生物技術(shù)論文歐盟轉(zhuǎn)基因生物安全檢測(cè)技術(shù)

　　由于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)既是保障轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)準(zhǔn)確可靠的基本前提，也是轉(zhuǎn)基因檢測(cè)工作的核心。因此，本篇生物技術(shù)論文建議加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制，研發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)和方法研究的發(fā)展，為我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管和安全評(píng)價(jià)提供更好的物質(zhì)保障�！�生物技術(shù)》(曾用刊名：生物與特產(chǎn))，1991年創(chuàng)刊，是涉及生物工程、生物技術(shù)、微生物學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域的綜合性學(xué)術(shù)刊物，報(bào)道我國(guó)生物技術(shù)研究開(kāi)發(fā)及生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的重要成果和國(guó)內(nèi)外生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)進(jìn)展。

　　摘要：為了了解歐盟轉(zhuǎn)基因生物安全檢測(cè)技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀，提高我國(guó)轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)管水平。本研究根據(jù)對(duì)歐盟8家轉(zhuǎn)基因檢測(cè)相關(guān)機(jī)構(gòu)現(xiàn)狀的調(diào)查和分析結(jié)果，闡述了轉(zhuǎn)基因檢測(cè)過(guò)程中的關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)及歐盟的實(shí)施情況，具體包括抽樣與制樣方法，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法的循環(huán)驗(yàn)證與參數(shù)要求，樣品的檢測(cè)策略與實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求，以及檢測(cè)結(jié)果的表述與不確定度評(píng)估。并結(jié)合我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全檢測(cè)發(fā)展現(xiàn)狀，提出了開(kāi)展檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合驗(yàn)證和加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因定量PCR檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用的建議。

　　關(guān)鍵詞：歐盟;轉(zhuǎn)基因生物;檢測(cè)技術(shù)

　　隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的興起和快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性問(wèn)題逐漸成為國(guó)際社會(huì)普遍關(guān)注的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)[1，2]。為促進(jìn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，保障消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)，世界上許多國(guó)家和地區(qū)頒布了相關(guān)的轉(zhuǎn)基因生物安全管理與標(biāo)識(shí)制度[3-5]。其中，歐盟是世界上轉(zhuǎn)基因生物安全管理與標(biāo)識(shí)管理制度較為嚴(yán)格和完善的地區(qū)，也是第一個(gè)提出進(jìn)行閾值管理的地區(qū)[6]。為了給轉(zhuǎn)基因生物安全管理與標(biāo)識(shí)制度提供技術(shù)支撐，歐盟花費(fèi)龐大人力、物力和財(cái)力進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)研究。構(gòu)建了完善的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法循環(huán)研制實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)和轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制機(jī)構(gòu)[7，8]。在歐洲，執(zhí)行轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的機(jī)構(gòu)組成了歐洲轉(zhuǎn)基因檢測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室(EuropeanNetworkofGMOLaboratories，ENGL)。ENGL除了進(jìn)行日常檢測(cè)，還對(duì)歐盟設(shè)置在歐盟聯(lián)合研究中心(JointResearchCentre，JRC)下屬健康與消費(fèi)者保護(hù)研究所(InstituteforHealthandConsumerProtection，IHCP)的歐盟轉(zhuǎn)基因食物與飼料基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室(EuropeanUnionReferenceLaboratoryforGMFood&Feed，EURL-GMFF)研制和提供的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證[9，10]。

　　目前國(guó)際上研制的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和發(fā)布的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法有一半以上來(lái)自歐盟，因此有必要對(duì)歐盟的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行分析研究。根據(jù)在歐盟聯(lián)合研究中心健康及消費(fèi)者保護(hù)研究所下屬歐盟轉(zhuǎn)基因食品和飼料基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室、意大利拉齊奧大區(qū)和托斯卡納大區(qū)動(dòng)物預(yù)防性實(shí)驗(yàn)研究院下屬轉(zhuǎn)基因檢測(cè)國(guó)家基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室、翁布里亞區(qū)食品科技園(3A-PTA)內(nèi)第三方食品安全檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室(Analysis)、洛迪省Tavazzano種子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室等8家轉(zhuǎn)基因檢測(cè)相關(guān)機(jī)構(gòu)(實(shí)驗(yàn)室)和單位進(jìn)行的調(diào)研和考察，本文重點(diǎn)闡述了轉(zhuǎn)基因檢測(cè)過(guò)程中的關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)以及歐盟的實(shí)施情況。并結(jié)合我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全檢測(cè)發(fā)展現(xiàn)狀提出相應(yīng)建議，旨為我國(guó)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供參考。

　　1抽樣與制樣

　　抽樣是轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的第一個(gè)環(huán)節(jié)，也是非常復(fù)雜和重要的環(huán)節(jié)。抽樣要有代表性，要能準(zhǔn)確反映出樣品的總體情況[11]。歐盟國(guó)家轉(zhuǎn)基因安全管理主要遵循預(yù)防原則，與我國(guó)采取的源頭控制理念類似。以意大利為例，目前意大利尚未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化種植，在轉(zhuǎn)基因生物監(jiān)控計(jì)劃實(shí)施過(guò)程中，邊境檢查站、國(guó)家憲兵隊(duì)和地區(qū)衛(wèi)生部門(mén)等執(zhí)法機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)抽樣工作，樣品主要來(lái)自進(jìn)口等環(huán)節(jié);農(nóng)業(yè)部執(zhí)法機(jī)構(gòu)抽檢樣品則主要來(lái)源于種子企業(yè)的種子庫(kù)，基本不對(duì)市場(chǎng)上銷售的產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)。因此，意大利轉(zhuǎn)基因檢測(cè)抽樣主要是針對(duì)批次貨物，不涉及田間種植樣品。

　　在典型情況下，歐盟國(guó)家執(zhí)法機(jī)構(gòu)的抽樣工作參照《Rec.2004/787/ECTechnicalguidanceforsampl-inganddetectionofGMOs》進(jìn)行[12]，可以對(duì)多至109粒的樣品進(jìn)行抽樣。多個(gè)取樣點(diǎn)至少可以獲得105粒種子，將多個(gè)取樣點(diǎn)的樣品混勻，從中取出3份各3000粒種子交給轉(zhuǎn)基因檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)。轉(zhuǎn)基因檢測(cè)機(jī)構(gòu)將其中一份3000粒種子粉碎，取少量(至少包含105個(gè)粉碎的顆粒)粉末提取DNA，用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)(批次樣品量大小及其組成，見(jiàn)表1)。通過(guò)了國(guó)際種子協(xié)會(huì)(InternationalSeedTestingAssociation，ISTA)認(rèn)證的檢測(cè)機(jī)構(gòu)，在收樣時(shí)遵從ISTA規(guī)范的規(guī)定，每份檢測(cè)樣品至少含有3000粒種子。種子檢測(cè)機(jī)構(gòu)一般將樣品分為5份，并研磨其中2份用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，因此，總收樣量至少15000粒。在我國(guó)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)工作中，種子類樣品一般至少檢測(cè)3000粒。對(duì)比來(lái)看，我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)和歐盟的規(guī)范均能在95%的置信度下保證0.1%的檢測(cè)靈敏度，我國(guó)做法是符合國(guó)際規(guī)范的。

　　在計(jì)算種子數(shù)量方面，Tavazzano種子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的做法有自己的特色，在我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)中，規(guī)定了不同作物種子的千粒重，而Tavazzano種子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室采用了實(shí)測(cè)的值。在現(xiàn)實(shí)情況中，相同作物不同品種種子千粒重可能有翻番的差別，因此采取一個(gè)固定值有較大誤差。在可能情況下，在相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定和修訂時(shí)應(yīng)考慮這個(gè)因素。歐盟從事轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)也采用了經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OrganizationforEconomicCo-operationandDevelopment，OECD)的標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)了良好實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范(GoodLaboratoryPractice，GLP)認(rèn)證，與政府實(shí)驗(yàn)室類似，其樣品也來(lái)源于委托方送樣，并僅對(duì)來(lái)樣負(fù)責(zé)。

　　2轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法的認(rèn)定

　　轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化是獲得準(zhǔn)確可靠、具有可比性檢測(cè)結(jié)果的基礎(chǔ)[13]。JRC下屬歐盟轉(zhuǎn)基因檢測(cè)基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的主要任務(wù)是為歐盟的立法提供技術(shù)支持，工作的重點(diǎn)在檢測(cè)方法的研究和驗(yàn)證上，不從事一般的日常檢測(cè)工作。依據(jù)歐盟法規(guī)，申請(qǐng)?jiān)跉W洲釋放的轉(zhuǎn)基因生物，需要通過(guò)某一成員國(guó)主管當(dāng)局申請(qǐng)。成員國(guó)主管當(dāng)局在確認(rèn)收到申請(qǐng)的同時(shí)，應(yīng)在90d內(nèi)作成一份評(píng)估報(bào)告。若同意申請(qǐng)，成員國(guó)主管當(dāng)局應(yīng)盡快將評(píng)估報(bào)告和相關(guān)的信息發(fā)送給歐盟委員會(huì)和其他歐盟成員國(guó)。歐盟委員委托歐盟食品安全局(EuropeanFoodSafetyAuthority，EFSA)在醫(yī)學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)、毒理學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)和其他相關(guān)學(xué)科方面的專家進(jìn)行評(píng)估。如果歐盟食品安全局和其他歐盟成員國(guó)沒(méi)有提出反對(duì)意見(jiàn)，則應(yīng)以書(shū)面形式批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因生物投放市場(chǎng)。與此同時(shí)，申請(qǐng)者需向歐盟轉(zhuǎn)基因檢測(cè)基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室(或稱參考實(shí)驗(yàn)室)提交檢測(cè)方法和對(duì)照材料，由歐盟參考實(shí)驗(yàn)室組織12家歐盟實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)成員，對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行循環(huán)驗(yàn)證。檢測(cè)方法達(dá)到歐盟相關(guān)法規(guī)要求的，方可依據(jù)安全評(píng)價(jià)結(jié)果，給予授權(quán)。歐盟轉(zhuǎn)基因生物授權(quán)程序，見(jiàn)圖1。

　　由于歐盟要求對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識(shí)，并設(shè)置了標(biāo)識(shí)閾值，因此提交給歐盟參考實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)分析方法均為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，依據(jù)歐盟對(duì)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)分析方法最低性能要求的定義，歐盟對(duì)檢測(cè)方法認(rèn)定分為兩個(gè)階段，第一階段為申請(qǐng)者提交方法文本的檢查，第二階段為檢測(cè)方法的循環(huán)驗(yàn)證。在第一階段，主要考察申請(qǐng)者提交檢測(cè)方法的如下性能特性：(1)適用性;(2)可操作性;(3)特異性;(4)動(dòng)態(tài)范圍，即檢測(cè)的精確性和準(zhǔn)確性在線性范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)基因成分濃度區(qū)間;(5)準(zhǔn)確性，±25%范圍內(nèi);(6)擴(kuò)增效率，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率在-3.6至-3.1之間;(7)相關(guān)系數(shù)，R2≥0.98;(8)重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差，線性范圍內(nèi)RSDr<25%;(9)定量極限，RSDr<25%前提下小于法規(guī)要求的標(biāo)識(shí)閾值0.9%的1/10，即0.09%或50拷貝;(10)檢測(cè)極限，在95%置信度下，小于法規(guī)要求的標(biāo)識(shí)閾值的1/20，即0.045%;(11)穩(wěn)健性，即可以忍受檢測(cè)實(shí)驗(yàn)條件的小的變化，在此變化下檢測(cè)結(jié)果偏差不會(huì)超過(guò)±30%。在第二階段，主要通過(guò)多實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合測(cè)試，確保申請(qǐng)者所提交方法符合歐盟要求，并且在不同實(shí)驗(yàn)室有同樣性能表現(xiàn)。考察的主要指標(biāo)為動(dòng)態(tài)范圍、再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差和準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合驗(yàn)證中，在精確度方面，所有濃度樣品的RSDr均應(yīng)低于35%。當(dāng)濃度小于0.2%時(shí)，RSDr在小于50%的范圍內(nèi)都是可以接受的。在準(zhǔn)確度方面，所有濃度樣品的偏差不得超過(guò)±30%。

　　3樣品檢測(cè)

　　歐盟轉(zhuǎn)基因檢測(cè)機(jī)構(gòu)無(wú)論采用何種技術(shù)規(guī)范，參加何種體系的認(rèn)證，出具的定性或定量報(bào)告，基本都采用熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)。與常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR顯著減少了實(shí)驗(yàn)室PCR產(chǎn)物污染的可能性。這是因?yàn)镻CR產(chǎn)物是轉(zhuǎn)基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室最主要的污染來(lái)源之一，而熒光定量PCR不需要電泳，因此反應(yīng)結(jié)束后不需要開(kāi)蓋，避免了反應(yīng)產(chǎn)物泄漏造成的污染。此外，與常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR具有檢測(cè)靈敏度更高、檢測(cè)速度更快的優(yōu)點(diǎn)。在意大利轉(zhuǎn)基因檢測(cè)國(guó)家基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室定性判斷也是基于熒光定量PCR的結(jié)果進(jìn)行，這種做法減少了實(shí)驗(yàn)室污染，提高了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。因此，我國(guó)應(yīng)在制定和修訂的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)考慮增加采用熒光定量PCR檢測(cè)的內(nèi)容。

　　EURL-GMFF是歐盟主要轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法的研制機(jī)構(gòu)之一，核心檢測(cè)室都有獨(dú)立的溫度、濕度和氣壓控制系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的氣壓分為+20mbar、+10mbar、0mbar、-10mbar及-20mbar等5個(gè)等級(jí)，EURL-GMFF采用的不僅是簡(jiǎn)單的正負(fù)壓控制，還根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求的潔凈程度和污染程度的不同進(jìn)行了細(xì)分。氣壓的多級(jí)控制事實(shí)上形成了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的連續(xù)穩(wěn)定氣流方向，進(jìn)一步提高了實(shí)驗(yàn)室潔凈程度，從而保證了歐洲基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室方法研究和評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性，這一點(diǎn)值得我國(guó)未來(lái)的基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室參考。除了擁有實(shí)驗(yàn)室正負(fù)壓控制系統(tǒng)外，歐洲基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室大量使用了100%外排生物安全柜。同時(shí)，所有的PCR準(zhǔn)備工作都在生物安全柜等專門(mén)的隔離的設(shè)施設(shè)備內(nèi)進(jìn)行。

　　成本增加不多，但極大減少了污染的可能性。意大利轉(zhuǎn)基因檢測(cè)國(guó)家基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室雖然面積緊張，但仍然采用了DNA自動(dòng)提取設(shè)備，自動(dòng)分液機(jī)械臂，高通量自動(dòng)進(jìn)樣熒光定量PCR儀等高端設(shè)備，以減少人員的操作誤差和提高工作效率，這是未來(lái)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)工作的發(fā)展方向之一，值得國(guó)內(nèi)跟蹤。根據(jù)意大利轉(zhuǎn)基因檢測(cè)國(guó)家基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室介紹，其在DNA提取過(guò)程中除了使用傳統(tǒng)的CTAB法，也采取了3種不同的商品化試劑盒。由于利用不同方法從不同原料中提取DNA的效率不同，因此在定量時(shí)必須采用與標(biāo)準(zhǔn)相同的DNA提取方法。歐洲基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室公布的方法均是基于CTAB的方法，特別是IRMM提供標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在質(zhì)量百分比換算到拷貝數(shù)百分比時(shí)需要一個(gè)矯正系數(shù)，這個(gè)系數(shù)的獲得與CTAB法的提取效率相關(guān)聯(lián)[14，15]。如果實(shí)驗(yàn)室貿(mào)然使用了非標(biāo)準(zhǔn)方法，而沒(méi)有考慮以上這些因素，可能造成較大的定量誤差。非標(biāo)準(zhǔn)方法的使用不僅在政府檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中存在，而且在企業(yè)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)機(jī)構(gòu)也同樣存在，如意大利的一些第三方食品安全檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室等在樣品量大時(shí)為了加快檢測(cè)速度，使用了快速熒光定量PCR技術(shù)。歐洲基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室公布的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法都公開(kāi)發(fā)布在網(wǎng)站并不斷更新(http://gmo-crl.jr-c.ec.europa.eu/StatusOfDossiers.aspx)。

　　如果成員國(guó)在檢測(cè)過(guò)程中需要使用的方法歐洲基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有公布，則該國(guó)可以組織驗(yàn)證，并由該國(guó)國(guó)家基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)布。在突發(fā)事件的檢測(cè)中，立法機(jī)構(gòu)可以臨時(shí)發(fā)布新的檢測(cè)方法，并直接授權(quán)檢測(cè)機(jī)構(gòu)采用。這一點(diǎn)與我國(guó)做法類似，但具有更高的靈活性。理論上轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)可分為通用元件篩查、目標(biāo)基因檢測(cè)、載體特異性檢測(cè)和轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)4個(gè)水平。但絕大多數(shù)檢測(cè)機(jī)構(gòu)均只進(jìn)行通用元件篩查和轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)，而且以上檢測(cè)均是以通用元件篩查為基礎(chǔ)，在通用元件篩查結(jié)果呈陽(yáng)性的基礎(chǔ)上，再根據(jù)通用元件的信息進(jìn)行所有可能的轉(zhuǎn)化事件的檢測(cè)，如果篩查結(jié)果均為陰性，則不再進(jìn)行事件特異性檢測(cè)。檢測(cè)流程如圖2所示。從以上分析可知，通用元件篩查的結(jié)果是歐盟轉(zhuǎn)基因檢測(cè)機(jī)構(gòu)判斷樣品是否含轉(zhuǎn)基因成分的關(guān)鍵。

　　同時(shí)，不同機(jī)構(gòu)篩查的轉(zhuǎn)基因元件有所不同，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)國(guó)家基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室篩查的元件最多，共篩查CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、PAT基因、NPTII基因和CP4-EPSPS等5個(gè)元件，而Tavazzano種子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室僅檢測(cè)CaMV35S啟動(dòng)子，選檢NOS終止子。根據(jù)公開(kāi)信息可知，這種策略有較大的漏檢風(fēng)險(xiǎn)。在歐盟采用的定量標(biāo)識(shí)中，如果采用相對(duì)定量PCR技術(shù)，僅能標(biāo)識(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線最高和最低濃度范圍內(nèi)的含量，如采用5%的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，連續(xù)稀釋至0.1%，那么僅能給出5%-0.1%范圍內(nèi)的值。超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)的測(cè)定值僅能標(biāo)識(shí)為>5%，低于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的測(cè)定值僅能標(biāo)識(shí)為<0.1%。在沒(méi)有擴(kuò)增信號(hào)的情況下，結(jié)果表述為

　　4結(jié)果的表述和不確定度

　　任何定量的結(jié)果，均應(yīng)提供測(cè)定值及測(cè)定值的不確定度，轉(zhuǎn)基因含量的定量也不例外[16]。不確定度的計(jì)算大體可以分為Bottomup和Topdown兩種方式，分別適用于不確定度來(lái)源清晰、可分別測(cè)量的工作和來(lái)源復(fù)雜不可分拆的情況。在歐盟轉(zhuǎn)基因檢測(cè)工作中，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制事實(shí)上采用的是Bottomup方式，分別測(cè)定各測(cè)量、加工步驟產(chǎn)生的不確定度，并最終合成到總的不確定度中。而轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法的不確定度的來(lái)源則非常復(fù)雜，包括了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度、不同儀器設(shè)備產(chǎn)生的不確定度、不同試劑產(chǎn)生的不確定度，不同操作人員引起的不確定度等(圖3)。這些不確定度有些來(lái)源于系統(tǒng)誤差，有些則是隨機(jī)因素引起。在系統(tǒng)誤差難以測(cè)量的情況下，可以將所有的不確定度當(dāng)作隨機(jī)誤差引起的B類不確定度進(jìn)行計(jì)算。JRC在《GuidancedocumentonmeasurementuncertaintyforGMOtestinglaboratories》中推薦了兩種轉(zhuǎn)基因檢測(cè)不確定度測(cè)定方法[17]，分別適合單個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部確定和利用檢測(cè)方法循環(huán)驗(yàn)證數(shù)據(jù)測(cè)定。

　　在采用沒(méi)有多家實(shí)驗(yàn)室循環(huán)驗(yàn)證數(shù)據(jù)的方法的情況下，可以由單一實(shí)驗(yàn)室的歷史數(shù)據(jù)來(lái)確定該實(shí)驗(yàn)室采用該方法的不確定度。但由于歐盟基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室公布的方法均經(jīng)過(guò)多家實(shí)驗(yàn)室的循環(huán)驗(yàn)證，代表了該方法在一般實(shí)驗(yàn)室使用的情況，并公布了包括檢測(cè)方法在各實(shí)驗(yàn)室使用結(jié)果的驗(yàn)證報(bào)告，因此可以直接計(jì)算出該方法在一般轉(zhuǎn)基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室使用的不確定度。多數(shù)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室選擇了利用循環(huán)驗(yàn)證報(bào)告直接計(jì)算本實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的不確定度。事實(shí)上，參照《GuidancedocumentonmeasurementuncertaintyforGMOtestinglaboratories》還可以利用檢測(cè)方法的驗(yàn)證報(bào)告計(jì)算該檢測(cè)方法的LOD和LOQ。

　　因此，這個(gè)指南解決了轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)的主要數(shù)據(jù)處理問(wèn)題。置信區(qū)間事實(shí)上是根據(jù)t分布計(jì)算的。根據(jù)《GuidancedocumentonmeasurementuncertaintyforGMOtestinglaboratories》可知，在擴(kuò)展系數(shù)取2時(shí)，利用這種方法測(cè)定的不確定度事實(shí)上是測(cè)定值的雙尾95%置信區(qū)間。這個(gè)計(jì)算方法本身并沒(méi)有問(wèn)題。但當(dāng)該區(qū)間的下限超過(guò)0.9%時(shí)，實(shí)際上是有97.5%的概率大于0.9%的歐盟標(biāo)識(shí)閾值，這種做法實(shí)際上比法律要求的更高，歐盟的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室工作人員實(shí)際上也承認(rèn)這個(gè)缺陷，但由于這個(gè)方法來(lái)源于歐盟推薦的文獻(xiàn)，因此他們必須采用。我國(guó)將來(lái)如采用定量檢測(cè)和標(biāo)識(shí)，應(yīng)重新考慮這個(gè)問(wèn)題。

　　5對(duì)我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全檢測(cè)的啟示和建議

　　5.1建立我國(guó)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)室循環(huán)驗(yàn)證制度

　　科學(xué)、有效的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法是轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管的重要前提和基礎(chǔ)。歐盟在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品授權(quán)程序中，突出強(qiáng)調(diào)檢測(cè)方法的審查與循環(huán)驗(yàn)證，制定了專門(mén)的文件對(duì)檢測(cè)方法性能要求、認(rèn)定及驗(yàn)證程序進(jìn)行規(guī)定，并將檢測(cè)方法是否符合歐盟監(jiān)管要求作為是否給予授權(quán)的必要條件。我國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因生物實(shí)施全程監(jiān)管并要求對(duì)列入標(biāo)識(shí)目錄的進(jìn)行標(biāo)識(shí)，檢測(cè)方法是我國(guó)安全監(jiān)管和標(biāo)識(shí)制度實(shí)施的基礎(chǔ)。目前，我國(guó)對(duì)于申請(qǐng)安全評(píng)價(jià)的轉(zhuǎn)基因生物沒(méi)有明確法規(guī)要求研發(fā)機(jī)構(gòu)提供陽(yáng)性樣品，對(duì)其提供的檢測(cè)方法，僅進(jìn)行文字材料審查。這些無(wú)法保證提供的方法滿足我國(guó)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)機(jī)構(gòu)的使用和安全監(jiān)管需求。建議將提供陽(yáng)性樣品和檢測(cè)方法作為申報(bào)安全證書(shū)的必要條件，并開(kāi)展提供的檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)室循環(huán)驗(yàn)證。

　　5.2提高我國(guó)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)能力建設(shè)水平

　　通過(guò)幾年來(lái)的建設(shè)，我國(guó)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)體系基本完善，技術(shù)水平也有了很大提高，但與歐盟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室及化學(xué)類檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室相比較，整體自動(dòng)化水平還比較低，檢測(cè)通量還很小，檢測(cè)成本偏高。因此有必要參考?xì)W盟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的發(fā)展經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)一步提高我國(guó)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)能力水平，同時(shí)加快推薦配套的標(biāo)準(zhǔn)體系和管理體系的建設(shè)。我國(guó)目前尚未設(shè)置轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)閾值，現(xiàn)今生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，零閾值的定性標(biāo)識(shí)導(dǎo)致實(shí)際操作困難。

　　因此，有必要參考?xì)W盟經(jīng)驗(yàn)及考慮我國(guó)的具體情況調(diào)整標(biāo)識(shí)制度。同時(shí)對(duì)各檢測(cè)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)能力和水平進(jìn)行進(jìn)一步提升，大力加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)支撐體系建設(shè)。在檢測(cè)技術(shù)方面，我國(guó)主要采用定性PCR檢測(cè)方法，此方法具有對(duì)設(shè)備技術(shù)要求簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管中發(fā)揮了重要作用，但隨著檢測(cè)技術(shù)水平和監(jiān)管要求的提高，其不足之處也有所體現(xiàn)。一是與普遍采用定量檢測(cè)方法的歐盟等國(guó)家或地區(qū)檢測(cè)結(jié)果無(wú)法比較、互認(rèn)，不利于貿(mào)易爭(zhēng)端的解決;二是進(jìn)行凝膠電泳增加了檢測(cè)步驟，易產(chǎn)生氣溶膠污染;三是在檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確性方面與定量PCR有差距。另外，我國(guó)大部分檢測(cè)機(jī)構(gòu)都配備了定量PCR儀，掌握了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)操作技術(shù)。因此，建議推進(jìn)定量PCR在我國(guó)檢測(cè)機(jī)構(gòu)中的應(yīng)用并逐步替代定性PCR，推進(jìn)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)與國(guó)際接軌。

轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明來(lái)自發(fā)表學(xué)術(shù)論文網(wǎng)：http:///jjlw/14319.html