雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)在家蠶基因啟動(dòng)子研究中的應(yīng)用

　　摘 要 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)是以螢火蟲(chóng)熒光素酶作為主報(bào)告基因、海腎熒光素酶作為內(nèi)參對(duì)照的檢測(cè)系統(tǒng)‍‌‍‍‌‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‍‍‌‍‌‍‌‍‌‍‍‌‍‍‍‍‍‍‍‍‍‌‍‍‌‍‍‌‍‌‍‌‍。 它在不同物種的基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的研究中發(fā)揮著重要的作用‍‌‍‍‌‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‍‍‌‍‌‍‌‍‌‍‍‌‍‍‍‍‍‍‍‍‍‌‍‍‌‍‍‌‍‌‍‌‍。 目前，在家蠶中已經(jīng)應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)研究了家蠶生長(zhǎng)發(fā)育期間基因表達(dá)的變化以及病毒侵入家蠶細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制等‍‌‍‍‌‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‍‍‌‍‌‍‌‍‌‍‍‌‍‍‍‍‍‍‍‍‍‌‍‍‌‍‍‌‍‌‍‌‍。 文章對(duì)雙熒光酶報(bào)告基因系統(tǒng)的發(fā)展歷史、工作原理及其在家蠶基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控研究中的應(yīng)用和其中存在的問(wèn)題進(jìn)行了論述，以期為今后相關(guān)研究工作的開(kāi)展提供參考。

　　關(guān)鍵詞 家蠶; 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng); 啟動(dòng)子活性; 應(yīng)用

　　啟動(dòng)子是基因結(jié)構(gòu)中一段可以被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合、起始轉(zhuǎn)錄的DNA序列，它含有RNA聚合酶特異性結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始所需的保守序列。 啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄，而是通過(guò)其中的反應(yīng)元件(response elements)與轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)結(jié)合進(jìn)而控制基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)。

　　蠶業(yè)養(yǎng)殖論文投稿刊物《微生物學(xué)通報(bào)》1974年創(chuàng)刊，是中國(guó)微生物學(xué)會(huì)和中國(guó)科學(xué)院微生物研究所主辦， 國(guó)內(nèi)外公開(kāi)發(fā)行，以微生物學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究及高新技術(shù)創(chuàng)新、應(yīng)用為主的綜合性學(xué)術(shù)期刊。

　　轉(zhuǎn)錄調(diào)控是調(diào)節(jié)基因功能最直接、有效的方式[1]。 將目的基因的啟動(dòng)子區(qū)域構(gòu)建至雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體中，通過(guò)檢測(cè)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)熒光蛋白的酶活，從而分析目的基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，這是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中常用且有效的手段之一[2]。 家蠶是鱗翅目昆蟲(chóng)的模式生物，本文以家蠶基因啟動(dòng)子調(diào)控機(jī)制的研究為切入點(diǎn)，對(duì)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的工作原理與特點(diǎn)、研究和應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，有助于我們從細(xì)胞和分子層面理解昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控機(jī)制，為今后該系統(tǒng)在昆蟲(chóng)中的深入應(yīng)用提供思考。

　　1 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的發(fā)展歷史

　　熒光素酶是最初從自然界發(fā)光生物中獲得的一種可以催化對(duì)應(yīng)的熒光底物發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生熒光的蛋白酶類物質(zhì)，哺乳細(xì)胞沒(méi)有內(nèi)源性熒光素酶[3]。 熒光底物與酶發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生的光其本質(zhì)是一種生物螢光，屬于可見(jiàn)光，不依賴外源激發(fā)光作用，在自然界一些發(fā)光生物身上通常能見(jiàn)到這種生物螢光。 而熒光則是通過(guò)激發(fā)光照射熒光物質(zhì)，光能使熒光物質(zhì)原子核周圍的電子發(fā)生躍遷反應(yīng)，由原來(lái)的低能量電子軌道躍遷到高能量電子軌道，但是這種原子狀態(tài)并不穩(wěn)定，即原子會(huì)從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，原先電子從激發(fā)光中獲得的能量又會(huì)重新以光能的形式釋放出去，形成具有一定的波長(zhǎng)特征的熒光。 所以熒光和螢光是有一定區(qū)別的，Promega公司為了區(qū)分這兩類光信號(hào)的不同一直將Luciferase稱為螢光素酶，但慣例上我們還是稱其為熒光素酶。

　　地球存在許多發(fā)光的生物，如螢火蟲(chóng)等。 在1884年，法國(guó)科學(xué)家Dubois經(jīng)實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，熒光素底物、熒光催化酶以及氧是發(fā)光反應(yīng)的基本條件，由此開(kāi)始了對(duì)螢火蟲(chóng)發(fā)光現(xiàn)象的研究與應(yīng)用。 隨后的數(shù)十年內(nèi)，科學(xué)家們不斷地對(duì)螢火蟲(chóng)發(fā)光物質(zhì)本質(zhì)進(jìn)行探索和查找。 1942年，美國(guó)約翰霍普金斯大學(xué)麥科勒-普拉特研究所(The McCollum-Pratt Institute and the Department of Biology, Johns Hopkins University)的McElory發(fā)現(xiàn)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)直接參與了螢火蟲(chóng)發(fā)光反應(yīng)[4]。 1954年，McElory等人從發(fā)光的細(xì)菌中提取到了熒光素酶結(jié)晶，由此發(fā)光生物熒光素酶的研究邁上了新的臺(tái)階[5]。 隨后在1956年，Green與McElory等一起第一次從螢火蟲(chóng)中提取得到了較高純度的螢火蟲(chóng)熒光素酶結(jié)晶制劑，自此開(kāi)始了螢火蟲(chóng)熒光素酶在生物學(xué)研究中的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用[6]。

　　除螢火蟲(chóng)類昆蟲(chóng)外，目前在自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種可以發(fā)光的生物，人們對(duì)這些來(lái)源于不同發(fā)光生物的熒光素酶進(jìn)行了提取，并分類為螢火蟲(chóng)熒光素酶(firefly luciferase)、細(xì)菌熒光素酶(bacterial luciferase)和另外一些從發(fā)光甲蟲(chóng)、發(fā)光海洋生物提取的熒光素酶[3]。 螢火蟲(chóng)熒光素酶最早提取于一種北美螢火蟲(chóng)(Photinus pyralis)，目前已在世界各地的螢火蟲(chóng)中提取到螢火蟲(chóng)熒光素酶[3]。

　　細(xì)菌熒光素酶是從明亮發(fā)光桿菌(Photobacterium phosphoreum)、羽田希瓦氏菌(shezoanella hanedai)、夏威夷弧菌(Vibrio harvey)、青�；【�(V.qinhaiensis)、火神弧菌(V. logei)、費(fèi)氏弧菌(V. fischeri)等多種海洋和淡水中的發(fā)光菌中提取獲得的。 在1960年，美國(guó)喬治亞大學(xué)(University of Georgia)的Cormier等研究者從海腎(renilla)中提取了海腎熒光素酶(Renilla reniformis luciferase)，為海腎熒光素酶在科研中的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)[7]。

　　數(shù)十年來(lái)，研究者們一直嘗試將熒光素酶作為一種報(bào)告基因來(lái)研究基因啟動(dòng)子的活性和蛋白質(zhì)之間的相互作用。 早在1988年就有通過(guò)對(duì)熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)的蛋白的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而綜合分析不同處理?xiàng)l件對(duì)基因啟動(dòng)子活性影響[8]。 這就是典型的、利用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)物的特性建立起來(lái)的一種可以對(duì)目的基因轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行定量檢測(cè)的技術(shù)體系[3]。

　　在1990年，經(jīng)過(guò)兩年的研究與發(fā)展形成了一套相對(duì)成熟的熒光素酶生物傳感器技術(shù)，同年其發(fā)明者加入了Promega公司。 經(jīng)過(guò)幾年的潛心研發(fā)，1996年P(guān)romega公司正式發(fā)布了雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)并開(kāi)始銷售相關(guān)檢測(cè)試劑，這種技術(shù)創(chuàng)造性地結(jié)合了螢火蟲(chóng)熒光素酶和海洋腔腸熒光素酶兩種熒光檢測(cè)體系，是熒光素酶技術(shù)在漫長(zhǎng)發(fā)展歷史中的一次重要的突破。 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)與傳統(tǒng)共報(bào)告基因系統(tǒng)相比較，具有更簡(jiǎn)便、高效、快速的特點(diǎn)，因此在分子生物學(xué)諸多領(lǐng)域的研究中得到了應(yīng)用。

　　2 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的基本工作原理

　　理想的報(bào)告基因應(yīng)該具有以下幾個(gè)基本特點(diǎn)：①具有已知且可被克隆驗(yàn)證的全部基因序列; ②報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物在檢測(cè)中要反應(yīng)靈敏，酶活反應(yīng)迅速; ③不與目的研究細(xì)胞中的任何表達(dá)基因相似，否則會(huì)干擾轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的熒光素酶的作用效果[9]; ④報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物有較寬的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍，具有良好的穩(wěn)定性; ⑤報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物不影響目的研究細(xì)胞的正常生理活動(dòng); ⑥報(bào)告基因在目的研究細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物易于檢測(cè)，且能夠按照標(biāo)準(zhǔn)讀取量值。 大部分的報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物通常是酶，可以通過(guò)催化反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大信號(hào)，再以螢光或放射性信號(hào)被檢測(cè)[10]。

　　在幾種熒光素酶中，螢火蟲(chóng)的熒光素酶最適合我們開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究使用的。 大多數(shù)細(xì)菌的熒光素酶最適的活性溫度在15 ℃～25 ℃，溫度超過(guò)25 ℃時(shí)其酶活會(huì)迅速下降，37 ℃下基本全部失活，所以不適合在動(dòng)物細(xì)胞中使用[11]。 相較而言，螢火蟲(chóng)熒光素酶則對(duì)催化溫度要求較低，一般室溫即可，適應(yīng)溫度范圍廣，因此該酶報(bào)告基因常用于各類真核細(xì)胞基因啟動(dòng)子活性的分析與檢測(cè)。 目前，有些新型熒光素酶如Gaussia熒光素酶和Cypridina熒光素酶，它們的基因攜帶了一種分泌信號(hào)肽，表達(dá)產(chǎn)物能分泌到細(xì)胞外，可以在不裂解破碎細(xì)胞的條件下直接檢測(cè)酶活，甚至還能連續(xù)檢測(cè)時(shí)間曲線上報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物的變化，進(jìn)而分析報(bào)告基因的表達(dá)活性變化，此技術(shù)方法適用于高通量篩選[12]。

　　螢火蟲(chóng)熒光素酶是一種可以催化熒光底物發(fā)生反應(yīng)的單亞基特異活性蛋白，分子量為60～64 kDa。 螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的優(yōu)點(diǎn)在于只要完成轉(zhuǎn)錄翻譯，其表達(dá)產(chǎn)物就立刻具有可被檢測(cè)的酶活[3]。 在ATP、二價(jià)鎂離子(Mg2+)、氧氣(O2)等存在的情況下，螢火蟲(chóng)熒光素酶會(huì)催使底物螢火蟲(chóng)熒光素發(fā)生氧化，消耗ATP和O2產(chǎn)生Lucifery1-AMP (adenosine monophosphate，AMP)中間體，氧化的熒光素會(huì)從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)釋放出光子，產(chǎn)生波長(zhǎng)540～600 nm的黃綠色熒光信號(hào)，這類熒光信號(hào)可以通過(guò)發(fā)光檢測(cè)儀或CCD(Charge-coupled Device)相機(jī)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)或捕獲[13]。 但這一生化反應(yīng)過(guò)程比較緩慢，因此在熒光素酶和熒光素底物混合后產(chǎn)生的熒光會(huì)迅速衰減[3]，所以在專業(yè)化的試劑盒中會(huì)通過(guò)添加輔酶A(coenzyme A, CoA)來(lái)提高螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性，加快該熒光反應(yīng)的速度，解決熒光衰減的問(wèn)題，產(chǎn)生連續(xù)的熒光信號(hào)。 除輔酶A外，牛血清蛋白和氨基乙醇等物質(zhì)也具有相同的作用[14]。

　　提取自海洋腔腸動(dòng)物海腎的熒光素酶也是一種可以催化熒光素發(fā)生熒光反應(yīng)的單亞基特異活性蛋白，其分子量為36 kDa。 同螢火蟲(chóng)熒光素酶一樣，該蛋白質(zhì)在完成轉(zhuǎn)錄翻譯后即具有催化活性[15]。 海腎熒光素酶不依賴ATP參與酶促反應(yīng)，在有熒光底物腔腸素(coelenterazine)和O2等反應(yīng)物質(zhì)的條件下，海腎熒光素酶即可催化熒光底物腔腸素發(fā)生氧化，在反應(yīng)過(guò)程會(huì)產(chǎn)生波長(zhǎng)為460～540 nm的藍(lán)色熒光信號(hào)。

　　和螢火蟲(chóng)熒光素酶相似，海腎熒光素酶反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號(hào)也會(huì)在短時(shí)間內(nèi)迅速衰減。 這種報(bào)告基因既可以作為內(nèi)參與螢火蟲(chóng)熒光素酶等其他報(bào)告基因一起組成雙檢測(cè)系統(tǒng)，也可以作為一種單獨(dú)的檢測(cè)系統(tǒng)用于實(shí)驗(yàn)。 天然腔腸素在適宜條件下能夠穿越活細(xì)胞的細(xì)胞膜，與活細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的海腎熒光素酶發(fā)生酶促反應(yīng)產(chǎn)生熒光，因此海腎熒光素酶報(bào)告基因適用于有活細(xì)胞檢測(cè)需求的實(shí)驗(yàn)[11]。

　　Promega公司是最早將螢火蟲(chóng)熒光素與海洋腔腸熒光素酶兩種不同熒光檢測(cè)體系相結(jié)合提供雙熒光素報(bào)告基因系統(tǒng)的生物制劑公司，該檢測(cè)系統(tǒng)是一種含有內(nèi)參、可歸一化處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、分析實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的方案[16]。 螢火蟲(chóng)熒光素酶和海洋腔腸熒光素酶檢測(cè)到的是具有不同特征的數(shù)據(jù)，歸一化處理可以使這些數(shù)據(jù)變得具有可比性的同時(shí)又保留一定的相對(duì)關(guān)系。 即在實(shí)驗(yàn)中可以通過(guò)設(shè)置合理的內(nèi)參，讓實(shí)驗(yàn)預(yù)處理過(guò)程得到的沒(méi)有可比性的數(shù)據(jù)得到一定的限制，能夠?qū)φ諈⒄瘴镞M(jìn)行計(jì)算，進(jìn)而消除各種實(shí)驗(yàn)差異如細(xì)胞數(shù)、轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞狀態(tài)、裂解效率、檢測(cè)溫度、時(shí)間等因素帶來(lái)的影響[17]。

　　早期的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)需要裂解細(xì)胞，并先后完成兩個(gè)生物熒光反應(yīng)的定量檢測(cè)，再對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，以達(dá)到對(duì)兩個(gè)同時(shí)表達(dá)的報(bào)告基因的表達(dá)活性進(jìn)行檢測(cè)的目的[18]‍‌‍‍‌‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‍‍‌‍‌‍‌‍‌‍‍‌‍‍‍‍‍‍‍‍‍‌‍‍‌‍‍‌‍‌‍‌‍。 實(shí)驗(yàn)步驟是首先將構(gòu)建好的、帶有目的基因啟動(dòng)子的報(bào)告基因載體和內(nèi)參載體共轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，檢測(cè)熒光時(shí)要用裂解液將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行破碎裂解，然后加入螢火蟲(chóng)熒光素與螢火蟲(chóng)熒光素酶發(fā)生熒光反應(yīng)。 隨后，用熒光檢測(cè)工具對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)完成后還需淬滅該熒光反應(yīng)，再加入腔腸素與海腎熒光素酶發(fā)生熒光反應(yīng)，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度[17]。 其中螢火蟲(chóng)熒光素酶作為主報(bào)告基因，其表達(dá)水平隨外界的處理而發(fā)生變化，海腎熒光素酶作為內(nèi)參報(bào)告基因，其表達(dá)水平一般不會(huì)隨外界處理而發(fā)生變化[18]。

　　目前，Thermo公司研發(fā)了一種比較便捷的雙分泌型螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)，其選用的是Gaussia分泌型熒光素酶和Cypridina分泌型熒光素酶[19]。 這兩種酶均為分泌蛋白，在表達(dá)過(guò)程中會(huì)通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌到細(xì)胞外，因此實(shí)驗(yàn)時(shí)不需要裂解細(xì)胞，取培養(yǎng)液上清就能進(jìn)行熒光檢測(cè)。 但是這兩種酶的熒光信號(hào)波長(zhǎng)相似，一起檢測(cè)的話難以分辨，一般要將測(cè)試樣品分為相同的兩組再分別用不同的熒光素底物對(duì)酶活性進(jìn)行檢測(cè)，借此進(jìn)行區(qū)分。 這種檢測(cè)技術(shù)不用考慮熒光素酶在細(xì)胞內(nèi)底物的影響，比螢火蟲(chóng)熒光素酶有更高的檢測(cè)靈敏度和更廣的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍[20]。

　　3 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)在家蠶基因啟動(dòng)子研究中的應(yīng)用

　　在1995年，國(guó)內(nèi)就有研究者首先將野生型家蠶BmNPV病毒基因組DNA與克隆帶有熒光素酶基因的pBmL質(zhì)粒進(jìn)行重組，再將重組后的載體轉(zhuǎn)染到家蠶細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，獲得載有熒光素酶基因的重組病毒rBmNPVLu。 研究發(fā)現(xiàn)，該重組病毒帶有的熒光素酶基因能夠在家蠶細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 隨后，將重組病毒注射進(jìn)家蠶幼蟲(chóng)體內(nèi)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與其他病毒基因一樣，熒光素酶基因在家蠶幼蟲(chóng)和蛹中注射重組病毒后的第5天左右表達(dá)最高[21]。

　　3.1 相似性基因啟動(dòng)子活性差異的研究

　　家蠶有3個(gè)BmSDH(Bombyx mori sorbitol dehydrogenase，BmSDH)基因，即BmSDH-1、BmSDH-2a、BmSDH-2b。 其中BmSDH-2a和BmSDH-2b在基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)上都具有很高的相似性，二者可能具有相似的生理功能，而B(niǎo)mSDH-1則存在較大差異。 于是朱娟等人利用PCR技術(shù)克隆這3個(gè)基因的啟動(dòng)子，分別構(gòu)建帶有螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的載體，并與pRL-CMV報(bào)告質(zhì)粒(含海腎熒光素酶報(bào)告基因)共轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，通過(guò)雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)BmSDH基因啟動(dòng)子的活性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BmSDH-2a的啟動(dòng)子活性極顯著高于BmSDH-1和BmSDH-2b[22]。 謝雨辰等人推測(cè)，家蠶卵內(nèi)山梨醇脫氫酶的活性主要來(lái)自BmSDH-2a基因的表達(dá)。 他們利用滯育激素、保幼激素(juvenile hormone，JH)和蛻皮激素(20 -hydroxyecdysone，20 E)處理轉(zhuǎn)染有BmSDH-2a基因啟動(dòng)子(序列長(zhǎng)度1082 bp)的熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的家蠶細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)滯育激素不能調(diào)節(jié)BmSDH基因的表達(dá)，而高濃度的保幼激素和蛻皮激素則會(huì)抑制BmSDH基因的表達(dá)[22]。

　　趙斯斯等人發(fā)現(xiàn)家蠶細(xì)胞色素P450 家族CYP9A19 和CYP9A22 兩個(gè)基因的表達(dá)存在組織特異性，CYP9A19 在中腸、絲腺、脂肪體、馬氏管中均有較高水平的表達(dá); CYP9A22 在中腸、絲腺、馬氏管中有表達(dá)，但在脂肪體中無(wú)表達(dá)。 為了研究這兩2個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，其構(gòu)建了含熒光素酶報(bào)告基因和啟動(dòng)子不同長(zhǎng)度順次缺失片段的重組質(zhì)粒，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)啟動(dòng)子活性。 結(jié)果表明：家蠶CYP9A19 基因起始密碼子游-1492～-1102 bp區(qū)域是重要的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域; CYP9A22 基因啟動(dòng)子起始密碼子上游-1630～-1210 bp這一區(qū)域是重要的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域。 用不同濃度的氟化鈉誘導(dǎo)細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)0.1×10 -3mol/L 的NaF能使熒光素酶活性增強(qiáng)顯著，即0.1×10 -3mol/L NaF能上調(diào)這2個(gè)基因的表達(dá)[15]。

　　3.2 基因啟動(dòng)子序列區(qū)域調(diào)控元件的研究分析

　　謝雨辰等通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)BmSDH-2a基因啟動(dòng)子反應(yīng)元件進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示在BmSDH-2a啟動(dòng)子序列中-355～-674 bp和-674～-1082 bp的兩個(gè)區(qū)域之間存在負(fù)調(diào)控元件[23]。 莊蘭芳等利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)家蠶熱激蛋白hsp70 基因5’端的序列：hsp70 -1～hsp70 -305 和hsp70 -1～hsp70 -538 進(jìn)行比較，結(jié)果顯示片段hsp70 -1～hsp70 -538 的表達(dá)活性是hsp70 -1～hsp70 -305 的1～3倍，并且hsp70 -1～hsp70 -538 除了包含共有的熱激元件(heat shock element，HSE)外，還包含3個(gè)可能的HSE元件[24]。

　　Li等研究者以家蠶為模型，利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證明了20 E信號(hào)傳導(dǎo)的初級(jí)應(yīng)答基因E75 不同亞型介導(dǎo)的蛻皮甾類生物合成與20 E信號(hào)傳導(dǎo)之間存在的調(diào)節(jié)環(huán)路。 結(jié)果顯示，E75 基因的亞型A和C可以直接與Halloween基因啟動(dòng)子區(qū)域中的視黃酸受體相關(guān)反應(yīng)元件結(jié)合，以誘導(dǎo)基因表達(dá)，從而促進(jìn)蛻皮甾類生物合成和發(fā)育提前，而亞型B通過(guò)物理相互作用拮抗亞型A/C對(duì)Halloween基因的轉(zhuǎn)錄活性。 由于20 E差異誘導(dǎo)E75 基因亞型的表達(dá)，因此E75 基因介導(dǎo)的調(diào)節(jié)環(huán)代表了類固醇生成的良好自動(dòng)調(diào)節(jié)，這有助于精確控制發(fā)育時(shí)機(jī)[25]。

　　細(xì)胞自噬的發(fā)生需要在多個(gè)細(xì)胞自噬相關(guān)(autophagy-related, Atg)蛋白的參與下才能完成[26]。 Tian等通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和凝膠遷移等一系列實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，20 E通過(guò)其受體EcR/Usp結(jié)合到關(guān)鍵自噬基因Atg1的啟動(dòng)子區(qū)域反應(yīng)元件誘導(dǎo)其表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生[26]。 顧健健等利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)在已報(bào)道的BmVgP78 M啟動(dòng)子上游利用基因工程連接了一段BrC-Z2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列(BrC-Z2 element，BrC-Z2E)，連接的這段序列可以對(duì)20 E進(jìn)行應(yīng)答并增強(qiáng)該啟動(dòng)子活性[27]。

　　陳恩祥研究發(fā)現(xiàn)，家蠶BmVgR(Bombyx mori vitellogenin receptor)基因的啟動(dòng)子均存在大量的POU結(jié)構(gòu)域，他們利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)和染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了家蠶POU結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子POU-M2能夠結(jié)合到BmVgR啟動(dòng)子上并啟動(dòng)BmVgR的高表達(dá)。 同時(shí)，他們還研究發(fā)現(xiàn)20 E能夠誘導(dǎo)BmVgR的轉(zhuǎn)錄，20 E信號(hào)傳導(dǎo)因子BrC-Z1能夠結(jié)合到POU-M2基因的啟動(dòng)子區(qū)域誘導(dǎo)其表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)BmVgR的表達(dá)[28]。

　　3.3 研究小RNA對(duì)靶向基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

　　小RNA為長(zhǎng)度小于200 nt的非編碼RNA，主要包括微RNA(microRNA，miRNA)、小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和Piwi-interacting RNA(piRNA)等，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控，以發(fā)揮基因沉默的作用。

　　家蠶細(xì)胞質(zhì)多角體病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus，BmCPV)感染家蠶后誘導(dǎo)的胰島素相關(guān)肽結(jié)合蛋白2(Insulin-related peptide-binding protein2，IBP2)基因，可能是小分子RNA miR-278 -3P的靶標(biāo)之一。 Wu等構(gòu)建PmirGLO-IBP2和PmirGLO-IB2P2-mut(突變型)雙熒光素酶報(bào)告基因載體，研究發(fā)現(xiàn)PmirGLO-IBP2和miR-278 -3p模擬物共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，熒光素酶活性顯著降低; 在PmirGLO-IBP2-mut和miR-278 -3p模擬物共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，螢光素酶活性沒(méi)有變化。 這表明，在BmCPV感染后，可高度誘導(dǎo)B. mori IBP2基因的表達(dá)，并且被miR-278 -3p負(fù)調(diào)控[29]。

　　根據(jù)家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleo polyhedrosis virus，BmNPV)感染家蠶后小RNA表達(dá)的變化，姜曉旭預(yù)測(cè)miR-277 -5p可靶向作用于家蠶DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因Dnmt(DNA methyltransferase)，通過(guò)構(gòu)建PmirGLO-Dnmt2和PmirGLO-Dnmt2-mut(突變型)雙熒光素酶報(bào)告基因載體等研究發(fā)現(xiàn)miR-277 -5p對(duì)Dnmt基因表達(dá)具有顯著的抑制作用[30]。

　　此外，雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)也可用于檢測(cè)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中小RNA對(duì)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控。 劉曉等利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)piR-4682(Piwi-interacting RNA-4682)在家蠶精巢、卵巢和血淋巴中表達(dá)量較高。 隨后，研究人員還發(fā)現(xiàn)在piR-4682相同的作用位點(diǎn)存在另一個(gè)miRNA-305，它們均靶向調(diào)控small wing基因，將該基因的CDS(coding sequence)片段構(gòu)建在psiCHECK熒光素酶報(bào)告基因載體上，得到重組載體psiCHECK [small wing]。 piR-4682和miR-305的類似物對(duì)small wing基因的表達(dá)都有一定抑制作用[31]。

　　陳恩祥等篩選出10 個(gè)從卵黃發(fā)生期到卵殼形成期上調(diào)表達(dá)的miRNAs可能參與調(diào)控BmVgR基因的表達(dá)。 他們將BmVgR 3’UTR構(gòu)建至psiCHECKTM-2海腎熒光素酶報(bào)告基因載體中，然后用這些miRNA類似物(mimic)處理發(fā)現(xiàn)其中兩個(gè)miRNAs分別使熒光素酶活性降低了33.4%和38.4%，當(dāng)兩種miRNAs同時(shí)存在時(shí)抑制作用更強(qiáng)，說(shuō)明它們可能通過(guò)結(jié)合BmVgR 3’UTR上的作用位點(diǎn)來(lái)調(diào)控BmVgR基因的表達(dá)[28]。

　　4 啟動(dòng)子活性研究系統(tǒng)的發(fā)展與展望

　　目前而言，啟動(dòng)子活性的研究還非常依賴報(bào)告基因系統(tǒng)技術(shù)的發(fā)展，而熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)較其他報(bào)告基因系統(tǒng)具有更多的優(yōu)點(diǎn)和可操作性。 同時(shí)也得益于生物技術(shù)和科學(xué)的飛快發(fā)展，螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)將會(huì)擁有更多的提升和進(jìn)步空間。 熒光素酶報(bào)告基因在應(yīng)用過(guò)程中有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：(1)在使用過(guò)程中不涉及放射性，使用安全污染; (2)熒光素酶檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)，比CAT(cat reporter assay)等其他報(bào)告基因檢測(cè)速度更快，靈敏度高將近100～1000倍[32]; (3)樣品檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單，操作方便; (4)比顯微鏡檢測(cè)熒光更靈敏，沒(méi)有非特異性激發(fā)光干擾，信噪比高不易受底物影響; (5)熒光素酶的半衰期短[33]; (6)檢測(cè)濃度線性范圍廣，只要熒光素酶的濃度在10-16mol/L(10pg/L)到10-8mol/L(1mg/L)內(nèi)均合適檢測(cè)[32]。

　　但雙熒光素酶報(bào)告基因在應(yīng)用過(guò)程中也有諸多注意事項(xiàng)，例如：(1)為了良好的測(cè)定效果，在雙熒光素酶測(cè)試試劑與測(cè)試樣品混合到測(cè)定的這段時(shí)間要保持一致，避免過(guò)長(zhǎng)地停滯(要在1～2 s時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)定); (2)Renilla熒光素酶檢測(cè)液不能長(zhǎng)期保留，配制后要立即使用; (3)熒光素底物反應(yīng)液配制后不能反復(fù)凍融，不同批次的配制液可能存在差異; (4)溫度對(duì)酶有很大影響，要保證樣品和試劑測(cè)定時(shí)完全達(dá)到室溫[17,20]。 不過(guò)，當(dāng)前也有些單個(gè)載體(如pmirGLO)能夠同時(shí)攜帶兩個(gè)不同的熒光素酶報(bào)告基因，還有各種功能性載體能滿足不同實(shí)驗(yàn)的需求。

　　隨著人類對(duì)基因啟動(dòng)子活性研究的逐漸深入，對(duì)于實(shí)驗(yàn)工具和研究體系的要求也會(huì)進(jìn)一步提高，啟動(dòng)子活性研究系統(tǒng)亦會(huì)得到進(jìn)一步的發(fā)展。 隨著科技的進(jìn)步，實(shí)驗(yàn)操作和應(yīng)用技術(shù)也將愈加熟練可控，新型技術(shù)運(yùn)用范圍也會(huì)更加廣泛。 可以預(yù)見(jiàn)，人類的智慧的發(fā)展和科學(xué)技術(shù)的飛躍會(huì)使雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)變得更加便利、高效，從而獲得更廣、更深的發(fā)揮空間，直至該項(xiàng)技術(shù)被更好的啟動(dòng)子活性研究系統(tǒng)所取代。

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　　作者：歐陽(yáng)萃鴻 陳太生 謝曉樂(lè) 李榮松 田 鈴

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