本文摘要：摘要：青枯病是一種嚴重危害生姜種植的毀滅性土傳細菌病害，明確引起生姜青枯病的病原菌并對其進行快速檢測，對生姜青枯病早期診斷與有效防控具有重要意義.本研究采用組織分離法，對湖北省恩施生姜病樣上的病菌進行分離純化，通過形態(tài)學特征、致病性測定和分
摘要：青枯病是一種嚴重危害生姜種植的毀滅性土傳細菌病害，明確引起生姜青枯病的病原菌并對其進行快速檢測，對生姜青枯病早期診斷與有效防控具有重要意義.本研究采用組織分離法，對湖北省恩施生姜病樣上的病菌進行分離純化，通過形態(tài)學特征、致病性測定和分子生物學的方法對其進行鑒定;篩選并驗證了生姜青枯病菌的特異性引物，優(yōu)化生姜青枯病病原菌的PCR檢測方法，并對該方法進行特異性和靈敏度驗證，運用該方法對生姜植株和土壤的病原菌進行檢測.結(jié)果表明，試驗分離純化得到了10株培養(yǎng)性狀一致的菌株，從形態(tài)學特征、致病性測定和分子生物學方面，將代表菌株ES202023鑒定為青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum);引物21F/21R從所獲菌株中擴增出長度為125bp的特異性目的條帶;通過優(yōu)化后的PCR體系(25μL：2×TaqMasterPCRMix12.5μL，21F/21R0.5μL，退火溫度61.1℃，30個循環(huán))，使病原菌的檢測靈敏度達到10-2ng/μL，且可以在感病植株及土壤中檢測到病原菌.本研究建立的特異性PCR快速檢測方法，對生姜青枯病的田間早期預警、姜種帶菌檢測和綠色防控具有指導作用.
關鍵詞：生姜;青枯病;分離鑒定;PCR檢測方法
生姜(ZingiberofficinaleRosc.)為姜科(Zingiberaceae)多年生宿根性草本植物，是主要香辛保健蔬菜之一，也是醫(yī)藥及化工產(chǎn)品的重要原料[1].我國生姜栽培歷史悠久，是世界上生姜生產(chǎn)、出口、消費第一大國[2].
近年來，我國生姜種植面積不斷增大，但生姜產(chǎn)區(qū)連年重茬，各種病害日益嚴重.其中，生姜青枯病又稱姜瘟病，是一種世界性的土傳細菌病害，嚴重制約了生姜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3].青枯病是一種嚴重危害作物種植生產(chǎn)的毀滅性土傳細菌病害，其病原菌寄主范圍廣，可侵染包括生姜、番茄、辣椒、茄子、馬鈴薯等50個科的400多種植物[4-5].
生姜青枯病的病原菌形態(tài)結(jié)構(gòu)、種內(nèi)分化和致病機理復雜[6]，其發(fā)生與流行受土壤濕度、溫度和種植方式等多種因素的影響[7]，目前尚無理想的防治手段和生姜抗病品種[8].前人采用組織分離法已對安徽[9]、四川[10]、海南[11]等地的生姜青枯病病原菌進行過鑒定.湖北省作為生姜的重要種植地區(qū)，近年來青枯病頻發(fā)，田間發(fā)病率在30%～50%，嚴重時甚至絕收.
然而，關于湖北生姜青枯病病原菌的研究仍鮮有報道.為此，明確湖北生姜青枯病的病原菌，可為該病有效防治提供基礎.為防止帶菌姜種和帶菌土壤引起的生姜青枯病的傳播，建立快速準確的生姜青枯病菌檢測方法對生姜種植過程重大土傳病害的早期檢測與預警防控有重要意義.傳統(tǒng)的青枯病病原菌檢測包括癥狀觀察、分離純化等手段，操作復雜且時效性差，還極易與其他病害混淆，難以快速準確鑒定，不能滿足生產(chǎn)實際的需要[12].分子檢測方法已成為當前主要的病原菌檢測手段，不僅能應用于田間病害的早期診斷預警，而且還能滿足種子潛伏期檢疫的要求[13].PCR檢測技術是最常用的植物病原菌分子檢測方法，具有成本低、靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，已在植物組織及土壤病原菌檢測方面得到了廣泛運用[14].
例如，鐘鑫等運用普通PCR技術分子體系在抗病品種接種1～5d后檢測出西瓜枯萎病病菌[15]，Martínez-Espinoza等利用PCR技術在玉米染病早期或者無癥狀感染時檢測玉米瘤黑粉病病菌[16]，張凱東等采用PCR和序列測定技術對柑桔葉樣進行了黃龍病菌檢測等[17].迄今為止，生姜青枯病的PCR檢測技術尚未見報道.為了明確引起湖北恩施地區(qū)生姜青枯病的病原菌以及建立快速準確的檢測方法，以取自湖北恩施地區(qū)的生姜病樣進行分離純化，基于形態(tài)學特征、致病性測定和分子生物學的方法對其進行鑒定.檢索查詢國內(nèi)外關于青枯菌的分子檢測報道，篩選了青枯雷爾氏菌的特異性擴增引物，優(yōu)化了PCR快速檢測方法，旨在為生姜青枯病害的田間早期預警、姜種檢疫診斷及綠色防控提供技術依據(jù).
1材料與方法
1.1材料
疑似生姜青枯病病株采自湖北恩施(109°41′48″E，30°03′30″N)，健康生姜植株種于長江大學玻璃溫室中.生姜青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)標準菌株由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供;番茄青枯菌(R.solanacearum)、土豆青枯菌(R.solanacearum)、藿香青枯菌(R.solanacearum)、煙草青枯菌(R.solanacearum)、變黃假單胞菌(Pseudomonasflavescens)、臺灣假單胞菌(Pseudomonastaiwanensis)、谷關假單胞菌(Pseudomonasentomophila)、大黃魚致病性香魚假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)、胡蘿卜軟腐果膠桿菌(Pectobacteriumaroidearum)、路氏腸桿菌(Enterobacterludwigii)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacterseifertii)、成團泛菌(Pantoeaagglomerans)、解鳥氨酸拉烏爾菌(Raoultellaornithinolytica)均由長江大學香辛作物研究院實驗室保存.
1.2方法
1.2.1生姜病樣采集與病原菌分離
2019年8月于湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩縣生姜種植基地采集具有典型青枯病癥狀的生姜植株，將病樣帶回實驗室進行病原菌分離.生姜青枯病病原菌的分離參照任欣正等[18]的方法，略有改進.用無菌手術刀截取生姜病株根莖部的病健交界處組織，剝?nèi)ネ獗砥�，置于裝有50mL無菌水的三角瓶中，37℃、150r/min振蕩，待無菌水稍有渾濁后，用接種環(huán)蘸取少量液體，在TTC培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，長出的菌落用于后續(xù)的致病力測定.
1.2.2致病力測定
將分離得到的病菌在TTC培養(yǎng)基平板上重新劃線，30℃培養(yǎng)36h后挑取單菌落在TTC液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min條件下培養(yǎng)24h，調(diào)整細菌濃度為107cfu/mL后進行致病力測定試驗.選取生長60d且長勢一致的盆栽生姜苗，用無菌的4號注射器吸取1mL菌液，采用莖基部注射接種法在生姜植株的莖基部進行接種，以無菌水為陰性對照，每個處理重復接種20盆.
在接種第3d后調(diào)查發(fā)病情況，在接種第15d后計算病情指數(shù).青枯病病情共分成5個等級[19].0級：植株長勢健康;1級：1個葉片枯萎;2級：2至3個葉片枯萎;3級：3片(含)以上葉片枯萎;4級：植株死亡.統(tǒng)計病株率及病情指數(shù)，判定致病力強弱.根據(jù)柯赫氏法則重新對接種發(fā)病的生姜植株進行病原分離鑒定，觀察與原分離病菌是否一致.選取致病力強的菌株進行病原菌的下一步鑒定.
1.2.3生姜青枯病病原菌鑒定
形態(tài)學鑒定：參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[20]，將平板上菌落顏色和形狀與青枯雷爾氏菌相似的單菌落重新接到TTC平板上，觀察菌落的形態(tài)特征，并進行革蘭氏染色，在光學顯微和掃描電鏡下觀測其形態(tài)特征.分子生物學鑒定：采用CTAB/NaCl法提取菌株基因組DNA，以提取的DNA為模板，通過細菌16SrDNA通用引物16S-F/16S-R(16S-F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，16S-R：5-TCGGCTAC-CTTGTTACGACAC-3，由武漢華大基因科技服務有限公司合成)進行PCR擴增，標準菌株為陽性對照，無菌去離子水為陰性對照.
PCR擴增程序為：94℃預變性5min;94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，72℃補齊10min，循環(huán)30次.擴增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，送武漢華大基因科技服務有限公司進行雙向測序，并對測序的結(jié)果進行拼接，得到菌株的16SrDNA擴增片段的序列信息，并將其在NCBI上進行BLAST比對分析.另外，在NCBI上選取不同細菌的16SrDNA序列，使用MEGA7.0軟件，通過鄰接法(neighbor-joiningmethod)來構(gòu)建分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹.
生理小種和生物型鑒定：根據(jù)菌株對不同寄主的致病性確定所屬的生理小種[21].選取生長10d的生姜、番茄、茄子、馬鈴薯、煙草和辣椒的健康植株，采用莖基部接種法，在植株莖基部注射濃度為107cfu/mL的菌液，以注射無菌水為陰性對照，每種植物重復接種10盆.在接種后的第7d記錄發(fā)病植株數(shù)量，并以發(fā)病率為指標來統(tǒng)計青枯菌對不同植物的致病力.參考呂志強等[22]的青枯雷爾氏菌生物型劃分標準，分別以乳糖、麥芽糖、纖維二糖、甘露醇、山梨醇和甜醇作為培養(yǎng)基的碳源，根據(jù)菌株對碳源的利用情況來確定生物型.
1.2.4生姜青枯病病原菌
PCR檢測方法的建立及優(yōu)化根據(jù)國內(nèi)外關于生姜青枯病病原菌的分子檢測報道，篩選出特異性引物21R/21F(21F：5-CGACGCTGACGAAGGGACTC-3;21R：5-CTGACACGGCAAGCGCTCA-3)[23]，引物由武漢華大基因科技服務有限公司合成.對影響PCR方法的退火溫度、延伸時間及循環(huán)次數(shù)重要因素進行優(yōu)化.
選用不同的退火溫度58.8℃設計PCR反應程序，共設計58℃，58.2℃，58.8℃，59.8℃，61.1℃，62.8℃，64.8℃，66.6℃，67.9℃，69.0℃，69.6℃，70℃12個溫度梯度，3個延伸時間分別設為30s，45s和1min，3個循環(huán)次數(shù)分別設為30，35，40次，每個因素設置3個重復.結(jié)果按照病原菌擴增的特異性和敏感性，即條帶的強弱、雜帶的有無，并結(jié)合AlphalmaherTM2200軟件進行綜合評價[24].
1.2.5PCR反應特異性和靈敏度檢測
特異性檢測：對分離得到的生姜青枯菌基因組DNA，分別以番茄青枯菌、土豆青枯菌、藿香青枯菌等12株菌株基因組DNA為對照，利用優(yōu)化好的PCR反應方法進行擴增.根據(jù)電泳條帶的有無檢測生姜青枯菌引物的特異性，并且對陽性樣品的擴增產(chǎn)物進行雙向測序，測序結(jié)果進行BLAST比對分析.試驗設置3次重復.靈敏度檢測：利用超微量紫外分光光度計測定青枯菌模版DNA純度及濃度，將模板濃度稀釋至10，1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5和10-6ng/μL共8個濃度梯度，使用優(yōu)化后的PCR方法進行PCR擴增，取5μL擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相.試驗設置3次重復.
2結(jié)果與分析
2.1生姜青枯病病原菌的分離
從采集具有典型青枯病癥狀的生姜植株中分離得到了10株培養(yǎng)性狀一致的菌株，菌落為圓形或梭形，菌體乳白色，表面光滑，略有隆起.選取3個典型菌株ES202021，ES202022和ES202023作為代表菌株進行后續(xù)致病力測定.
2.2致病性測定
以活化1d的ES202021，ES202022和ES202023菌懸液接種到培養(yǎng)60d的健康生姜苗，以接種無菌水為空白對照，觀察并記錄生姜植株的發(fā)病情況.結(jié)果顯示，接種菌株后生姜葉片邊緣開始內(nèi)卷下垂、葉尖變成黃色，然后擴展至整個葉片，導致葉片逐漸枯萎，最后整個植株死亡，這與所采集的生姜發(fā)病植株的發(fā)病癥狀表現(xiàn)一致，而對照植株完全不發(fā)病.
15d后調(diào)查病情指數(shù)，結(jié)果顯示，接種菌株ES202021，ES202022和ES202023的生姜苗病情指數(shù)分別為35.2，34.1和38.2，平均病情指數(shù)超過30.0.3個菌株均具有強致病力，其中ES202023致病力最強，選取其為代表菌株進行下一步的鑒定.分別收集接種菌株ES202023和無菌水培養(yǎng)5d后的生姜植株組織，進行重新分離純化鑒定，其試驗結(jié)果表明，在接種菌株的生姜植株組織中分離純化獲得的病菌與接種菌株ES202023相同，而接種無菌水的空白對照組織樣本中沒有分離到接種病原菌，符合柯赫氏致病性驗證法則.
3結(jié)論與討論
生姜因長期采用無性繁殖的方式重茬種植，導致多種土壤病原菌不斷積累，包括生姜青枯病在內(nèi)的重大土傳病害普遍發(fā)生，嚴重威脅廣大姜農(nóng)的經(jīng)濟收入[26].盡管自20世紀60年代開始，陳莉等[9]、戢俊臣等[10]和趙志祥等[11]對不同地區(qū)生姜青枯病病原菌進行了研究，但是有關湖北省內(nèi)的生姜青枯病病原菌的研究卻鮮有報道.本研究從湖北省恩施土家族苗族自治州的生姜青枯病病株中分離得到了菌株ES202023，經(jīng)致病性測定、形態(tài)學特征和分子生物學的鑒定，證明湖北恩施生姜青枯病的病原菌為青枯雷爾氏菌(R.solanacearum)，與前人研究結(jié)果一致. 隨著病原菌檢測技術的不斷發(fā)展，PCR分子檢測技術已經(jīng)較為成熟，在植物病原菌的檢疫和田間預警中得到廣泛的應用，為植物病害的有效防控提供了技術支持.
在植物病原菌的快速分子檢測上，李華偉等[27]根據(jù)甘薯薯瘟病菌的特異基因(orf428)序列設計了重組酶聚合酶等擴增(RPA)引物，建立了能夠快速檢測甘薯薯瘟病菌的RPA方法.李得銘等[28]對番茄青枯菌進行分離，并通過篩選3對特異性引物，建立三重PCR，檢測番茄植株和土壤中的青枯菌.張麗芳等[29]以煙草青枯菌和其他2個煙草病原菌的基因組DNA為模板，分別設計3對特異性引物，建立了能同時檢測3種病害的多重PCR方法.以上研究表明，利用單一或多重的PCR技術方法能有效檢測病原菌的存在.
園藝師評職知識： 發(fā)表植物園藝論文可以評農(nóng)藝師嗎
本研究構(gòu)建的生姜青枯菌PCR快速分子檢測技術，其PCR快速檢測技術方法特異性強，能排除番茄青枯菌、土豆青枯菌、藿香青枯菌等不同生理小種的干擾.通過優(yōu)化檢測引物PCR反應條件，靈敏度達到10-2ng/μL，可以滿足生姜生產(chǎn)中青枯菌檢測的需求.該方法不僅能檢測植株的帶菌情況，還可用于田間土壤青枯菌的檢測，有助于生姜青枯病田間早期預警檢測，為生姜青枯病的綠色防控提供科學依據(jù).
參考文獻：
[1]吳中軍，陳澤雄，劉奕清.不同移栽基質(zhì)對生姜試管苗生長的影響[J].西南大學學報(自然科學版)，2010，32(4)：57-60.
[2]吳曼，趙幫宏，宗義湘.世界生姜生產(chǎn)布局與貿(mào)易格局分析[J].北方園藝，2019(10)：141-150.
[3]SINGHR.IntegratedManagementofBacterialWiltofGingerIncitedbyRalstoniasolanacearum[J].InternationalJour-nalofPlantSciences，2020，15(2)：86-91.
[4]DASILVAXAVIERA，DEALMEIDAJCF，DEMELOAG，etal.CharacterizationofCRISPR-CasSystemsintheRalstoniasolanacearumSpeciesComplex[J].MolecularPlantPathology，2019，20(2)：223-239.
作者：張玲玲1，周潔1，秦曼麗1，周弦1，吳林2，劉奕清3
轉(zhuǎn)載請注明來自發(fā)表學術論文網(wǎng)：http:///nylw/28219.html
