雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)在家蠶基因啟動子研究中的應(yīng)用

　　摘 要 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)是以螢火蟲熒光素酶作為主報告基因、海腎熒光素酶作為內(nèi)參對照的檢測系統(tǒng)‍‌‍‍‌‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‍‍‌‍‌‍‌‍‌‍‍‌‍‍‍‍‍‍‍‍‍‌‍‍‌‍‍‌‍‌‍‌‍。 它在不同物種的基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的研究中發(fā)揮著重要的作用‍‌‍‍‌‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‍‍‌‍‌‍‌‍‌‍‍‌‍‍‍‍‍‍‍‍‍‌‍‍‌‍‍‌‍‌‍‌‍。 目前，在家蠶中已經(jīng)應(yīng)用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)研究了家蠶生長發(fā)育期間基因表達的變化以及病毒侵入家蠶細胞基因表達調(diào)控的分子機制等‍‌‍‍‌‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‍‍‌‍‌‍‌‍‌‍‍‌‍‍‍‍‍‍‍‍‍‌‍‍‌‍‍‌‍‌‍‌‍。 文章對雙熒光酶報告基因系統(tǒng)的發(fā)展歷史、工作原理及其在家蠶基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控研究中的應(yīng)用和其中存在的問題進行了論述，以期為今后相關(guān)研究工作的開展提供參考。

　　關(guān)鍵詞 家蠶; 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng); 啟動子活性; 應(yīng)用

　　啟動子是基因結(jié)構(gòu)中一段可以被RNA聚合酶識別、結(jié)合、起始轉(zhuǎn)錄的DNA序列，它含有RNA聚合酶特異性結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始所需的保守序列。 啟動子本身不被轉(zhuǎn)錄，而是通過其中的反應(yīng)元件(response elements)與轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)結(jié)合進而控制基因的轉(zhuǎn)錄活動。

　　蠶業(yè)養(yǎng)殖論文投稿刊物《微生物學(xué)通報》1974年創(chuàng)刊，是中國微生物學(xué)會和中國科學(xué)院微生物研究所主辦， 國內(nèi)外公開發(fā)行，以微生物學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究及高新技術(shù)創(chuàng)新、應(yīng)用為主的綜合性學(xué)術(shù)期刊。

　　轉(zhuǎn)錄調(diào)控是調(diào)節(jié)基因功能最直接、有效的方式[1]。 將目的基因的啟動子區(qū)域構(gòu)建至雙熒光素酶報告基因表達載體中，通過檢測雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)熒光蛋白的酶活，從而分析目的基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，這是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中常用且有效的手段之一[2]。 家蠶是鱗翅目昆蟲的模式生物，本文以家蠶基因啟動子調(diào)控機制的研究為切入點，對雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的工作原理與特點、研究和應(yīng)用現(xiàn)狀進行綜述，有助于我們從細胞和分子層面理解昆蟲生長發(fā)育過程的基因轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控機制，為今后該系統(tǒng)在昆蟲中的深入應(yīng)用提供思考。

　　1 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的發(fā)展歷史

　　熒光素酶是最初從自然界發(fā)光生物中獲得的一種可以催化對應(yīng)的熒光底物發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生熒光的蛋白酶類物質(zhì)，哺乳細胞沒有內(nèi)源性熒光素酶[3]。 熒光底物與酶發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生的光其本質(zhì)是一種生物螢光，屬于可見光，不依賴外源激發(fā)光作用，在自然界一些發(fā)光生物身上通常能見到這種生物螢光。 而熒光則是通過激發(fā)光照射熒光物質(zhì)，光能使熒光物質(zhì)原子核周圍的電子發(fā)生躍遷反應(yīng)，由原來的低能量電子軌道躍遷到高能量電子軌道，但是這種原子狀態(tài)并不穩(wěn)定，即原子會從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，原先電子從激發(fā)光中獲得的能量又會重新以光能的形式釋放出去，形成具有一定的波長特征的熒光。 所以熒光和螢光是有一定區(qū)別的，Promega公司為了區(qū)分這兩類光信號的不同一直將Luciferase稱為螢光素酶，但慣例上我們還是稱其為熒光素酶。

　　地球存在許多發(fā)光的生物，如螢火蟲等。 在1884年，法國科學(xué)家Dubois經(jīng)實驗認為，熒光素底物、熒光催化酶以及氧是發(fā)光反應(yīng)的基本條件，由此開始了對螢火蟲發(fā)光現(xiàn)象的研究與應(yīng)用。 隨后的數(shù)十年內(nèi)，科學(xué)家們不斷地對螢火蟲發(fā)光物質(zhì)本質(zhì)進行探索和查找。 1942年，美國約翰霍普金斯大學(xué)麥科勒-普拉特研究所(The McCollum-Pratt Institute and the Department of Biology, Johns Hopkins University)的McElory發(fā)現(xiàn)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)直接參與了螢火蟲發(fā)光反應(yīng)[4]。 1954年，McElory等人從發(fā)光的細菌中提取到了熒光素酶結(jié)晶，由此發(fā)光生物熒光素酶的研究邁上了新的臺階[5]。 隨后在1956年，Green與McElory等一起第一次從螢火蟲中提取得到了較高純度的螢火蟲熒光素酶結(jié)晶制劑，自此開始了螢火蟲熒光素酶在生物學(xué)研究中的開發(fā)和應(yīng)用[6]。

　　除螢火蟲類昆蟲外，目前在自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種可以發(fā)光的生物，人們對這些來源于不同發(fā)光生物的熒光素酶進行了提取，并分類為螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase)、細菌熒光素酶(bacterial luciferase)和另外一些從發(fā)光甲蟲、發(fā)光海洋生物提取的熒光素酶[3]。 螢火蟲熒光素酶最早提取于一種北美螢火蟲(Photinus pyralis)，目前已在世界各地的螢火蟲中提取到螢火蟲熒光素酶[3]。

　　細菌熒光素酶是從明亮發(fā)光桿菌(Photobacterium phosphoreum)、羽田希瓦氏菌(shezoanella hanedai)、夏威夷弧菌(Vibrio harvey)、青�；【�(V.qinhaiensis)、火神弧菌(V. logei)、費氏弧菌(V. fischeri)等多種海洋和淡水中的發(fā)光菌中提取獲得的。 在1960年，美國喬治亞大學(xué)(University of Georgia)的Cormier等研究者從海腎(renilla)中提取了海腎熒光素酶(Renilla reniformis luciferase)，為海腎熒光素酶在科研中的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)[7]。

　　數(shù)十年來，研究者們一直嘗試將熒光素酶作為一種報告基因來研究基因啟動子的活性和蛋白質(zhì)之間的相互作用。 早在1988年就有通過對熒光素酶報告基因表達的蛋白的熒光強度進行檢測，進而綜合分析不同處理條件對基因啟動子活性影響[8]。 這就是典型的、利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)表達產(chǎn)物的特性建立起來的一種可以對目的基因轉(zhuǎn)錄活性進行定量檢測的技術(shù)體系[3]。

　　在1990年，經(jīng)過兩年的研究與發(fā)展形成了一套相對成熟的熒光素酶生物傳感器技術(shù)，同年其發(fā)明者加入了Promega公司。 經(jīng)過幾年的潛心研發(fā)，1996年P(guān)romega公司正式發(fā)布了雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)并開始銷售相關(guān)檢測試劑，這種技術(shù)創(chuàng)造性地結(jié)合了螢火蟲熒光素酶和海洋腔腸熒光素酶兩種熒光檢測體系，是熒光素酶技術(shù)在漫長發(fā)展歷史中的一次重要的突破。 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)與傳統(tǒng)共報告基因系統(tǒng)相比較，具有更簡便、高效、快速的特點，因此在分子生物學(xué)諸多領(lǐng)域的研究中得到了應(yīng)用。

　　2 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的基本工作原理

　　理想的報告基因應(yīng)該具有以下幾個基本特點：①具有已知且可被克隆驗證的全部基因序列; ②報告基因的表達產(chǎn)物在檢測中要反應(yīng)靈敏，酶活反應(yīng)迅速; ③不與目的研究細胞中的任何表達基因相似，否則會干擾轉(zhuǎn)染進入細胞內(nèi)的熒光素酶的作用效果[9]; ④報告基因的表達產(chǎn)物有較寬的動態(tài)檢測范圍，具有良好的穩(wěn)定性; ⑤報告基因的表達產(chǎn)物不影響目的研究細胞的正常生理活動; ⑥報告基因在目的研究細胞中的表達產(chǎn)物易于檢測，且能夠按照標(biāo)準(zhǔn)讀取量值。 大部分的報告基因表達產(chǎn)物通常是酶，可以通過催化反應(yīng)級聯(lián)放大信號，再以螢光或放射性信號被檢測[10]。

　　在幾種熒光素酶中，螢火蟲的熒光素酶最適合我們開展實驗研究使用的。 大多數(shù)細菌的熒光素酶最適的活性溫度在15 ℃～25 ℃，溫度超過25 ℃時其酶活會迅速下降，37 ℃下基本全部失活，所以不適合在動物細胞中使用[11]。 相較而言，螢火蟲熒光素酶則對催化溫度要求較低，一般室溫即可，適應(yīng)溫度范圍廣，因此該酶報告基因常用于各類真核細胞基因啟動子活性的分析與檢測。 目前，有些新型熒光素酶如Gaussia熒光素酶和Cypridina熒光素酶，它們的基因攜帶了一種分泌信號肽，表達產(chǎn)物能分泌到細胞外，可以在不裂解破碎細胞的條件下直接檢測酶活，甚至還能連續(xù)檢測時間曲線上報告基因表達產(chǎn)物的變化，進而分析報告基因的表達活性變化，此技術(shù)方法適用于高通量篩選[12]。

　　螢火蟲熒光素酶是一種可以催化熒光底物發(fā)生反應(yīng)的單亞基特異活性蛋白，分子量為60～64 kDa。 螢火蟲熒光素酶報告基因的優(yōu)點在于只要完成轉(zhuǎn)錄翻譯，其表達產(chǎn)物就立刻具有可被檢測的酶活[3]。 在ATP、二價鎂離子(Mg2+)、氧氣(O2)等存在的情況下，螢火蟲熒光素酶會催使底物螢火蟲熒光素發(fā)生氧化，消耗ATP和O2產(chǎn)生Lucifery1-AMP (adenosine monophosphate，AMP)中間體，氧化的熒光素會從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)釋放出光子，產(chǎn)生波長540～600 nm的黃綠色熒光信號，這類熒光信號可以通過發(fā)光檢測儀或CCD(Charge-coupled Device)相機來進行檢測或捕獲[13]。 但這一生化反應(yīng)過程比較緩慢，因此在熒光素酶和熒光素底物混合后產(chǎn)生的熒光會迅速衰減[3]，所以在專業(yè)化的試劑盒中會通過添加輔酶A(coenzyme A, CoA)來提高螢火蟲熒光素酶的活性，加快該熒光反應(yīng)的速度，解決熒光衰減的問題，產(chǎn)生連續(xù)的熒光信號。 除輔酶A外，牛血清蛋白和氨基乙醇等物質(zhì)也具有相同的作用[14]。

　　提取自海洋腔腸動物海腎的熒光素酶也是一種可以催化熒光素發(fā)生熒光反應(yīng)的單亞基特異活性蛋白，其分子量為36 kDa。 同螢火蟲熒光素酶一樣，該蛋白質(zhì)在完成轉(zhuǎn)錄翻譯后即具有催化活性[15]。 海腎熒光素酶不依賴ATP參與酶促反應(yīng)，在有熒光底物腔腸素(coelenterazine)和O2等反應(yīng)物質(zhì)的條件下，海腎熒光素酶即可催化熒光底物腔腸素發(fā)生氧化，在反應(yīng)過程會產(chǎn)生波長為460～540 nm的藍色熒光信號。

　　和螢火蟲熒光素酶相似，海腎熒光素酶反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號也會在短時間內(nèi)迅速衰減。 這種報告基因既可以作為內(nèi)參與螢火蟲熒光素酶等其他報告基因一起組成雙檢測系統(tǒng)，也可以作為一種單獨的檢測系統(tǒng)用于實驗。 天然腔腸素在適宜條件下能夠穿越活細胞的細胞膜，與活細胞內(nèi)表達的海腎熒光素酶發(fā)生酶促反應(yīng)產(chǎn)生熒光，因此海腎熒光素酶報告基因適用于有活細胞檢測需求的實驗[11]。

　　Promega公司是最早將螢火蟲熒光素與海洋腔腸熒光素酶兩種不同熒光檢測體系相結(jié)合提供雙熒光素報告基因系統(tǒng)的生物制劑公司，該檢測系統(tǒng)是一種含有內(nèi)參、可歸一化處理實驗數(shù)據(jù)、分析實驗現(xiàn)象的方案[16]。 螢火蟲熒光素酶和海洋腔腸熒光素酶檢測到的是具有不同特征的數(shù)據(jù)，歸一化處理可以使這些數(shù)據(jù)變得具有可比性的同時又保留一定的相對關(guān)系。 即在實驗中可以通過設(shè)置合理的內(nèi)參，讓實驗預(yù)處理過程得到的沒有可比性的數(shù)據(jù)得到一定的限制，能夠?qū)φ諈⒄瘴镞M行計算，進而消除各種實驗差異如細胞數(shù)、轉(zhuǎn)染效率、細胞狀態(tài)、裂解效率、檢測溫度、時間等因素帶來的影響[17]。

　　早期的雙熒光素酶報告系統(tǒng)需要裂解細胞，并先后完成兩個生物熒光反應(yīng)的定量檢測，再對實驗數(shù)據(jù)進行處理和分析，以達到對兩個同時表達的報告基因的表達活性進行檢測的目的[18]‍‌‍‍‌‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‍‍‌‍‌‍‌‍‌‍‍‌‍‍‍‍‍‍‍‍‍‌‍‍‌‍‍‌‍‌‍‌‍。 實驗步驟是首先將構(gòu)建好的、帶有目的基因啟動子的報告基因載體和內(nèi)參載體共轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)細胞中進行表達，檢測熒光時要用裂解液將轉(zhuǎn)染的細胞進行破碎裂解，然后加入螢火蟲熒光素與螢火蟲熒光素酶發(fā)生熒光反應(yīng)。 隨后，用熒光檢測工具對熒光強度進行測定，檢測完成后還需淬滅該熒光反應(yīng)，再加入腔腸素與海腎熒光素酶發(fā)生熒光反應(yīng)，檢測其熒光強度[17]。 其中螢火蟲熒光素酶作為主報告基因，其表達水平隨外界的處理而發(fā)生變化，海腎熒光素酶作為內(nèi)參報告基因，其表達水平一般不會隨外界處理而發(fā)生變化[18]。

　　目前，Thermo公司研發(fā)了一種比較便捷的雙分泌型螢光素酶報告基因檢測技術(shù)，其選用的是Gaussia分泌型熒光素酶和Cypridina分泌型熒光素酶[19]。 這兩種酶均為分泌蛋白，在表達過程中會通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌到細胞外，因此實驗時不需要裂解細胞，取培養(yǎng)液上清就能進行熒光檢測。 但是這兩種酶的熒光信號波長相似，一起檢測的話難以分辨，一般要將測試樣品分為相同的兩組再分別用不同的熒光素底物對酶活性進行檢測，借此進行區(qū)分。 這種檢測技術(shù)不用考慮熒光素酶在細胞內(nèi)底物的影響，比螢火蟲熒光素酶有更高的檢測靈敏度和更廣的動態(tài)檢測范圍[20]。

　　3 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)在家蠶基因啟動子研究中的應(yīng)用

　　在1995年，國內(nèi)就有研究者首先將野生型家蠶BmNPV病毒基因組DNA與克隆帶有熒光素酶基因的pBmL質(zhì)粒進行重組，再將重組后的載體轉(zhuǎn)染到家蠶細胞中進行表達，獲得載有熒光素酶基因的重組病毒rBmNPVLu。 研究發(fā)現(xiàn)，該重組病毒帶有的熒光素酶基因能夠在家蠶細胞中進行轉(zhuǎn)錄表達。 隨后，將重組病毒注射進家蠶幼蟲體內(nèi)，檢測發(fā)現(xiàn)與其他病毒基因一樣，熒光素酶基因在家蠶幼蟲和蛹中注射重組病毒后的第5天左右表達最高[21]。

　　3.1 相似性基因啟動子活性差異的研究

　　家蠶有3個BmSDH(Bombyx mori sorbitol dehydrogenase，BmSDH)基因，即BmSDH-1、BmSDH-2a、BmSDH-2b。 其中BmSDH-2a和BmSDH-2b在基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)上都具有很高的相似性，二者可能具有相似的生理功能，而BmSDH-1則存在較大差異。 于是朱娟等人利用PCR技術(shù)克隆這3個基因的啟動子，分別構(gòu)建帶有螢火蟲熒光素酶報告基因的載體，并與pRL-CMV報告質(zhì)粒(含海腎熒光素酶報告基因)共轉(zhuǎn)染家蠶BmN細胞，通過雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測BmSDH基因啟動子的活性。 實驗結(jié)果表明，BmSDH-2a的啟動子活性極顯著高于BmSDH-1和BmSDH-2b[22]。 謝雨辰等人推測，家蠶卵內(nèi)山梨醇脫氫酶的活性主要來自BmSDH-2a基因的表達。 他們利用滯育激素、保幼激素(juvenile hormone，JH)和蛻皮激素(20 -hydroxyecdysone，20 E)處理轉(zhuǎn)染有BmSDH-2a基因啟動子(序列長度1082 bp)的熒光素酶報告基因系統(tǒng)的家蠶細胞，發(fā)現(xiàn)滯育激素不能調(diào)節(jié)BmSDH基因的表達，而高濃度的保幼激素和蛻皮激素則會抑制BmSDH基因的表達[22]。

　　趙斯斯等人發(fā)現(xiàn)家蠶細胞色素P450 家族CYP9A19 和CYP9A22 兩個基因的表達存在組織特異性，CYP9A19 在中腸、絲腺、脂肪體、馬氏管中均有較高水平的表達; CYP9A22 在中腸、絲腺、馬氏管中有表達，但在脂肪體中無表達。 為了研究這兩2個基因的表達調(diào)控機制，其構(gòu)建了含熒光素酶報告基因和啟動子不同長度順次缺失片段的重組質(zhì)粒，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測啟動子活性。 結(jié)果表明：家蠶CYP9A19 基因起始密碼子游-1492～-1102 bp區(qū)域是重要的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域; CYP9A22 基因啟動子起始密碼子上游-1630～-1210 bp這一區(qū)域是重要的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域。 用不同濃度的氟化鈉誘導(dǎo)細胞后，發(fā)現(xiàn)0.1×10 -3mol/L 的NaF能使熒光素酶活性增強顯著，即0.1×10 -3mol/L NaF能上調(diào)這2個基因的表達[15]。

　　3.2 基因啟動子序列區(qū)域調(diào)控元件的研究分析

　　謝雨辰等通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)對BmSDH-2a基因啟動子反應(yīng)元件進行鑒定，結(jié)果顯示在BmSDH-2a啟動子序列中-355～-674 bp和-674～-1082 bp的兩個區(qū)域之間存在負調(diào)控元件[23]。 莊蘭芳等利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)對家蠶熱激蛋白hsp70 基因5’端的序列：hsp70 -1～hsp70 -305 和hsp70 -1～hsp70 -538 進行比較，結(jié)果顯示片段hsp70 -1～hsp70 -538 的表達活性是hsp70 -1～hsp70 -305 的1～3倍，并且hsp70 -1～hsp70 -538 除了包含共有的熱激元件(heat shock element，HSE)外，還包含3個可能的HSE元件[24]。

　　Li等研究者以家蠶為模型，利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)證明了20 E信號傳導(dǎo)的初級應(yīng)答基因E75 不同亞型介導(dǎo)的蛻皮甾類生物合成與20 E信號傳導(dǎo)之間存在的調(diào)節(jié)環(huán)路。 結(jié)果顯示，E75 基因的亞型A和C可以直接與Halloween基因啟動子區(qū)域中的視黃酸受體相關(guān)反應(yīng)元件結(jié)合，以誘導(dǎo)基因表達，從而促進蛻皮甾類生物合成和發(fā)育提前，而亞型B通過物理相互作用拮抗亞型A/C對Halloween基因的轉(zhuǎn)錄活性。 由于20 E差異誘導(dǎo)E75 基因亞型的表達，因此E75 基因介導(dǎo)的調(diào)節(jié)環(huán)代表了類固醇生成的良好自動調(diào)節(jié)，這有助于精確控制發(fā)育時機[25]。

　　細胞自噬的發(fā)生需要在多個細胞自噬相關(guān)(autophagy-related, Atg)蛋白的參與下才能完成[26]。 Tian等通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)和凝膠遷移等一系列實驗研究發(fā)現(xiàn)，20 E通過其受體EcR/Usp結(jié)合到關(guān)鍵自噬基因Atg1的啟動子區(qū)域反應(yīng)元件誘導(dǎo)其表達，從而促進細胞自噬的發(fā)生[26]。 顧健健等利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)在已報道的BmVgP78 M啟動子上游利用基因工程連接了一段BrC-Z2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列(BrC-Z2 element，BrC-Z2E)，連接的這段序列可以對20 E進行應(yīng)答并增強該啟動子活性[27]。

　　陳恩祥研究發(fā)現(xiàn)，家蠶BmVgR(Bombyx mori vitellogenin receptor)基因的啟動子均存在大量的POU結(jié)構(gòu)域，他們利用熒光素酶報告系統(tǒng)、凝膠阻滯實驗(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)和染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)等實驗驗證了家蠶POU結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子POU-M2能夠結(jié)合到BmVgR啟動子上并啟動BmVgR的高表達。 同時，他們還研究發(fā)現(xiàn)20 E能夠誘導(dǎo)BmVgR的轉(zhuǎn)錄，20 E信號傳導(dǎo)因子BrC-Z1能夠結(jié)合到POU-M2基因的啟動子區(qū)域誘導(dǎo)其表達，進而增強BmVgR的表達[28]。

　　3.3 研究小RNA對靶向基因轉(zhuǎn)錄表達的影響

　　小RNA為長度小于200 nt的非編碼RNA，主要包括微RNA(microRNA，miRNA)、小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和Piwi-interacting RNA(piRNA)等，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控，以發(fā)揮基因沉默的作用。

　　家蠶細胞質(zhì)多角體病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus，BmCPV)感染家蠶后誘導(dǎo)的胰島素相關(guān)肽結(jié)合蛋白2(Insulin-related peptide-binding protein2，IBP2)基因，可能是小分子RNA miR-278 -3P的靶標(biāo)之一。 Wu等構(gòu)建PmirGLO-IBP2和PmirGLO-IB2P2-mut(突變型)雙熒光素酶報告基因載體，研究發(fā)現(xiàn)PmirGLO-IBP2和miR-278 -3p模擬物共轉(zhuǎn)染的細胞中，熒光素酶活性顯著降低; 在PmirGLO-IBP2-mut和miR-278 -3p模擬物共轉(zhuǎn)染的細胞中，螢光素酶活性沒有變化。 這表明，在BmCPV感染后，可高度誘導(dǎo)B. mori IBP2基因的表達，并且被miR-278 -3p負調(diào)控[29]。

　　根據(jù)家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleo polyhedrosis virus，BmNPV)感染家蠶后小RNA表達的變化，姜曉旭預(yù)測miR-277 -5p可靶向作用于家蠶DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因Dnmt(DNA methyltransferase)，通過構(gòu)建PmirGLO-Dnmt2和PmirGLO-Dnmt2-mut(突變型)雙熒光素酶報告基因載體等研究發(fā)現(xiàn)miR-277 -5p對Dnmt基因表達具有顯著的抑制作用[30]。

　　此外，雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)也可用于檢測家蠶生長發(fā)育過程中小RNA對基因轉(zhuǎn)錄表達的調(diào)控。 劉曉等利用實時熒光定量PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)piR-4682(Piwi-interacting RNA-4682)在家蠶精巢、卵巢和血淋巴中表達量較高。 隨后，研究人員還發(fā)現(xiàn)在piR-4682相同的作用位點存在另一個miRNA-305，它們均靶向調(diào)控small wing基因，將該基因的CDS(coding sequence)片段構(gòu)建在psiCHECK熒光素酶報告基因載體上，得到重組載體psiCHECK [small wing]。 piR-4682和miR-305的類似物對small wing基因的表達都有一定抑制作用[31]。

　　陳恩祥等篩選出10 個從卵黃發(fā)生期到卵殼形成期上調(diào)表達的miRNAs可能參與調(diào)控BmVgR基因的表達。 他們將BmVgR 3’UTR構(gòu)建至psiCHECKTM-2海腎熒光素酶報告基因載體中，然后用這些miRNA類似物(mimic)處理發(fā)現(xiàn)其中兩個miRNAs分別使熒光素酶活性降低了33.4%和38.4%，當(dāng)兩種miRNAs同時存在時抑制作用更強，說明它們可能通過結(jié)合BmVgR 3’UTR上的作用位點來調(diào)控BmVgR基因的表達[28]。

　　4 啟動子活性研究系統(tǒng)的發(fā)展與展望

　　目前而言，啟動子活性的研究還非常依賴報告基因系統(tǒng)技術(shù)的發(fā)展，而熒光素酶報告基因系統(tǒng)較其他報告基因系統(tǒng)具有更多的優(yōu)點和可操作性。 同時也得益于生物技術(shù)和科學(xué)的飛快發(fā)展，螢火蟲熒光素酶報告基因系統(tǒng)將會擁有更多的提升和進步空間。 熒光素酶報告基因在應(yīng)用過程中有以下幾點優(yōu)勢：(1)在使用過程中不涉及放射性，使用安全污染; (2)熒光素酶檢測信號強，比CAT(cat reporter assay)等其他報告基因檢測速度更快，靈敏度高將近100～1000倍[32]; (3)樣品檢測步驟簡單，操作方便; (4)比顯微鏡檢測熒光更靈敏，沒有非特異性激發(fā)光干擾，信噪比高不易受底物影響; (5)熒光素酶的半衰期短[33]; (6)檢測濃度線性范圍廣，只要熒光素酶的濃度在10-16mol/L(10pg/L)到10-8mol/L(1mg/L)內(nèi)均合適檢測[32]。

　　但雙熒光素酶報告基因在應(yīng)用過程中也有諸多注意事項，例如：(1)為了良好的測定效果，在雙熒光素酶測試試劑與測試樣品混合到測定的這段時間要保持一致，避免過長地停滯(要在1～2 s時間內(nèi)進行測定); (2)Renilla熒光素酶檢測液不能長期保留，配制后要立即使用; (3)熒光素底物反應(yīng)液配制后不能反復(fù)凍融，不同批次的配制液可能存在差異; (4)溫度對酶有很大影響，要保證樣品和試劑測定時完全達到室溫[17,20]。 不過，當(dāng)前也有些單個載體(如pmirGLO)能夠同時攜帶兩個不同的熒光素酶報告基因，還有各種功能性載體能滿足不同實驗的需求。

　　隨著人類對基因啟動子活性研究的逐漸深入，對于實驗工具和研究體系的要求也會進一步提高，啟動子活性研究系統(tǒng)亦會得到進一步的發(fā)展。 隨著科技的進步，實驗操作和應(yīng)用技術(shù)也將愈加熟練可控，新型技術(shù)運用范圍也會更加廣泛。 可以預(yù)見，人類的智慧的發(fā)展和科學(xué)技術(shù)的飛躍會使雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)變得更加便利、高效，從而獲得更廣、更深的發(fā)揮空間，直至該項技術(shù)被更好的啟動子活性研究系統(tǒng)所取代。

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　　作者：歐陽萃鴻 陳太生 謝曉樂 李榮松 田 鈴

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