色。雄性外生殖器長，從腹部第4腹節(jié)基部伸出，指狀突端部暗褐色。

　　2.2物種分子特征

　　亮腹釉小蜂分子鑒定結果顯示，目的基因COI、ITS1和ITS2在NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformationSearchdatabase)數(shù)據(jù)庫中比對的種內相似度均較高：COI的種內相似度為98.5%～100.0%，而與數(shù)據(jù)庫中同屬的其他種間相似度不高于94.0%;ITS1種內相似度最低為97.9%，而與同屬的其他種相似度僅為82.0%;ITS2種內相似度為99.0%～100.0%，種間相似度小于82.7%。因此本標準規(guī)定，COI、ITS1和ITS2相似度應高于97%，則認為該種為亮腹釉小蜂。

　　2.3雌蜂外觀檢測結果

　　在5次亮腹釉小蜂雌蜂外觀檢測中，亮腹釉小蜂體色暗淡率最高為1.5%，亮腹釉小蜂殘肢殘翅率的比率最高為0.4%。本文根據(jù)檢測結果并結合生產實際，規(guī)定亮腹釉小蜂產品中的雌性亮腹釉小蜂體色暗淡率不高于2.0%、殘肢殘翅率不高于1.0%。

　　2.4數(shù)量檢測結果

　　隨機抽取5瓶亮腹釉小蜂產品，其數(shù)量占標識的比率最低為99.0%。根據(jù)檢測結果結合生產實際，本文規(guī)定產品包裝中亮腹釉小蜂的數(shù)量比率不低于標識數(shù)量的95.0%。

　　2.5雌蜂率檢測結果

　　在5次檢測中，雌蜂率最低為71.0%。所以，本文規(guī)定產品質量標準中的雌蜂率不低于70.0%。

　　2.6不同溫度下亮腹釉小蜂貯存死亡率檢測結果

　　天敵產品的耐貯存能力是決定天敵能否進行規(guī)�；�生產和作為商品進行運輸?shù)臎Q定性條件之一。亮腹釉小蜂在不同貯存條件下的死亡率反應其抗逆能力和對環(huán)境的適應能力，是保證亮腹釉小蜂能夠有效寄生的指標之一，也是亮腹釉小蜂質量指標一種重要參數(shù)。

　　由于缺乏文獻和標準參考，本標準根據(jù)預試驗結果，將亮腹釉小蜂在不同溫度條件下貯存10h后，記錄其死亡率。檢測結果，15℃低溫貯存死亡率最高為3.0%，25℃常溫貯存死亡率最高為2.0%，30℃高溫貯存死亡率最高為4.0%。 根據(jù)檢測結果，規(guī)定產品質量標準中不同溫度下亮腹釉小蜂貯存死亡率均不得高于5.0%。

　　2.7寄生率檢測結果本次檢測結果發(fā)現(xiàn)，隨機抽取的亮腹釉小蜂寄生率最低為92.0%，最高可達到100.0%(表3)。因此，本質量標準規(guī)定，亮腹釉小蜂產品在實驗室條件下寄生率不低于90%。檢測結果用于質量評價指標，不能用于田間標準評價。

　　3討論

　　迄今為止，國際上巴西等國實現(xiàn)了亮腹釉小蜂的工廠化生產，在國內2020年廣東省科學院動物研究所實現(xiàn)了規(guī)�；�生產[813]，而并無有關亮腹釉小蜂的質量標準的研究。本文首次確定了亮腹釉小蜂成蟲質量的檢測項目和檢測指標，檢測項目包括檢測物種形態(tài)及分子特征、外觀(體色暗淡率、殘肢殘翅率)、產品數(shù)量、雌蜂率、寄生率及不同溫度下(15℃、25℃及30℃)亮腹釉小蜂貯存死亡率共7個質量指標。通過檢測廣東省科學院動物研究所生產的亮腹釉小蜂各項指標，首次確立了指標參數(shù)，制定了亮腹釉小蜂成蟲的質量標準。

　　在物種分子特征檢測上，常用細胞色素氧化酶I(cytochromeoxidasesubunitI，COI)的保守區(qū)域、內轉錄間隔區(qū)1、2(internaltranscribedspacer，ITS1、ITS2)，本文做的這兩種檢測都是可以用于質量技術檢測，在生產實際中只需選擇其中一種即可;而簡單重復間序列(Intersimplesequencerepeat，ISSR)電泳條帶特征[16]進行物種分子檢測時，由于不易操作，所以不作為物種分子特征檢測的方法。

　　在不同溫度下貯存寄生蜂死亡率檢測上，目前采用15℃(低溫)、25℃(常溫)及30℃(高溫)3種溫度，將亮腹釉小蜂分別置于這3種溫度下處理10h后進行檢測。對于在變溫條件下貯存不同時間寄生蜂死亡率的檢測方法，暫無可行的方法，還有待研究。利用本標準檢測評價廣東省科學院動物研究所寄生蜂天敵工廠生產出來的亮腹釉小蜂成蟲[17]，結果表明該標準檢測方法合理，可操作性強。

　　參考文獻

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　　作者：陳玲玲1,2，黃承志,2，毛潤乾2，修寶林2，高晶2，葉鳳嫻2，MubasherHussain2，邱棟梁1，申寶營1，王朝紅2*

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