本文摘要:摘要:為探究Toll基因在小菜蛾先天免疫中的功能,對克隆鑒定的Toll基因序列進行生物信息學(xué)分析,利用實時熒光定量PCR檢測Toll基因的時空表達模式及微生物侵染響應(yīng)模式,體外驗證其在微生物結(jié)合、病原相關(guān)分子模式(athogenassociatedmolecularpattern,PAMP)結(jié)合、細菌
摘要:為探究Toll基因在小菜蛾先天免疫中的功能,對克隆鑒定的Toll基因序列進行生物信息學(xué)分析,利用實時熒光定量PCR檢測Toll基因的時空表達模式及微生物侵染響應(yīng)模式,體外驗證其在微生物結(jié)合、病原相關(guān)分子模式(athogenassociatedmolecularpattern,PAMP)結(jié)合、細菌凝集等方面的功能。結(jié)果表明:Toll基因全長2313bp,編碼770個氨基酸,預(yù)測Toll6蛋白具有富含亮氨酸重復(fù)序列的LRR胞外區(qū)、跨膜區(qū)和TIR胞內(nèi)等典型Toll受體家族特征;Toll基因在不同發(fā)育階段及不同組織中均有表達,其中成蟲期表達量最高,齡幼蟲次之,在齡幼蟲中腸表達量最高;此外,蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis菌株Bt8010侵染小菜蛾齡幼蟲6h后,Toll基因表達被顯著抑制,而黏質(zhì)沙雷氏菌Serratiamarcescens菌株SmPXG6侵染小菜蛾齡幼蟲12h時,Toll基因表達被顯著上調(diào),18h后Toll基因表達被顯著抑制;蛋白體外功能驗證表明Toll蛋白不僅與細菌和真菌具有直接結(jié)合能力,還能與肽聚糖和脂多糖結(jié)合,但不具備細菌凝集功能。表明Toll蛋白可能作為模式識別受體直接識別并結(jié)合入侵病原微生物表面的PAMP,啟動小菜蛾對入侵病原微生物的先天免疫防御,且對不同微生物可能具有不同的響應(yīng)機制。
關(guān)鍵詞:小菜蛾;Toll受體;先天免疫;模式識別受體;基因表達;病原菌侵染
免疫系統(tǒng)對昆蟲適應(yīng)細菌、真菌、病毒以及真核寄生蟲等的復(fù)雜環(huán)境至關(guān)重要(Zhangetal,2019),是昆蟲生存和繁衍的前提與保障。昆蟲不具備高等脊椎動物的獲得性免疫系統(tǒng),先天免疫系統(tǒng)成為其抵御病原微生物感染的重要防御體系。Toll通路是與先天免疫有關(guān)的主要信號通路之一,其響應(yīng)真菌和革蘭氏陽性菌的感染,在免疫防御中具有重要作用(Wangetal,2018)。
昆蟲Toll受體是Toll通路中的關(guān)鍵效應(yīng)因子,能夠識別胞外特異性配體并引發(fā)胞內(nèi)信號通路的級聯(lián)反應(yīng),在維持Toll信號通路的正常免疫應(yīng)答及抵抗入侵病原微生物的過程中扮演著重要角色(廖文麗等,2017)。闡明Toll受體的功能是理解昆蟲Toll信號通路以及相關(guān)免疫防御機制的基礎(chǔ)。Toll受體最早在果蠅中發(fā)現(xiàn),并被鑒定為一種跨膜受體,不僅參與機體發(fā)育,而且參與對真菌和革蘭氏陽性細菌的免疫應(yīng)答(Nicolasetal,1996)。
人體內(nèi)鑒定得到10個Toll樣受體(olllikereceptor,TLR),其作為典型的模式識別受體(patternrecognitionreceptor,PRR),與特定病原相關(guān)分子模式(athogenassociatedmolecularpattern,PAMP)直接結(jié)合進而誘導(dǎo)相應(yīng)的免疫防御響應(yīng)(Takeda&Akira,2005)。在甲殼類動物中,Toll受體發(fā)揮免疫功能的作用方式因物種不同而異,如日本囊對蝦MarsupenaeusjaponicasToll受體與哺乳動物相似,作為PRR激活Toll信號通路(Sunetal,2017);日本沼蝦MacrobrachiumnipponenseToll受體既可作為PRR識別外源入侵物,又可作為細胞因子受體與活化的內(nèi)源性配體結(jié)合(Panetal,201)。
在昆蟲中,Toll受體不僅可以作為跨膜受體與活化的神經(jīng)生長因子同源物Spätzle配體結(jié)合,激活胞內(nèi)Toll信號通路,調(diào)控抗菌肽的表達(Nieetal,2018),而且昆蟲Toll受體還能直接作為PRR與特定的PAMP結(jié)合,發(fā)揮免疫學(xué)功能(Nakamotoetal,2012;廖文麗等,2017)。
昆蟲由于其物種多樣性、生存環(huán)境的多態(tài)性,其免疫功能也會發(fā)生物種分化,具備種屬的特異性,因此從昆蟲Toll受體發(fā)揮免疫功能作用方式探究其誘導(dǎo)的免疫防御反應(yīng)對于闡明昆蟲Toll受體功能及其介導(dǎo)的免疫防御機制具有重要意義。小菜蛾P(guān)lutellaxylostella是世界性害蟲之一,對十字花科蔬菜具有極強的破壞性,其抗藥性高,已對包括Bt在內(nèi)的所有用于防治的殺蟲劑均產(chǎn)生了抗性(徐艷聆等,2006;Furlongetal.,2013)。生物農(nóng)藥是未來農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的趨勢,但小菜蛾的免疫防御反應(yīng)能夠降低或者延緩微生物農(nóng)藥的作用效率(彭露等,2015)。
因此,從小菜蛾抵御入侵病原微生物的免疫防御系統(tǒng)——Toll通路入手,探究Toll受體的免疫應(yīng)答機制對于生物農(nóng)藥的改良與新型生物農(nóng)藥的開發(fā)具有重要意義。Xiaetal(2015)通過比較基因組學(xué)從小菜蛾基因組中鑒定到個Toll受體基因;Linetal(2018)研究表明小菜蛾Toll和Toll10基因參與細菌和真菌的免疫應(yīng)答,但Toll基因在先天免疫系統(tǒng)中所扮演的角色及其是否與病原體直接結(jié)合未見報道。因此,本研究通過克隆表達小菜蛾Toll基因,研究其表達模式和免疫防御響應(yīng),并在體外驗證其在PAMP結(jié)合、微生物結(jié)合及細菌凝集等方面的功能,以期為后續(xù)深入探究Toll受體在小菜蛾先天免疫反應(yīng)中的功能奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
供試昆蟲和菌種:供試小菜蛾為以人工飼料飼養(yǎng)的小菜蛾Bt敏感品系SLss,由中國科學(xué)院動物研究所提供,于福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所人工氣候室內(nèi)飼養(yǎng),人工氣候室溫度(25±2)°C、相對濕度70%~80%、光照周期為16L:8D,幼蟲用人工飼料飼喂,成蟲用10%蜂蜜水飼喂。供試大腸桿菌Escherichiacoli菌株BL21、大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α、含pGTf2質(zhì)粒的大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)、畢赤酵母Pichiapastoris、蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis菌株Bt8010、金黃葡萄球菌Staphylococcusaureus、腸桿菌Enterobactersp.菌株EbPXG5和黏質(zhì)沙雷氏菌Serratiamarcescens菌株SmPXG6,均由福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所保存。
培養(yǎng)基:LB(LuriaBertani)液體培養(yǎng)基成分為5g酵母抽提物、10g蛋白胨、10g氯化鈉,去離子水定容至1L;LB固體培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉15g;酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeastextractpeptonedextrosemedium,YPD)成分為10g酵母抽提物、20g蛋白胨、20g葡萄糖,去離子水定容至1L。
試劑:Trizol,美國Invitrogen公司;膠回收試劑盒,瑞士Omega公司;PhantaMax高保真酶(P505)、2×PhantaMaxuffer等PCR試劑,南京諾唯贊生物科技股份有限公司;TOPOBlunt平末端克隆試劑盒、牛血清蛋白(bovineserumalbumin,BSA)、兔抗Histag多克隆抗體,上海翊圣生物科技有限公司;RNA提取試劑盒、GoTaq®qPCRMasterMix、CXR參比染料等熒光定量試劑,美國Promega公司;FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司;pET28b質(zhì)粒,重慶優(yōu)寶生物技術(shù)股份有限公司;NotⅠ、T4DNALigase,日本TAKARA公司;NcoI,美國NEB公司;Western半干法轉(zhuǎn)膜液,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;HRP羊抗兔IgG,武漢博士德生物工程有限公司;4%多聚甲醛、TMB單組分顯色液、終止液、異硫氰酸熒光素酯FITC,北京索萊寶科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
儀器:GHP9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司;JD801型凝膠成像儀,江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司;DYY10C型電泳儀,北京六一儀器廠;5331型PCR儀、5810R型高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司;T6型紫外可見分光光度計,上海精密儀器儀表有限公司;SP8型激光共聚焦顯微鏡,徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司;Synergyh1型酶標儀,美國伯騰儀器有限公司;NanoDrop2000型微量測定儀,賽默飛世爾科技公司;OLYMPUSIX71倒置相差熒光顯微鏡,奧林巴斯公司;96孔板,美國BioRad公司。
1.2方法
1.2.1小菜蛾Toll6基因的克隆
采用Trizol法提取5頭小菜蛾3齡幼蟲總RNA,采用微量測定儀檢測RNA濃度與質(zhì)量,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。參照FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,以此為PCR擴增模板。根據(jù)小菜蛾基因組數(shù)據(jù)庫DMBDB(ftp://iae.fafu.edu.cn/pub)提供的小菜蛾Toll6基因序列(登錄號為PX004048),利用SnapeGene3.2.1軟件設(shè)計特異性引物Px004048F(5'ATGCTGCTAATACTACTTATGC3')/Px004048R(5'TTATGCCAAAGACTCCGTTTC3'),引物均委托福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成,以此為上下游引物。50μLPCR反應(yīng)體系:2×PhantaMaxuffer25μL、cDNA模板2μ、10μmol/L上下游引物各2μL、dNTPMix1μL、PhantaMax高保真酶1μL、無核酸酶水17μL。
PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性3.0min;95℃變性30s,52℃退火30s,72℃延伸2.5min,35個循環(huán);72℃延伸5.0min。將PCR產(chǎn)物電泳后切膠回收,連接PESI載體后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5α上,篩選含有pESIToll6質(zhì)粒的陽性菌株送至上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。利用SnapGene3.2.1軟件將所測序列與DMBDB數(shù)據(jù)庫中小菜蛾Toll6序列進行BLAST比對,將序列結(jié)果正確的菌液按1:1體積比與50%甘油混合,標記后于80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2小菜蛾Toll6基因的生物信息學(xué)分析
利用ESPript3.0在線軟件,分析保守結(jié)構(gòu)域。利用ExpasyTranslate在線軟件翻譯小菜蛾Toll6基因的核酸序列,獲得相應(yīng)氨基酸序列。利用SingnalP5.0信號肽預(yù)測工具預(yù)測信號肽。利用SMART在線軟件分析小菜蛾Toll6蛋白的結(jié)構(gòu)域。使用ExPASyProtParam在線軟件預(yù)測小菜蛾Toll6蛋白的分子量和等電點。利用MEGA10.0.5軟件,采用鄰接法構(gòu)建小菜蛾Toll6蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹,使用1000次重復(fù)的自舉抽樣法評估系統(tǒng)發(fā)育樹分支的可靠性(Kumaretal,201)。
1.2.3小菜蛾各發(fā)育階段及各組織中Toll6的表達分析
小菜蛾各發(fā)育階段及各組織的樣本采集:分別收集小菜蛾卵200粒、1齡幼蟲50頭、2齡幼蟲30頭、3齡幼蟲10頭,4齡幼蟲、蛹和成蟲各2頭,于80℃冰箱保存?zhèn)溆茫總發(fā)育階段重復(fù)3次。
分別收集30頭小菜蛾4齡幼蟲的中腸、脂肪體、血淋巴,于80℃冰箱保存?zhèn)溆,每個組織重復(fù)3次。實時熒光定量PCR檢測:按照RNA提取試劑盒說明書提取小菜蛾不同發(fā)育階段和不同組織樣本的RNA,按照FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,以此為實時熒光定量PCR模板。利用Oligo7軟件在線設(shè)計特異性引物Toll6qPCRF(5'CTGGCGGATTACAGGCAAATC3')/Toll6qPCRR(5'GAGCTAGACACACCATGAGAACAAC3'),以小菜蛾核糖體蛋白基因PxylRPL32(GenBank登錄號為AB180441)為內(nèi)參基因,并以PxylRPL32F(5'CAATCAGGCCAATTTACCGC3')/PxylRPL32R(5'CTGGGTTTACGCCAGTTACG3')(Bautistaetal.,2009)為內(nèi)參引物進行實時熒光定量PCR。
20μL實時熒光定量PCR反應(yīng)體系:cDNA模板1μL、10μmol/L上下游引物各0.4μL、無核酸酶水7.05μL、GoTaq®qPCRMasterMix10μL、CXR參比染料0.15μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性10min;95℃變性15s,60℃退火30s,溶解溫度60℃,40個循環(huán)。每個樣品3個生物學(xué)重復(fù),采用2−ΔΔCT方法進行相對表達量分析(Livak&Schmittgen,2001)。
1.2.4小菜蛾Toll6對不同微生物侵染的響應(yīng)試驗無菌飼料的配制:稱取麥胚粉7.5g、酵母粉4.0g、蔗糖2.0g、蘿卜籽0.6g、瓊脂1.2g,倒入250mL錐形瓶中,加入200µL菜籽油、1滴亞油酸、50mLddH2O,玻璃棒攪拌均勻,115℃滅菌30min。待冷卻至60℃,置于超凈工作臺內(nèi)加入2mL無菌維生素混合液,搖晃均勻后,倒入90mm培養(yǎng)皿內(nèi),晾干后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
帶菌飼料的配制:將無菌飼料裝到250mL的錐形瓶中,置于微波爐中融化,待冷卻至60℃時加入2mL無菌維生素混合液,振蕩混勻,待溫度冷卻至瓶身觸手不燙時,分別加入終濃度為5.3×108菌體/mL的蘇云金芽胞桿菌菌株Bt8010和黏質(zhì)沙雷氏菌菌株SmPXG6菌液,振蕩均勻后,倒入90mm培養(yǎng)皿內(nèi),晾干后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫约尤胪w積無菌水的無菌飼料為對照(CK)。
將2種帶菌飼料和CK切成1cm×1cm×1cm的飼料塊。隨機選取生長一致的小菜蛾3齡末幼蟲50頭,置于養(yǎng)蟲盒內(nèi),饑餓4h后分別用3種飼料塊飼喂,處理0、6、12、18、24h后,每個處理隨機選擇小菜蛾4齡幼蟲3頭,液氮處理后于80℃冰箱保存?zhèn)溆。利用實時熒光定量PCR檢測不同樣品中Toll6基因的相對表達量,反應(yīng)體系及程序同1.2.3,每個處理重復(fù)3次。
此外,處理0h與12h時,每個處理隨機選取30頭小菜蛾4齡幼蟲,進行中腸解剖,將其置于組織RNA穩(wěn)定保存液中,于80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫脤崟r熒光定量PCR檢測不同樣品中Toll6基因的表達,熒光定量PCR反應(yīng)體系及程序同1.2.3,每個處理重復(fù)3次。
1.2.5小菜蛾Toll6重組蛋白的表達和純化重組表達載體的構(gòu)建:在得到的小菜蛾Toll6基因開放閱讀框(Openreadingframe,ORF)的基礎(chǔ)上,設(shè)計1對帶有NcoⅠ和NotⅠ酶切位點的小菜蛾Toll6基因成熟肽特異性引物Toll6ORFF(5'CATGCCATGGGTAGTGGGGGTTTACACC3')/Toll6ORFR(5'ATTTGCGGCCGCTGCCAAAGACTC3')。
將擴增片段連接到pET28b載體上,重組質(zhì)粒pET28bToll6經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到含pGTf2質(zhì)粒的大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)中,構(gòu)建重組工程菌,篩選陽性克隆的菌液PCR產(chǎn)物送至上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測序,利用SnapGene3.2.1軟件將所測序列與小菜蛾Toll6基因的克隆序列進行BLAST比對,對序列結(jié)果正確的菌液進行誘導(dǎo)表達。
菌液PCR反應(yīng)體系:菌液1μL、10μmol/LT7通用上下游引物各1μL、2×HieffPCRMasterMix12.5μL、無核酸酶水9.5μL。PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性3.0min;95℃變性30s,52℃退火30s,72℃延伸2.5min,20個循環(huán);72℃延伸5.0min。
1.3數(shù)據(jù)分析
使用SPSS21軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,采用LSD法對小菜蛾不同發(fā)育時期及不同組織中PxToll-6基因的表達量及Toll6蛋白的結(jié)合能力進行差異顯著性檢驗,采用獨立樣本t檢驗法對不同處理之間小菜蛾Toll-6基因的表達量進行差異顯著性檢驗。
2結(jié)果與分析
2.1小菜蛾
Toll-6基因的克隆及生物信息學(xué)分析通過PCR克隆得到小菜蛾的Toll-6基因序列(GenBank登錄號為MW446554),全長2313bp,編碼770個氨基酸,預(yù)測Toll6蛋白的等電點和分子量分別為6.04kD和87.5kD。多序列比對和SMART軟件分析表明該氨基序列包含1個由1~16位氨基酸組成的信號肽、1個跨膜結(jié)構(gòu)域和1個Toll與白介素1受體同源(Toll/interleukin1receptorhomologous,TIR)結(jié)構(gòu)域、3個富含亮氨酸重復(fù)序列(leucinerichrepeats,LRR)結(jié)構(gòu)域以及1個典型富含亮氨酸重復(fù)序列亞家族(leucinerichrepeats,typicalsubfamily,LRRTYP)結(jié)構(gòu)域,屬于保守型序列。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,鱗翅目、雙翅目和鞘翅目昆蟲的Toll受體在進化樹上形成3個獨立的分支,其中鱗翅目與雙翅目昆蟲的Toll受體親緣關(guān)系較近,在鱗翅目昆蟲中小菜蛾Toll6與大債避蛾EumetajaponicaToll6的親緣關(guān)系最近。
3討論
本研究從小菜蛾基因組中成功克隆到Toll-6基因,其編碼的氨基酸序列具有典型Toll受體家族特征——LRR胞外區(qū)、跨膜區(qū)和TIR胞內(nèi)區(qū),與果蠅、家蠶Bombyxmori、意大利蜜蜂Apismellifera等昆蟲的Toll受體有相似的結(jié)構(gòu)特點(Hoffmann&Reichhart,2002;Sunetal.,2017;Aronstein&Saldivar,2005;Chengetal.,2008)。家蠶Toll受體的胞外LRR結(jié)構(gòu)域負責Toll受體與多肽的高親和力結(jié)合(Chengetal.,2008),含有LRR結(jié)構(gòu)域的CD14蛋白通過直接與細菌脂多糖結(jié)合參與巨噬細胞對入侵細菌的先天免疫反應(yīng)(Hailmanetal.,1994;Kobe&Deisenhofer,1995)。
此外,在許多與發(fā)育和先天免疫反應(yīng)相關(guān)的基因中均存在TIR結(jié)構(gòu)域,它可以與下游接頭分子上相應(yīng)區(qū)域相互作用,進而激活通路中下游元件發(fā)揮作用(孫佩璐等,2019)。因此推測小菜蛾Toll6蛋白胞外LRR結(jié)構(gòu)域可能與細菌的脂多糖和肽聚糖等結(jié)合,而其胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域則通過與下游接頭分子互作參與小菜蛾的先天免疫反應(yīng)。此外,小菜蛾Toll6蛋白含有一個1~16位氨基酸組成的信號肽,推測其可能屬于分泌蛋白。系統(tǒng)發(fā)育分析表明小菜蛾Toll6蛋白與大債避蛾EumetajaponicaToll6蛋白親緣關(guān)系最近,推測它們可能在先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮著類似的功能,鱗翅目、雙翅目和鞘翅目昆蟲的Toll受體在進化樹上形成3個獨立的分支,表明Toll受體在不同目中具有保守性。
本研究結(jié)果顯示,Toll-6基因在小菜蛾成蟲期表達量最高,究其原因可能是成蟲活動環(huán)境復(fù)雜,接觸病原物的機會更多,小菜蛾通過提高其體內(nèi)Toll-6基因表達水平來應(yīng)對病原物的入侵。此外,Toll-6基因在小菜蛾4齡幼蟲中的表達量僅次于成蟲期,其原因可能是處于暴食期的4齡幼蟲在大量攝取食物的同時接觸各種病原物的概率大大增加,小菜蛾同樣需要較高表達Toll-6基因來應(yīng)對病原物的入侵。
中腸是小菜蛾重要的免疫器官,其內(nèi)存在Toll、免疫缺陷(immunedeficiency,IMD)和Janus激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Januskinasesignaltransducerandactivatoroftranscription,JAKSTAT)等復(fù)雜多樣的免疫通路,參與小菜蛾先天免疫反應(yīng)(Linetal.,2018)。本研究結(jié)果顯示Toll-6基因在小菜蛾4齡幼蟲中腸中表達量最高,表明Toll-6基因很可能作為Toll信號通路中的一員參與調(diào)節(jié)小菜蛾中腸先天免疫應(yīng)答。Lunaetal(2002)研究結(jié)果表明Toll-9基因在岡比亞按蚊Anophelesgambiae成蟲中腸中高表達,其可能參與抵抗入侵病原物的先天免疫反應(yīng),與本研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)小菜蛾Toll-6基因既可以響應(yīng)革蘭氏陰性細菌又可以響應(yīng)革蘭氏陽性細菌。
家蠶中腸Toll基因既可以響應(yīng)大腸桿菌又可以響應(yīng)金黃色葡萄球菌(Wuetal.,2010a,b),與本研究結(jié)果相似;而果蠅Toll基因只響應(yīng)革蘭氏陽性細菌和真菌(Buchonetal.,2014;曾令瑜等,2019),表明小菜蛾和家蠶的Toll基因可能與果蠅的Toll基因在功能上存在差異。小菜蛾Toll-6基因?qū)Σ煌⑸锏那秩揪哂胁煌捻憫?yīng),經(jīng)蘇云金芽胞桿菌菌株Bt8010刺激6h后,Toll-6基因表達被顯著抑制,表明蘇云金芽胞桿菌可能通過抑制Toll-6基因的表達來逃避小菜蛾的免疫防御反應(yīng)。
本研究中所使用的重組小菜蛾Toll6蛋白是通過大腸桿菌系統(tǒng)表達的,因此在研究其功能時,無法絕對排除由大腸桿菌宿主本身產(chǎn)生的殘留細菌對蛋白的影響,后續(xù)研究中可以通過在大腸桿菌系統(tǒng)中表達一個已知無菌結(jié)合能力的其他蛋白,經(jīng)過同樣純化后將其作為對照來排除這種影響,或者使用RNA干擾、規(guī)律成簇間隔短回文序列(clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR)及其相關(guān)Cas9蛋白介導(dǎo)的新一代基因編輯技術(shù)等進行體內(nèi)基因敲除,與體外試驗相互驗證,從而明確該蛋白的功能。
參考文獻(References)
AronsteinK,SaldivarE.2005.CharacterizationofahoneybeeTollrelatedreceptorgeneAm18wanditspotentialinvolvementinantimicrobialimmunedefense.
Apidologie,36(1):314BautistaMAM,MiyataT,MiuraK,TanakaT.2009.RNAinterferencemediatedknockdownofacytochromeP450,CYP6BG1,fromthediamondbackmoth,Plutellaxylostella,reduceslarvalresistancetopermethrin.InsectBiochemistryandMolecularBiology,39(1):3846
BuchonN,SilvermanN,CherryS.2014.ImmunityinDrosophilamelanogaster:frommicrobialrecognitiontowholeorganismphysiology.NatureReviewsImmunology,14(12):796810
作者:張姍姍1,2賈元虹1,2李金洋1,2林俊涵1,2,3尤民生1,2*夏曉峰1,2*
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