谷氨酸棒桿菌的代謝工程使能技術(shù)研究進展

　　摘要:谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamicum是重要的工業(yè)微生物，尤其是在氨基酸工業(yè)中，每年用于600余萬t氨基酸的生物制造。近年來，谷氨酸棒桿菌代謝工程使能技術(shù)正在不斷完善，不僅加快了細胞工廠的創(chuàng)建和優(yōu)化，拓展了底物譜和產(chǎn)物譜，也推動了谷氨酸棒桿菌的基礎(chǔ)研究，使谷氨酸棒桿菌成為代謝工程的理想底盤細胞。文中綜述了近期針對谷氨酸棒桿菌開發(fā)的代謝工程使能技術(shù)，著重介紹了基于CRISPR的基因組編輯、基因表達調(diào)控、適應(yīng)性進化和生物傳感器等技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用。

　　關(guān)鍵詞:谷氨酸棒桿菌，代謝工程，基因組編輯，表達調(diào)控，適應(yīng)性進化，生物傳感器

　　谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamicum是一株來源于土壤的革蘭氏陽性細菌。20世紀50年代，日本協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社首次開發(fā)了谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的工藝，展示了該菌在氨基酸工業(yè)生產(chǎn)中的巨大潛力[1]。目前，谷氨酸棒桿菌每年被用于生產(chǎn)包括L-谷氨酸和L賴氨酸在內(nèi)的600余萬t氨基酸產(chǎn)品[2]。

　　由于具有生物安全(被美國FDA認定為GRAS，Generallyregardedassafe)、生長速度快、營養(yǎng)需求低、底物譜廣等優(yōu)勢，谷氨酸棒桿菌被認為是生物制造的理想微生物底盤[3]。由于谷氨酸棒桿菌的重要應(yīng)用價值，大量研究致力于開發(fā)可用于該微生物遺傳改造的工具方法。20世紀90年代初，研究者建立了谷氨酸棒桿菌的外源DNA轉(zhuǎn)化方法，使用基于自殺質(zhì)粒的同源重組和轉(zhuǎn)座子插入等方法，實現(xiàn)了基因組的改造。

　　21世紀初，德國和日本的研究人員分別公布了模式菌株ATCC13032的全基因組序列，為 深入理解和系統(tǒng)改造谷氨酸棒桿菌奠定了基礎(chǔ)[4]。代謝工程概念的提出，轉(zhuǎn)變了研究人員長期依賴誘變篩選策略獲得新菌種的育種模式，轉(zhuǎn)而用更理性的方式對谷氨酸棒桿菌的代謝和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行改造和重構(gòu)，極大地加速了谷氨酸棒桿菌的應(yīng)用和基礎(chǔ)研究[5]。目前谷氨酸棒桿菌已被改造用于氨基酸、有機酸、醇類、植物天然產(chǎn)物、蛋白質(zhì)等70余種產(chǎn)品的生物制造，產(chǎn)值超過千億元[2,6]。文中總結(jié)了針對谷氨酸棒桿菌開發(fā)的基因組編輯、基因表達調(diào)控、適應(yīng)性進化、生物傳感器等代謝工程使能技術(shù)，并概述了這些使能技術(shù)在創(chuàng)建谷氨酸棒桿菌細胞工廠中的應(yīng)用。

　　1基于CRISPR的基因組編輯

　　CRISPR/Cas(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedprotein)系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于多種真核和原核生物的基因組編輯[7]。但該系統(tǒng)對谷氨酸棒桿菌的毒性較大，直至2017年，CRISPR/Cas12a(CRISPR/Cpf1)和CRIPSR/Cas9系統(tǒng)才成功應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌的遺傳改造[8-10]。借助CRISPR/Cas系統(tǒng)的高效反篩能力，大片段基因敲除和敲入效率得到提高，操作流程得到簡化[10]。進一步結(jié)合RecT介導(dǎo)的單鏈DNA重組[10-12]和堿基脫氨酶催化的胞嘧啶/腺嘌呤脫氨[13-15]，還可實現(xiàn)染色體的小幅改動和多靶點同時編輯，極大地豐富了谷氨酸棒桿菌的遺傳改造方法，為谷氨酸棒桿菌的代謝工程和合成生物學(xué)研究提供了技術(shù)支持。

　　1.1基因敲除和敲入

　　敲除內(nèi)源基因和敲入異源基因是重構(gòu)微生物代謝和調(diào)控的基本策略�；�于自殺質(zhì)粒pK18mobsacB的經(jīng)典方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌的基因敲除和敲入，幾乎可以在染色體任何位置進行遺傳改造[16]。但是，該方法需要進行兩輪同源重組和兩輪篩選，分別使用抗生素抗性基因和蔗糖致死基因sacB作為篩選標記，后者易被失活，導(dǎo)致反向篩選失效;尤其在敲除對生長造成負面影響的基因時，成功率較低。

　　借助CRISPR/Cas系統(tǒng)，可實現(xiàn)更高效的反向篩選，從而富集被成功編輯的細胞。該方法的原理為，在未編輯的細胞中，Cas蛋白在引導(dǎo)RNA(GuideRNA，gRNA)的引導(dǎo)下，通過識別PAM(Protospaceradjacentmotif，PAM)序列和靶序列，結(jié)合到特定位點，并引入對細菌致死的雙鏈DNA切割(Double-strandedDNAbreak，DSB);而在成功編輯的細胞中，靶位點被改變，因此Cas-gRNA復(fù)合體無法結(jié)合并引入DSB，細胞得以存活[17]。

　　目前應(yīng)用最為廣泛的CRISPR/Cas系統(tǒng)為來自釀膿鏈球菌Streptococcuspyogenes的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。該系統(tǒng)識別NGG的PAM序列，結(jié)合特異性高，切割效率高，非常適合于高GC含量的谷氨酸棒桿菌基因組編輯。但是，研究發(fā)現(xiàn)，攜帶cas9基因的質(zhì)粒難以轉(zhuǎn)化進入谷氨酸棒桿菌，說明谷氨酸棒桿菌對Cas9造成的細胞毒性較為敏感[9]。Jiang等使用新兇手弗朗西斯菌Francisellanovicida的FnCas12a代替Cas9進行基因組編輯。Fncas12a和gRNA的表達盒，以及同源重組所需DNA模板可整合在一個工具質(zhì)粒上，利用該系統(tǒng)，作者實現(xiàn)了最長7.5kb的片段敲除，效率最高達到(46.7±9.4)%[9]。但是，F(xiàn)nCas12a識別富含T的PAM序列TTTN，這導(dǎo)致其在高GC含量的谷氨酸棒桿菌基因組中的靶位點數(shù)量受限。

　　與此同時，Liu等和Peng等分別開發(fā)了適用于谷氨酸棒桿菌的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，實現(xiàn)了高效的大片段敲除和敲入。兩個研究均使用了雙質(zhì)粒系統(tǒng)，分別用于表達cas9和gRNA+同源臂片段[10,18]。以Liu等報道的方法為例，首先，選擇嚴謹?shù)腜tac啟動子減少cas9的泄露表達，克服Cas9的細胞毒性;使用TrrnB終止子替代釀膿鏈球菌gRNA的終止子，提高gRNA轉(zhuǎn)錄終止效率，成功在谷氨酸棒桿菌中構(gòu)建了基于CRISPR/Cas9的反向篩選系統(tǒng)，實現(xiàn)了利用質(zhì)粒攜帶同源臂片段進行基因敲除。

　　但是，敲除過程中仍發(fā)現(xiàn)大量的假陽性轉(zhuǎn)化子，對其中的工具質(zhì)粒進行測序，作者發(fā)現(xiàn)cas9基因內(nèi)部存在失活基因的隨機突變。為降低假陽性率，開發(fā)了雙質(zhì)粒一步共轉(zhuǎn)化結(jié)合平板篩選的策略，盡量縮短工具質(zhì)粒在細胞中的復(fù)制時間，減少cas9基因突變失活的概率。該策略成功提升了基因敲除和敲入效率，在模式菌株ATCC13032中分別達到60%和62.5%，在模式菌株ATCC13869和谷氨酸工業(yè)菌株SL4中也可實現(xiàn)高效的編輯[10]。隨后，有多個研究團隊對基于CRISPR/Cas的谷氨酸棒桿菌基因敲除和敲入方法進行了系統(tǒng)優(yōu)化，不斷提升編輯效率[11,19-22]。

　　1.2單鏈DNA重組

　　谷氨酸棒桿菌中外源雙鏈DNA(DoublestrandedDNA，dsDNA)模板與染色體DNA的同源重組效率較低，Binder等在谷氨酸棒桿菌中表達異源的RecT，實現(xiàn)了外源單鏈DNA(SinglestrandedDNA，ssDNA)模板與染色體DNA高效的同源重組[23]。但是當(dāng)時缺乏有效的突變體篩選方法，只能借助流式細胞分選技術(shù)(Fluorescenceactivatedcellsorting，F(xiàn)ACS)篩選具有特殊表型，如具有熒光信號輸出的突變體。谷氨酸棒桿菌中CRISPR/Cas系統(tǒng)的建立，使得篩選ssDNA重組編輯的突變體成為可能。CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a系統(tǒng)均成功與ssDNA重組相結(jié)合，用于谷氨酸棒桿菌染色體DNA的小幅改動，編輯效率高達100%[8-10,12]。

　　使用該方法，一次可獲得數(shù)百個正確編輯的克隆。因此，該方法被用于構(gòu)建靶基因單個位點的突變文庫。Jiang等和Krumbach等分別利用該方法構(gòu)建了γ-谷�；�激酶和機械敏感通道蛋白MscCG的單氨基酸突變文庫，篩選得到解除產(chǎn)物反饋抑制和外排谷氨酸能力增強的突變體[9,12]。ssDNA重組高效的編輯能力，使得同時編輯多個靶點成為可能。Liu等使用兩條ssDNA，表達兩個gRNA，結(jié)合CRISPR/Cas9篩選，成功實現(xiàn)了雙基因的同時編輯，效率達到40%。但是，雙靶點編輯使獲得的克隆數(shù)大幅下降(約10個)，難以進行更多靶點的同時編輯[10]。

　　1.3堿基編輯

　　上述基因組編輯方法均基于dsDNA或ssDNA模板與染色體DNA的同源重組，以及CRISPR/Cas系統(tǒng)對未發(fā)生同源重組細胞的反向篩選。但是，一方面谷氨酸棒桿菌的同源重組效率較低，另一方面，具有dsDNA切割活性的Cas蛋白對細胞的毒性較強，導(dǎo)致被成功編輯的細胞數(shù)量較少，難以實現(xiàn)多于2個靶點的同時編輯[10]�；�于以上考慮，新興的堿基編輯(Baseediting)技術(shù)被應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌的基因組編輯[13-15]。

　　Komor等和Nishida等分別于2016年開發(fā)了真核細胞的BE(Baseeditor)和Target-AID(Targetactivation-inducedcytidinedeaminase)堿基編輯技術(shù)[24-25]。該技術(shù)將CRISPR/Cas系統(tǒng)的定位功能和堿基脫氨酶的脫氨功能相結(jié)合，使用dsDNA切割功能受損的Cas突變體(dCas或nCas)與堿基脫氨酶的融合蛋白，在gRNA的引導(dǎo)下，將靶位點的胞嘧啶(C)脫氨生成尿嘧啶(U)，U在DNA復(fù)制過程中被DNA聚合酶識別為T，借此實現(xiàn)靶位點C−T的堿基轉(zhuǎn)換(Transversion)。之后，研究者陸續(xù)開發(fā)了可實現(xiàn)A−G轉(zhuǎn)換、C−A顛換(Transition)和C-G顛換的堿基編輯技術(shù)[26-28]。

　　2基因表達調(diào)控

　　2.1啟動子與RBS元件

　　調(diào)控基因的表達水平是常用的代謝工程策略。使用具有不同強度的啟動子和核糖體結(jié)合位點(Ribosomebindingsite，RBS)，可分別在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對靶基因的表達水平進行精細的調(diào)控。Albersmeier等通過對谷氨酸棒桿菌的轉(zhuǎn)錄起始位點進行系統(tǒng)的分析，鑒定了大量內(nèi)源的啟動子，為進一步的啟動子表征和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[32]。

　　Shang等對16個內(nèi)源啟動子進行了表征，這些啟動子可覆蓋31倍的表達強度，利用它們調(diào)控sucCD的表達，可提高L-賴氨酸的產(chǎn)量[33]。Li等基于RNA測序數(shù)據(jù)，對谷氨酸棒桿菌中90個200−500bp的啟動子-5′-UTR序列進行了表達強度表征，鑒定了比常用組成型啟動子Psod-UTR強5倍的啟動子PNCgl1676-UTR，以及受L-甲硫氨酸激活的啟動子PbrnF-UTR和受L-賴氨酸抑制的啟動子PNCgl1202-UTR[34]。

　　王迎春等基于時間序列轉(zhuǎn)錄組篩選到谷氨酸棒桿菌高效的內(nèi)源組成型啟動子PcysK、PgapA和PfumC，其中最強的PcysK啟動子在部分測試菌株中強于IPTG誘導(dǎo)型啟動子Ptac[35]。除內(nèi)源啟動子外，研究者還開發(fā)了大量適用于谷氨酸棒桿菌的異源和合成啟動子。例如，Kortmann等將來自于大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)的T7表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至谷氨酸棒桿菌，實現(xiàn)了靶基因的嚴謹可控和高水平的表達[36]。

　　Yim等利用70bp的隨機序列構(gòu)建了一個合成啟動子文庫，使用綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)作為報告基因，結(jié)合FACS篩選獲得20個具有不同強度的組成型啟動子元件，熒光強度介于100至1200間[37]。Patek等基于谷氨酸棒桿菌啟動子−10區(qū)保守序列和大腸桿菌−35區(qū)保守序列，并在−35區(qū)上游添加一段額外的富含AT的序列，構(gòu)建了4個組成型啟動子文庫。此外，作者還以大腸桿菌的lac啟動子為基礎(chǔ)，對−35區(qū)和−10區(qū)間的17bp進行隨機突變，構(gòu)建了一個誘導(dǎo)型啟動子文庫，誘導(dǎo)強度范圍為7−59倍[38]。

　　2.2CRISPR干擾

　　當(dāng)需要抑制細胞生長必需基因，或者需要研究大量靶基因的表達弱化對細胞生長和代謝的影響時，對靶基因進行編輯將非常困難，且耗時耗力。因此，需要方便、高效的基因表達弱化工具。CRISPR干擾(CRISPRinterference，CRISPRi)技術(shù)是使用DNA切割功能失活的Cas突變體(CatalyticallyinactivatedCas，dCas)，在gRNA的引導(dǎo)下，結(jié)合到靶基因位置，影響RNA聚合酶的結(jié)合，從而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄[48]。

　　Cleto等最先在谷氨酸棒桿菌中開發(fā)了基于CRISPR/dCas9的CRISPRi方法。該方法使用雙質(zhì)粒系統(tǒng)和IPTG誘導(dǎo)型啟動子Ptac控制dCas9和gRNA的表達，以pgi、pck和pyk作為靶基因，當(dāng)靶向基因的非模板鏈時，弱化效率均可達到97%以上，可獲得與基因敲除相似的L-賴氨酸和L-谷氨酸產(chǎn)量提升效果[6]。

　　Park等同樣使用了類似的雙質(zhì)粒系統(tǒng)，分別以四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子和組成型啟動子控制dCas9和gRNA的表達，并通過同時表達兩個gRNA，實現(xiàn)了雙基因的表達弱化[49]，作者使用該方法快速鑒定了谷氨酸棒桿菌中未知的羧酸酯酶編碼基因[50]。該研究團隊隨后構(gòu)建了一個單質(zhì)粒的CRISPRi系統(tǒng)，并在基因工程谷氨酸棒桿菌中通過弱化acn基因提高了丁酸產(chǎn)量[51]，通過弱化idsA基因提高了角鯊烯產(chǎn)量[52]。Gauttam等同樣構(gòu)建了一個單質(zhì)粒CRISPRi系統(tǒng)，但是分別使用四環(huán)素和IPTG誘導(dǎo)型啟動子控制dCas9和gRNA的表達，也可用于雙基因的同時弱化[53]。

　　3適應(yīng)性進化

　　新型的基因組編輯與基因表達調(diào)控技術(shù)提高了研究人員對谷氨酸棒桿菌的代謝改造和調(diào)控能力。但是對于一些遺傳靶點未知或代謝調(diào)控機制復(fù)雜的生物學(xué)表型，難以通過理性的遺傳改造實現(xiàn)。適應(yīng)性進化技術(shù)在此方面有獨特的優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于提高谷氨酸棒桿菌的生長速度、壓力耐受性和底物利用能力等，在提高小分子化合物的合成能力方面也展現(xiàn)出應(yīng)用潛力[57]。

　　3.1直接適應(yīng)性進化

　　在特定條件下直接對菌株進行適應(yīng)性進化是最常用的進化方法，適合于提高菌株的生長速度和壓力耐受性等。生長速度是菌株的一個關(guān)鍵指標，對于代謝工程應(yīng)用十分重要。多個團隊嘗試提高谷氨酸棒桿菌在基本培養(yǎng)基中利用葡萄糖的生長速度[58-60]。例如，Pfeifer等通過適應(yīng)性進化，將谷氨酸棒桿菌的比生長速率提高至0.67h−1，較出發(fā)菌株提高了26%，并鑒定了pyk、fruK和corA等基因的關(guān)鍵突變[59]。Graf等在不含原兒茶酸的培養(yǎng)基中對谷氨酸棒桿菌進行進化，篩選獲得了可在不含原兒茶酸的基本培養(yǎng)基中快速生長的突變株，比生長速度達到0.54h−1[61]。

　　4生物傳感器

　　生物傳感器是一種將生物物質(zhì)濃度轉(zhuǎn)化為電信號、熒光信號等易于檢測的信號的裝置，包含信號識別元件和信號輸出元件，可輔助適應(yīng)性進化，加快進化過程，還可用于高通量篩選、代謝途徑的優(yōu)化與動態(tài)調(diào)控、細胞成像等。常用的生物傳感器主要包括基于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(Transcriptionfactor，TF)、核糖體開關(guān)(Riboswitch)和蛋白質(zhì)相互作用(例如熒光共振能量轉(zhuǎn)移Försterresonanceenergy transfer，F(xiàn)RET)的生物傳感器(表1)[71]。最近，研究者還開發(fā)了基于稀有密碼子的新型生物傳感器，并應(yīng)用于氨基酸生產(chǎn)菌的高通量篩選[72]。

　　5總結(jié)與展望

　　新型的基因組編輯、基因表達調(diào)控、適應(yīng)性進化、生物傳感器等代謝工程和合成生物學(xué)使能技術(shù)的快速發(fā)展，顯著加快了谷氨酸棒桿菌細胞工廠的構(gòu)建和優(yōu)化。

　　生物基因研究論文投稿刊物：《生物工程學(xué)報》(月刊)1985年創(chuàng)刊，雜志是國內(nèi)外公開發(fā)行的全國性學(xué)術(shù)期刊,由中國科學(xué)院微生物研究所和中國微生物學(xué)會共同主辦。主要報道生物工程研究的新發(fā)展、新成果、新技術(shù)。刊登的內(nèi)容包括：基因工程、細胞工程、酶工程、生化工程、組織工程、生物信息、生物制藥、生物芯片等。

　　基于此，谷氨酸棒桿菌仍是氨基酸生物制造的核心菌種，在其他大宗化學(xué)品、生物燃料、天然產(chǎn)物、蛋白質(zhì)等產(chǎn)品的生物制造中，也扮演著越來越重要的角色。但是，與另外兩個常用的底盤微生物大腸桿菌和釀酒酵母Saccharomycescerevisiae相比，谷氨酸棒桿菌的多基因或多靶點編輯工具仍需提升，缺乏MAGE(Multiplexautomatedgenomeengineering)[94]或eMAGE(EukaryoticMAGE)[95]等在染色體上直接產(chǎn)生遺傳多樣性的高效技術(shù)。

　　另一方面，谷氨酸棒桿菌基因組的3000余基因中仍有超過40%的基因功能未知或缺乏實驗證據(jù)。因此，為更好地挖掘谷氨酸棒桿菌的代謝潛力，進一步提升生物制造的效率，需要進一步優(yōu)化代謝工程使能技術(shù)，結(jié)合自動化實驗裝備，進行高通量的功能基因組研究，解析谷氨酸棒桿菌優(yōu)良生物學(xué)和工業(yè)性狀背后的遺傳和分子機制。另一方面，亟需完善谷氨酸棒桿菌的代謝模型和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為菌株構(gòu)建和優(yōu)化提供更精確的預(yù)測和設(shè)計。

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　　作者：王鈺1,2，鄭平1,2，孫際賓1,2

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