組織透明化技術(shù)的研究與應(yīng)用

　　摘要背景：對生物體進(jìn)行全身細(xì)胞分析是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的主要挑戰(zhàn)之一。組織透明技術(shù)結(jié)合光學(xué)成像和圖像處理技術(shù)，能夠?qū)⒄麄�器官或全身快速透明并進(jìn)行結(jié)構(gòu)和細(xì)胞分析，為在生命科學(xué)中應(yīng)用先進(jìn)的光學(xué)技術(shù)提供了一個非常有前景的解決方案。目的：分析組織透明技術(shù)原理及過程，總結(jié)組織透明技術(shù)研究進(jìn)展，介紹組織透明成像技術(shù)，討論組織透明技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。方法：第一作者以“tissueclearingtechnique，tissueopticalclearing，whole-bodyimaging，3Dimaging”為關(guān)鍵詞，檢索PubMed數(shù)據(jù)庫發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，初檢文獻(xiàn)168篇，系統(tǒng)整理、篩選后，對納入的72篇文獻(xiàn)進(jìn)行分析、總結(jié)和討論。

　　結(jié)果與結(jié)論：目前組織透明技術(shù)主要分為兩類，有機溶劑透明技術(shù)和親水性試劑透明技術(shù)，組織透明步驟包括：①組織固定;②透化作用;③脫色作用;④折光率匹配。組織透明技術(shù)能夠使組織快速光學(xué)透明，顯著提高成像深度和圖像對比度，結(jié)合顯微成像技術(shù)如共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡和光片顯微鏡等，能夠在單細(xì)胞水平實現(xiàn)全身或全器官的高分辨率三維成像，加速了生物體全身細(xì)胞分析進(jìn)程。未來，組織透明技術(shù)將會持續(xù)發(fā)展，并將推動新型透化試劑和透化專用顯微鏡的研發(fā)，從而加強從完整機體系統(tǒng)獲取結(jié)構(gòu)和分子信息，有助于對完整生物系統(tǒng)的綜合理解。

　　關(guān)鍵詞：組織透明技術(shù);三維成像;全身細(xì)胞分析;光散射;折射率匹配;顯微成像技術(shù)

　　0引言

　　Introduction從復(fù)雜的生物體中提取詳細(xì)的結(jié)構(gòu)和分子信息，同時保留理解系統(tǒng)功能所需要的全局視角是疾病研究的關(guān)鍵，也是生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的根本性挑戰(zhàn)。通過對完整生物機進(jìn)行全面系統(tǒng)的分析，可以獲取諸多有價值的結(jié)構(gòu)相關(guān)信息，對于腫瘤及神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的治療及發(fā)病機制的研究極為重要。計算機斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)、正電子發(fā)射斷層掃描(PET)和近紅外成像等先進(jìn)成像技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，揭示了活體動物的解剖結(jié)構(gòu)，但是由于缺乏高對比度的細(xì)胞標(biāo)記工具，這些成像技術(shù)無法實現(xiàn)單細(xì)胞的特性分析。傳統(tǒng)組織學(xué)技術(shù)能對固定組織中的細(xì)胞進(jìn)行空間表型分析，但需要進(jìn)行組織連續(xù)切片和圖像重建，費時費力，并且在圖像重建過程中容易出現(xiàn)結(jié)構(gòu)信息丟失[1-2]。

　　全自動切片技術(shù)的發(fā)展極大程度地節(jié)省了人力和時間，目前結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)，已成功繪制出嚙齒類動物大腦結(jié)構(gòu)圖[3]。但是這種精細(xì)的結(jié)構(gòu)重建通常只適用于體積較小的組織。雙光子顯微鏡的發(fā)明打破了傳統(tǒng)顯微鏡成像深度為100μm的限制[4]，使組織成像深度增加至幾毫米[5]，但是生物組織的高度不透明性限制了這些技術(shù)的應(yīng)用，隨著光向深層組織的傳播，成像分辨率和對比度也會隨之降低，因此仍然無法實現(xiàn)較大組織或器官的完整三維像。減少生物組織的光散射和光吸收是增強光學(xué)成像深度的有效解決方案[6]，White利用育種技術(shù)制作出一條透明的成年斑馬魚，該模型已經(jīng)被用于實時研究癌癥的病理變化和發(fā)展[7]，但這種方法不適用于人類或其他動物的研究。

　　近年來組織透明技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了生物體三維成像的進(jìn)程，組織透明化技術(shù)是通過對樣本進(jìn)行固定、透化、折光率匹配等處理，使組織變得光學(xué)透明，降低樣本的光散射和光吸收，從而增加成像深度及對比度[8]。在保持組織結(jié)構(gòu)完整前提下，組織透明技術(shù)能實現(xiàn)細(xì)胞水平的三維成像，避免了空間結(jié)構(gòu)信息的丟失，因此組織透明技術(shù)是打開光學(xué)顯微鏡潛能的關(guān)鍵技術(shù)，也是繪制全器官或全身細(xì)胞圖譜的最佳選擇方案之一。文章目的在于綜述近年來組織透明技術(shù)的研究進(jìn)展，介紹組織透明技術(shù)與顯微成像技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，討論組織透明技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)展及研究意義。

　　1資料和方法Dataandmethods

　　1.1資料來源

　　第一作者利用PubMed數(shù)據(jù)庫，以“tissueclearingtechnique，tissueopticalclearing，whole-bodyimaging,3Dimaging”為關(guān)鍵詞，檢索1914年至2019年發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，初檢文獻(xiàn)168篇。

　　1.2納入標(biāo)準(zhǔn)納入與組織透明技術(shù)及應(yīng)用相關(guān)的外文文獻(xiàn)，包括研究原著、綜述、論著等。

　　1.3排除標(biāo)準(zhǔn)重復(fù)性研究。

　　1.4數(shù)據(jù)提取PubMed數(shù)據(jù)庫初檢文獻(xiàn)116篇，閱讀題目、摘要進(jìn)行初篩，閱讀全文進(jìn)行二次篩選，最終保留文獻(xiàn)72篇。

　　1.5質(zhì)量評估

　　最終保留的72篇文獻(xiàn)，符合納入標(biāo)準(zhǔn)，適合用于后續(xù)分析、總結(jié)。

　　2結(jié)果Results

　　2.1組織透明技術(shù)原理及過程

　　生物組織的不透明性是由不同光學(xué)特性的非均質(zhì)成分造成的，如折射率(RI)和光吸收率，大多數(shù)生物組織由高折射率的散射粒子，如脂質(zhì)、蛋白、髓鞘，彈性纖維，以及低折射率的周圍介質(zhì)，如細(xì)胞間質(zhì)液和細(xì)胞質(zhì)共同組成的。由于每種成分具有不同的折射率，這種非均質(zhì)物質(zhì)結(jié)構(gòu)會使入射光發(fā)生散射，限制了光學(xué)成像深度[9]。此外，內(nèi)源性色素如血紅素、核黃素、黑色素和脂褐素的光吸收也會使光傳播衰減[10]。因此改變組織非均質(zhì)成分的光學(xué)特性，降低光散射和光吸收是增加組織成像深度的關(guān)鍵。

　　1個世紀(jì)前，SPALTEHOLZ[11]首次引入3D組織標(biāo)本的透明原理，在此研究基礎(chǔ)上，GENINA等[12]將組織浸入光學(xué)透明劑中平衡折射率，使組織變得更加透明，進(jìn)一步增加了成像深度。隨著光學(xué)顯微鏡的發(fā)展和普及，以及數(shù)據(jù)采集和存儲技術(shù)的進(jìn)步，組織透明技術(shù)使全器官甚至全身成像成為可能，近年來研究人員開發(fā)出一系列組織透明技術(shù)，所有透明技術(shù)都致力于平衡組織折射率，以減少光散射的不均一性。

　　組織透明技術(shù)過程：盡管目前存在大量的組織透明技術(shù)，但它們主要包括以下2-4個步驟[13]：①組織固定;②透化處理;③脫色;④折光率匹配。組織固定是組織透明過程中保存目的蛋白和分子的關(guān)鍵步驟，常用的固定方案包括多聚甲醛PFA固定，水凝膠包埋，戊二醛固定等。透化作用是促進(jìn)高折射率介質(zhì)向深層組織滲透的重要環(huán)節(jié)，目前常用透化試劑包括三類：①水溶性有機溶劑;②高水化試劑;③脫脂試劑。脫色是實現(xiàn)全器官透明的必要步驟，因為內(nèi)源性色素會衰減光的傳播，干擾觀察。折射率匹配是利用高折射率介質(zhì)平衡透化組織的折射率，使整個組織折射率均勻化。

　　2.2組織透明技術(shù)分類

　　目前組織透明技術(shù)主要分為兩類：有機溶劑透明技術(shù)和親水性試劑透明技術(shù)。

　　2.2.1有機溶劑透明

　　有機溶劑透明技術(shù)主要是應(yīng)用含有高折射率介質(zhì)的光學(xué)透明劑取代組織中水分和脂質(zhì)來平衡組織折射率，使組織達(dá)到光學(xué)透明。透明方案包括2個步驟：①脫水/脫脂;②光學(xué)透明劑浸透。高折射率介質(zhì)與水不混溶，因此需要應(yīng)用有機溶劑進(jìn)行組織脫水，脂質(zhì)是光散射的主要來源，脂質(zhì)雙分子層決定細(xì)胞膜的通透性，因此，組織脫水后必須進(jìn)行脫脂處理，以促進(jìn)光學(xué)透明劑向深層組織滲透。SPALTEHOLTZ[11]首次應(yīng)用有機溶劑透明組織樣本，制作出光學(xué)透明器官，推動了解剖學(xué)的發(fā)展進(jìn)程。DODT小組[14]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，采用乙醇脫水，BABB脫脂，透明完整小鼠胚胎和新生小鼠大腦，結(jié)合光片顯微成像技術(shù)，對完整海馬進(jìn)行三維圖像，獲得了CA1神經(jīng)元樹突樹和樹突棘在細(xì)胞分辨率水平的三維圖像。

　　但是，苯甲醇-苯甲酸芐酯(BABB)透明最大的缺陷是乙醇脫水會導(dǎo)致內(nèi)源性熒光蛋白淬滅，為了解決這一問題，ERTÜRK小組[15]應(yīng)用四氫呋喃孵育代替乙醇脫水，保護(hù)綠色熒光蛋白(GFP)信號，同時應(yīng)用二芐醚(DBE)替代BABB以提高透明效率，開發(fā)出基于四氫呋喃和DBE的新型透明方案3DISCO。3DISCO能夠快速透明多種器官組織，包括小鼠大腦，肺臟，腫瘤及人類胚胎等[16-18]，并有效延長了綠色熒光蛋白的表達(dá)時間。為了充分保存內(nèi)源性熒光蛋白，RENIER團(tuán)隊[19]結(jié)合3DISCO透明，建立了一種全組織包埋免疫標(biāo)記的三維成像技術(shù)iDISCO，應(yīng)用免疫標(biāo)記實現(xiàn)目的蛋白的可視化。

　　iDISCO通過組織脫水脫脂，增加抗體滲透性，能夠?qū)π∈笈咛ゼ俺赡晷∈蠼M織(如腎臟，大腦)進(jìn)行可視化三維免疫標(biāo)記，結(jié)合AAV2病毒示蹤，iDISCO展示了視神經(jīng)損傷后神經(jīng)退變及再生的三維成像。雖然3DISCO能夠保護(hù)內(nèi)源性熒光蛋白，但是DBE的降解產(chǎn)物如過氧化物或醛類物質(zhì)，會對熒光蛋白產(chǎn)生有害干擾，熒光蛋白信號僅能維持幾天，為了克服這一缺陷，Dodt引入抗氧化劑沒食子酸丙酯抑制DBE降解產(chǎn)物的積累，設(shè)計出sDISCO透明方案，高效透明組織樣本的同時，有效保存透明樣品的熒光信號和組織結(jié)構(gòu)，結(jié)合STED，樹突棘結(jié)構(gòu)清晰可見[20]。

　　為了更有效地保存內(nèi)源性熒光蛋白，ERTÜRK小組開發(fā)出一種基于DPE的透明技術(shù)uDISCO，可以高效透明嚙齒類動物及臨床人類標(biāo)本[21]，有效保存熒光蛋白信號長達(dá)數(shù)月，結(jié)合顯微成像技術(shù)，uDISCO能夠完成小鼠全身血管生成的三維成像，此外，uDISCO可以與多種標(biāo)記技術(shù)兼容，如病毒示蹤和免疫染色[21]。但是對于綠色熒光蛋白表達(dá)水平較低的樣品，uDISCO保存熒光蛋白信號的能力并不理想。朱丹課題組在uDISCO基礎(chǔ)上，調(diào)整試劑pH值，推出改良透明方案a-uDISCO[22]，能夠更好地保留綠色熒光蛋白熒光，并且以高質(zhì)量成像展示了整個小鼠大腦神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，a-uDISCO是綠色熒光蛋白低表達(dá)樣品成像的優(yōu)先選擇。為了增強熒光蛋白信號強度，CAI等[23]隨即開發(fā)出一種基于納米體的全身免疫標(biāo)記技術(shù)vDISCO，納米體標(biāo)記顯著提高了熒光染料對大型組織的標(biāo)記效率，使熒光信號強度增強100倍，因此能夠?qū)ν该餍∈筮M(jìn)行從頭到腳的光學(xué)成像和亞細(xì)胞水平的量化分析。

　　結(jié)合光片顯微，ERTÜRK團(tuán)隊首次構(gòu)建出成年小鼠神經(jīng)元全身投射圖，并揭示了急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后遠(yuǎn)端神經(jīng)末梢的投射變化和炎癥過程。雖然uDISCO能夠透明大部分小鼠器官，但是對肝臟、脾臟等器官以及硬組織的透明效果欠佳，為了提高全身透明效率，趙瑚團(tuán)隊開發(fā)出一種基于聚乙二醇(PEG)的新型全組織透明技術(shù)PEGASOS[24]，通過脫鈣，脫色，脫水，脫脂等優(yōu)化處理，該透明技術(shù)首次實現(xiàn)了對動物軟、硬組織的同時透明化，包括骨骼、牙齒、大腦、肌肉等，結(jié)合Thy1-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠，趙瑚團(tuán)隊對完整脊柱進(jìn)行三維成像，展示了脊髓神經(jīng)纖維走行以及DRG與脊髓的連接關(guān)系�；�于有機溶劑的透明技術(shù)在透明動力學(xué)上具有一定的優(yōu)勢，能快速高效透明多種類型組織樣本。但是有機溶劑透明會導(dǎo)致樣本大幅度皺縮，對組織結(jié)構(gòu)和蛋白具有潛在的破壞性;此外有機溶劑具有一定的毒性和腐蝕性，需要特殊防護(hù)，并且需要特殊物鏡進(jìn)行成像，限制了其廣泛應(yīng)用。

　　2.2.2親水性試劑透明

　　由于有機溶劑透明存在一定的局限性，許多研究人員開始尋求基于親水性試劑的透明方案。目前，親水性試劑透明主要包括2種：單純浸泡透明和高水化脫脂透明。

　　2.3組織透明成像技術(shù)

　　目前顯微成像技術(shù)正在以驚人的速度發(fā)展，這些顯微成像技術(shù)包括共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡，光片顯微鏡和光學(xué)相干斷層掃描等[47-48]。其中雙光子顯微鏡最適合用于非透明組織的深部成像。然而組織透明技術(shù)去除了光散射造成的穿透限制，這將意味著成像深度不再受樣本的限制，而是受物鏡的限制，目前應(yīng)用于透明組織光學(xué)成像技術(shù)主要包括以下幾種：

　　2.3.1共聚焦和雙光子顯微鏡成像

　　組織透明成像的主要限制因素是物鏡工作距離，而不是光的穿透，因此大軸向行程的立式顯微鏡對于適應(yīng)較長工作距離的物鏡和較厚樣品是必不可少的。目前大多數(shù)顯微鏡制造商都推出了超長工作距離(>5mm)和高NA(>0.9)的物鏡，所以共聚焦顯微鏡和雙光子顯微鏡都可以用于透明樣品成像。對于多種染料標(biāo)記的樣品，共聚焦成像會產(chǎn)生更好的信噪比，因為單光子激發(fā)效率較高，交叉激發(fā)可能性低，此外，由于激光之間的快速切換(無需調(diào)諧)，可以更快地獲得多色共聚焦圖像。

　　雙光子顯微鏡在進(jìn)行較厚組織Z軸掃描時，能夠防止焦平面以外的區(qū)域發(fā)生光漂白作用，此外應(yīng)用近紅外光作為激發(fā)光源，具有更強的組織穿透能力，因為即使透明樣本也會存在一定程度的短波散射[49]。然而，雙光子和共聚焦成像技術(shù)最主要的局限在于成像速度，激光掃描是一個耗時緩慢的過程。使用20X/1.0NA物鏡掃描整個體積為1000mm3的小鼠大腦，即便以相對較快的掃描頻率1hz進(jìn)行掃描，也需要將近50d[50]。因此，對于透明組織，雙光子和共聚焦成像只適用于較小區(qū)域的高分辨率成像。

　　2.3.2光學(xué)投影斷層成像

　　光學(xué)投影斷層成像通過收集樣品不同角度的透射投影圖像，重建樣本三維信息，能夠?qū)�厘米尺度的樣本進(jìn)行快速明場和熒光的三維成像，是大體積生物標(biāo)本成像的理想選擇之一[51]。目前光學(xué)投影斷層成像已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，研究胚胎發(fā)育及全腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接等。結(jié)合組織透明技術(shù)，光學(xué)投影斷層成像成功檢測了多種組織類型樣本，包括發(fā)育中的小鼠胚胎、異種移植瘤組織、小鼠整個心臟、腎臟、大腦半球以及白色脂肪組織[52-53]。最近，BAN等[54]開發(fā)出無需組織標(biāo)記的光學(xué)投影斷層成像(LF-OPT)，LF-OPT采用衰減對比度進(jìn)行成像，因此無需任何熒光或染料標(biāo)記即可實現(xiàn)對普通胚胎的三維成像，擴大了光學(xué)投影斷層成像的應(yīng)用范圍。

　　2.3.3光片顯微鏡成像

　　組織透明成像技術(shù)推動了光片顯微鏡的再發(fā)展[9]，光片顯微鏡應(yīng)用激光光束從側(cè)面激發(fā)熒光樣品，并通過垂直CCD來獲取檢測成像，由于激發(fā)與檢測路徑是分離的，且單個x-y平面圖像在一次掃描中獲得(無需線掃描)，所以可以將光漂白和光學(xué)損傷降低到最低。相機讀取速度以及焦平面移動速度是采樣時間的主要限制因素，LSFM結(jié)合sCMOS相機，拍攝速度高達(dá)100幀，因此LSFM能夠?qū)崿F(xiàn)大體積樣本的高速、高信噪比成像[32，55]。這些優(yōu)點滿足了系統(tǒng)生物學(xué)的研究要求，諸多實驗將光片顯微鏡用于全器官成像，包括對動物胚胎發(fā)育的時空監(jiān)測[56]，魚和蒼蠅全腦神經(jīng)活動的功能成像[57]，或者小鼠全腦成像[58]。綜上所述，LSFM是以高通量方式獲取透明組織3D成像的最佳途徑之一。

　　2.4組織透明技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用

　　組織透明化技術(shù)的發(fā)展使大型生物樣本變得透明，為生物組織結(jié)構(gòu)的三維可視化打開了大門，并為進(jìn)一步探索人類疾病的復(fù)雜性提供了嶄新的平臺，近年來組織透明技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

　　3討論Discussion

　　組織透明技術(shù)可以將完整組織或器官轉(zhuǎn)化為光學(xué)透明形式，結(jié)合顯微成像技術(shù)，極大推動了體積成像(全身或全器官成像)的進(jìn)程，有助于加強對完整生物系統(tǒng)的綜合理解，為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域提供了強有利的工具。近年來，組織透明技術(shù)發(fā)展迅速，多種新型透明技術(shù)不斷涌現(xiàn)，不同的透明技術(shù)具有特定的組織適用性，研究者應(yīng)該根據(jù)實驗?zāi)康�，選擇合適的透明方案。有機溶劑透明優(yōu)勢在于透明質(zhì)量和速度，因此更適合全身或者大器官透明，uDISCO和PEGASOS均可高效透明整個小鼠身體[21，24]，并且能夠保存內(nèi)源性熒光蛋白長達(dá)數(shù)月，因此是全身透明的首選方案;基于親水性試劑的CUBIC-2通過脫鈣、脫色等優(yōu)化處理也可以有效透明小鼠全身[41]，基于水凝膠包埋的ACT-PRESTO雖然可以透明小鼠全身[70]，但透明效果欠佳，并且需要特殊設(shè)備，因此不適合用于全身透明。

　　親脂性染料如DiI是常用的神經(jīng)示蹤劑，在神經(jīng)環(huán)路研究中發(fā)揮重要作用，SeeDB，F(xiàn)RUIT，Scale等透明方法[25，27-28]，操作簡單，成本低廉，脂質(zhì)成分保存完好，與親脂性染料有較好的兼容性，但是透明效率較低，只適合組織片或小樣本DiI染色的透明，相比而言，SWITCH和ScaleS具有較高的透明效率[26，37]，同時能夠保留親脂性染料，因此是大樣本透明的首選。

　　基于凝膠包埋的透明技術(shù)，如CLARITY，PACT-PARS，SWITCH，SHIELD[29，33，38，59]，通過共價交聯(lián)作用，能夠有效保護(hù)組織結(jié)構(gòu)，生物分子以及RNA，因此可以進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄本分析以及應(yīng)用透射電鏡進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)分析，但是對硬組織的透明效果不理想，如骨骼、牙齒。綜上所述，沒有一種單獨的透明技術(shù)能夠滿足所有實驗需求，研究者需要根據(jù)組織樣本的類型、體積以及成像需求選擇最優(yōu)的透明方案。雖然組織透明技術(shù)發(fā)展迅速，但是目前仍然面臨一些挑戰(zhàn)，阻礙了體積成像技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用。首先是透明速度和質(zhì)量，目前組織透明技術(shù)主要集中在嚙齒類動物，對于靈長類動物或人類標(biāo)本的透明還局限在組織切塊水平，并且透明時間較漫長，目前還沒有實現(xiàn)完整狨猴大腦的透明，未來應(yīng)該著重開發(fā)更加高效、無毒的透明試劑，以提高靈長類動物組織的透明質(zhì)量和速度。

　　其次，抗體染色深度是組織透明技術(shù)的主要挑戰(zhàn)之一，由于抗體和熒光基團(tuán)分子量較大，在組織中的滲透速度緩慢，因此需要較長的孵育時間，此外，抗體在深層組織的擴散和結(jié)合呈現(xiàn)非線性，導(dǎo)致組織染色不均勻。雖然AbScale，PACT-PARS，ACT-PRESTO，Ce3D等透明方法能夠顯著提高抗體滲透速率[26，44，70-71]，但染色深度也只局限在幾毫米，無法實現(xiàn)完整器官的三維免疫標(biāo)記。使用單域抗體、核酸適配體或者納米體應(yīng)該能提高組織滲透性和染色均勻性，vDISCO應(yīng)用納米體代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗體，顯著提高了樣本標(biāo)記效率，并實現(xiàn)了對Thy1-GFP小鼠完整神經(jīng)投射的標(biāo)記[23]。但是目前納米體種類較少，未來有待于開發(fā)更多類型的納米體，同時結(jié)合微波技術(shù)或電泳技術(shù)，增強對生物體的三維免疫標(biāo)記。

　　此外，成像深度和分辨率也存在一定的限制，超長工作距離和高NA的物鏡是體積成像必不可少的，光片顯微鏡LSFM擁有工作距離>5mm，NA>0.9的物鏡，但物鏡放大倍數(shù)有限(1.26x-12.6x)[5]，極大限制了圖像分辨率，因此急需開發(fā)透化專用的超長工作距離高倍物鏡，加快實現(xiàn)亞細(xì)胞分辨率的體積成像。自適應(yīng)光學(xué)可能會促進(jìn)體積成像的進(jìn)程，目前自適應(yīng)光學(xué)已廣泛用于天文學(xué)中大氣光散射的糾正，這種技術(shù)通常是基于傳感器來檢測返回光波陣面的變形，并通過變形反射鏡或空間光調(diào)制器來糾正這些變形，目前正被應(yīng)用于顯微鏡成像，以提高光在非透明樣品中的穿透深度[72]。

　　雖然自適應(yīng)光學(xué)本身在較深組織內(nèi)并不能產(chǎn)生清晰的圖像，但當(dāng)與組織透明技術(shù)相結(jié)合時，成像深度和分辨率可能會大幅度增加。除了成像限制，后期大容量圖像數(shù)據(jù)集處理也存在一定的挑戰(zhàn)，需要使用具有大容量內(nèi)存和專業(yè)軟件的專用工作站，同時，處理和分析超大數(shù)據(jù)集的新型開源解決方案有待于進(jìn)一步開發(fā)，以便更好地理解這些成像方法所揭示的細(xì)胞之間的復(fù)雜關(guān)系。未來組織透明技術(shù)將會繼續(xù)發(fā)展，新型透明試劑、免疫標(biāo)記、顯微鏡設(shè)計以及大型數(shù)據(jù)集分析等方面的技術(shù)進(jìn)步將為生物醫(yī)學(xué)科學(xué)家繪制全身單細(xì)胞圖譜鋪平道路。

　　生物方向評職知識：生物專業(yè)sci論文如何發(fā)表?

　　首先發(fā)表生物類sci論文，需要了解這一領(lǐng)域期刊的辦刊宗旨和范圍，了解期刊的讀者對象，側(cè)重點和研究興趣，只有論文與期刊要求相符，才有被接收的可能。當(dāng)然生物論文也要有創(chuàng)新性，原創(chuàng)度也要比較高的，必要時也需要找專業(yè)老師幫忙修改潤色。

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