小菜蛾Toll6基因的克隆及功能分析

　　摘要：為探究Toll基因在小菜蛾先天免疫中的功能，對(duì)克隆鑒定的Toll基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Toll基因的時(shí)空表達(dá)模式及微生物侵染響應(yīng)模式，體外驗(yàn)證其在微生物結(jié)合、病原相關(guān)分子模式(athogenassociatedmolecularpattern，PAMP)結(jié)合、細(xì)菌凝集等方面的功能。結(jié)果表明：Toll基因全長(zhǎng)2313bp，編碼770個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)Toll6蛋白具有富含亮氨酸重復(fù)序列的LRR胞外區(qū)、跨膜區(qū)和TIR胞內(nèi)等典型Toll受體家族特征;Toll基因在不同發(fā)育階段及不同組織中均有表達(dá)，其中成蟲期表達(dá)量最高，齡幼蟲次之，在齡幼蟲中腸表達(dá)量最高;此外，蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis菌株Bt8010侵染小菜蛾齡幼蟲6h后，Toll基因表達(dá)被顯著抑制，而黏質(zhì)沙雷氏菌Serratiamarcescens菌株SmPXG6侵染小菜蛾齡幼蟲12h時(shí)，Toll基因表達(dá)被顯著上調(diào)，18h后Toll基因表達(dá)被顯著抑制;蛋白體外功能驗(yàn)證表明Toll蛋白不僅與細(xì)菌和真菌具有直接結(jié)合能力，還能與肽聚糖和脂多糖結(jié)合，但不具備細(xì)菌凝集功能。表明Toll蛋白可能作為模式識(shí)別受體直接識(shí)別并結(jié)合入侵病原微生物表面的PAMP，啟動(dòng)小菜蛾對(duì)入侵病原微生物的先天免疫防御，且對(duì)不同微生物可能具有不同的響應(yīng)機(jī)制。

　　關(guān)鍵詞：小菜蛾;Toll受體;先天免疫;模式識(shí)別受體;基因表達(dá);病原菌侵染

　　免疫系統(tǒng)對(duì)昆蟲適應(yīng)細(xì)菌、真菌、病毒以及真核寄生蟲等的復(fù)雜環(huán)境至關(guān)重要(Zhangetal，2019)，是昆蟲生存和繁衍的前提與保障。昆蟲不具備高等脊椎動(dòng)物的獲得性免疫系統(tǒng)，先天免疫系統(tǒng)成為其抵御病原微生物感染的重要防御體系。Toll通路是與先天免疫有關(guān)的主要信號(hào)通路之一，其響應(yīng)真菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的感染，在免疫防御中具有重要作用(Wangetal，2018)。

　　昆蟲Toll受體是Toll通路中的關(guān)鍵效應(yīng)因子，能夠識(shí)別胞外特異性配體并引發(fā)胞內(nèi)信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在維持Toll信號(hào)通路的正常免疫應(yīng)答及抵抗入侵病原微生物的過(guò)程中扮演著重要角色(廖文麗等，2017)。闡明Toll受體的功能是理解昆蟲Toll信號(hào)通路以及相關(guān)免疫防御機(jī)制的基礎(chǔ)。Toll受體最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)，并被鑒定為一種跨膜受體，不僅參與機(jī)體發(fā)育，而且參與對(duì)真菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的免疫應(yīng)答(Nicolasetal，1996)。

　　人體內(nèi)鑒定得到10個(gè)Toll樣受體(olllikereceptor，TLR)，其作為典型的模式識(shí)別受體(patternrecognitionreceptor，PRR)，與特定病原相關(guān)分子模式(athogenassociatedmolecularpattern，PAMP)直接結(jié)合進(jìn)而誘導(dǎo)相應(yīng)的免疫防御響應(yīng)(Takeda&Akira，2005)。在甲殼類動(dòng)物中，Toll受體發(fā)揮免疫功能的作用方式因物種不同而異，如日本囊對(duì)蝦MarsupenaeusjaponicasToll受體與哺乳動(dòng)物相似，作為PRR激活Toll信號(hào)通路(Sunetal，2017);日本沼蝦MacrobrachiumnipponenseToll受體既可作為PRR識(shí)別外源入侵物，又可作為細(xì)胞因子受體與活化的內(nèi)源性配體結(jié)合(Panetal，201)。

　　在昆蟲中，Toll受體不僅可以作為跨膜受體與活化的神經(jīng)生長(zhǎng)因子同源物Spätzle配體結(jié)合，激活胞內(nèi)Toll信號(hào)通路，調(diào)控抗菌肽的表達(dá)(Nieetal，2018)，而且昆蟲Toll受體還能直接作為PRR與特定的PAMP結(jié)合，發(fā)揮免疫學(xué)功能(Nakamotoetal，2012;廖文麗等，2017)。

　　昆蟲由于其物種多樣性、生存環(huán)境的多態(tài)性，其免疫功能也會(huì)發(fā)生物種分化，具備種屬的特異性，因此從昆蟲Toll受體發(fā)揮免疫功能作用方式探究其誘導(dǎo)的免疫防御反應(yīng)對(duì)于闡明昆蟲Toll受體功能及其介導(dǎo)的免疫防御機(jī)制具有重要意義。小菜蛾P(guān)lutellaxylostella是世界性害蟲之一，對(duì)十字花科蔬菜具有極強(qiáng)的破壞性，其抗藥性高，已對(duì)包括Bt在內(nèi)的所有用于防治的殺蟲劑均產(chǎn)生了抗性(徐艷聆等，2006;Furlongetal.，2013)。生物農(nóng)藥是未來(lái)農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的趨勢(shì)，但小菜蛾的免疫防御反應(yīng)能夠降低或者延緩微生物農(nóng)藥的作用效率(彭露等，2015)。

　　因此，從小菜蛾抵御入侵病原微生物的免疫防御系統(tǒng)——Toll通路入手，探究Toll受體的免疫應(yīng)答機(jī)制對(duì)于生物農(nóng)藥的改良與新型生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)具有重要意義。Xiaetal(2015)通過(guò)比較基因組學(xué)從小菜蛾基因組中鑒定到個(gè)Toll受體基因;Linetal(2018)研究表明小菜蛾Toll和Toll10基因參與細(xì)菌和真菌的免疫應(yīng)答，但Toll基因在先天免疫系統(tǒng)中所扮演的角色及其是否與病原體直接結(jié)合未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)克隆表達(dá)小菜蛾Toll基因，研究其表達(dá)模式和免疫防御響應(yīng)，并在體外驗(yàn)證其在PAMP結(jié)合、微生物結(jié)合及細(xì)菌凝集等方面的功能，以期為后續(xù)深入探究Toll受體在小菜蛾先天免疫反應(yīng)中的功能奠定基礎(chǔ)。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　供試?yán)ハx和菌種：供試小菜蛾為以人工飼料飼養(yǎng)的小菜蛾Bt敏感品系SLss，由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所提供，于福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所人工氣候室內(nèi)飼養(yǎng)，人工氣候室溫度(25±2)°C、相對(duì)濕度70%~80%、光照周期為16L：8D，幼蟲用人工飼料飼喂，成蟲用10%蜂蜜水飼喂。供試大腸桿菌Escherichiacoli菌株BL21、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、含pGTf2質(zhì)粒的大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)、畢赤酵母Pichiapastoris、蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis菌株Bt8010、金黃葡萄球菌Staphylococcusaureus、腸桿菌Enterobactersp.菌株EbPXG5和黏質(zhì)沙雷氏菌Serratiamarcescens菌株SmPXG6，均由福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所保存。

　　培養(yǎng)基：LB(LuriaBertani)液體培養(yǎng)基成分為5g酵母抽提物、10g蛋白胨、10g氯化鈉，去離子水定容至1L;LB固體培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉15g;酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeastextractpeptonedextrosemedium，YPD)成分為10g酵母抽提物、20g蛋白胨、20g葡萄糖，去離子水定容至1L。

　　試劑：Trizol，美國(guó)Invitrogen公司;膠回收試劑盒，瑞士Omega公司;PhantaMax高保真酶(P505)、2×PhantaMaxuffer等PCR試劑，南京諾唯贊生物科技股份有限公司;TOPOBlunt平末端克隆試劑盒、牛血清蛋白(bovineserumalbumin，BSA)、兔抗Histag多克隆抗體，上海翊圣生物科技有限公司;RNA提取試劑盒、GoTaq®qPCRMasterMix、CXR參比染料等熒光定量試劑，美國(guó)Promega公司;FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司;pET28b質(zhì)粒，重慶優(yōu)寶生物技術(shù)股份有限公司;NotⅠ、T4DNALigase，日本TAKARA公司;NcoI，美國(guó)NEB公司;Western半干法轉(zhuǎn)膜液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司;HRP羊抗兔IgG，武漢博士德生物工程有限公司;4%多聚甲醛、TMB單組分顯色液、終止液、異硫氰酸熒光素酯FITC，北京索萊寶科技有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

　　儀器：GHP9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司;JD801型凝膠成像儀，江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司;DYY10C型電泳儀，北京六一儀器廠;5331型PCR儀、5810R型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司;T6型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密儀器儀表有限公司;SP8型激光共聚焦顯微鏡，徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司;Synergyh1型酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司;NanoDrop2000型微量測(cè)定儀，賽默飛世爾科技公司;OLYMPUSIX71倒置相差熒光顯微鏡，奧林巴斯公司;96孔板，美國(guó)BioRad公司。

　　1.2方法

　　1.2.1小菜蛾Toll6基因的克隆

　　采用Trizol法提取5頭小菜蛾3齡幼蟲總RNA，采用微量測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度與質(zhì)量，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。參照FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，以此為PCR擴(kuò)增模板。根據(jù)小菜蛾基因組數(shù)據(jù)庫(kù)DMBDB(ftp://iae.fafu.edu.cn/pub)提供的小菜蛾Toll6基因序列(登錄號(hào)為PX004048)，利用SnapeGene3.2.1軟件設(shè)計(jì)特異性引物Px004048F(5'ATGCTGCTAATACTACTTATGC3')/Px004048R(5'TTATGCCAAAGACTCCGTTTC3')，引物均委托福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成，以此為上下游引物。50μLPCR反應(yīng)體系：2×PhantaMaxuffer25μL、cDNA模板2μ、10μmol/L上下游引物各2μL、dNTPMix1μL、PhantaMax高保真酶1μL、無(wú)核酸酶水17μL。

　　PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3.0min;95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸2.5min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸5.0min。將PCR產(chǎn)物電泳后切膠回收，連接PESI載體后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α上，篩選含有pESIToll6質(zhì)粒的陽(yáng)性菌株送至上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。利用SnapGene3.2.1軟件將所測(cè)序列與DMBDB數(shù)據(jù)庫(kù)中小菜蛾Toll6序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，將序列結(jié)果正確的菌液按1:1體積比與50%甘油混合，標(biāo)記后于80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.2.2小菜蛾Toll6基因的生物信息學(xué)分析

　　利用ESPript3.0在線軟件，分析保守結(jié)構(gòu)域。利用ExpasyTranslate在線軟件翻譯小菜蛾Toll6基因的核酸序列，獲得相應(yīng)氨基酸序列。利用SingnalP5.0信號(hào)肽預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)信號(hào)肽。利用SMART在線軟件分析小菜蛾Toll6蛋白的結(jié)構(gòu)域。使用ExPASyProtParam在線軟件預(yù)測(cè)小菜蛾Toll6蛋白的分子量和等電點(diǎn)。利用MEGA10.0.5軟件，采用鄰接法構(gòu)建小菜蛾Toll6蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，使用1000次重復(fù)的自舉抽樣法評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹分支的可靠性(Kumaretal，201)。

　　1.2.3小菜蛾各發(fā)育階段及各組織中Toll6的表達(dá)分析

　　小菜蛾各發(fā)育階段及各組織的樣本采集：分別收集小菜蛾卵200粒、1齡幼蟲50頭、2齡幼蟲30頭、3齡幼蟲10頭，4齡幼蟲、蛹和成蟲各2頭，于80℃冰箱保存?zhèn)溆�，每個(gè)發(fā)育階段重復(fù)3次。

　　分別收集30頭小菜蛾4齡幼蟲的中腸、脂肪體、血淋巴，于80℃冰箱保存?zhèn)溆�，每個(gè)組織重復(fù)3次。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取小菜蛾不同發(fā)育階段和不同組織樣本的RNA，按照FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，以此為實(shí)時(shí)熒光定量PCR模板。利用Oligo7軟件在線設(shè)計(jì)特異性引物Toll6qPCRF(5'CTGGCGGATTACAGGCAAATC3')/Toll6qPCRR(5'GAGCTAGACACACCATGAGAACAAC3')，以小菜蛾核糖體蛋白基因PxylRPL32(GenBank登錄號(hào)為AB180441)為內(nèi)參基因，并以PxylRPL32F(5'CAATCAGGCCAATTTACCGC3')/PxylRPL32R(5'CTGGGTTTACGCCAGTTACG3')(Bautistaetal.，2009)為內(nèi)參引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

　　20μL實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1μL、10μmol/L上下游引物各0.4μL、無(wú)核酸酶水7.05μL、GoTaq®qPCRMasterMix10μL、CXR參比染料0.15μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10min;95℃變性15s，60℃退火30s，溶解溫度60℃，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用2−ΔΔCT方法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析(Livak&Schmittgen，2001)。

　　1.2.4小菜蛾Toll6對(duì)不同微生物侵染的響應(yīng)試驗(yàn)無(wú)菌飼料的配制：稱取麥胚粉7.5g、酵母粉4.0g、蔗糖2.0g、蘿卜籽0.6g、瓊脂1.2g，倒入250mL錐形瓶中，加入200µL菜籽油、1滴亞油酸、50mLddH2O，玻璃棒攪拌均勻，115℃滅菌30min。待冷卻至60℃，置于超凈工作臺(tái)內(nèi)加入2mL無(wú)菌維生素混合液，搖晃均勻后，倒入90mm培養(yǎng)皿內(nèi)，晾干后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

　　帶菌飼料的配制：將無(wú)菌飼料裝到250mL的錐形瓶中，置于微波爐中融化，待冷卻至60℃時(shí)加入2mL無(wú)菌維生素混合液，振蕩混勻，待溫度冷卻至瓶身觸手不燙時(shí)，分別加入終濃度為5.3×108菌體/mL的蘇云金芽胞桿菌菌株Bt8010和黏質(zhì)沙雷氏菌菌株SmPXG6菌液，振蕩均勻后，倒入90mm培養(yǎng)皿內(nèi)，晾干后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆�，以加入同體積無(wú)菌水的無(wú)菌飼料為對(duì)照(CK)。

　　將2種帶菌飼料和CK切成1cm×1cm×1cm的飼料塊。隨機(jī)選取生長(zhǎng)一致的小菜蛾3齡末幼蟲50頭，置于養(yǎng)蟲盒內(nèi)，饑餓4h后分別用3種飼料塊飼喂，處理0、6、12、18、24h后，每個(gè)處理隨機(jī)選擇小菜蛾4齡幼蟲3頭，液氮處理后于80℃冰箱保存?zhèn)溆�。利用�?shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同樣品中Toll6基因的相對(duì)表達(dá)量，反應(yīng)體系及程序同1.2.3，每個(gè)處理重復(fù)3次。

　　此外，處理0h與12h時(shí)，每個(gè)處理隨機(jī)選取30頭小菜蛾4齡幼蟲，進(jìn)行中腸解剖，將其置于組織RNA穩(wěn)定保存液中，于80℃冰箱中保存?zhèn)溆�，利用�?shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同樣品中Toll6基因的表達(dá)，熒光定量PCR反應(yīng)體系及程序同1.2.3，每個(gè)處理重復(fù)3次。

　　1.2.5小菜蛾Toll6重組蛋白的表達(dá)和純化重組表達(dá)載體的構(gòu)建：在得到的小菜蛾Toll6基因開(kāi)放閱讀框(Openreadingframe，ORF)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)1對(duì)帶有NcoⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)的小菜蛾Toll6基因成熟肽特異性引物Toll6ORFF(5'CATGCCATGGGTAGTGGGGGTTTACACC3')/Toll6ORFR(5'ATTTGCGGCCGCTGCCAAAGACTC3')。

　　將擴(kuò)增片段連接到pET28b載體上，重組質(zhì)粒pET28bToll6經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到含pGTf2質(zhì)粒的大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)中，構(gòu)建重組工程菌，篩選陽(yáng)性克隆的菌液PCR產(chǎn)物送至上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序，利用SnapGene3.2.1軟件將所測(cè)序列與小菜蛾Toll6基因的克隆序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，對(duì)序列結(jié)果正確的菌液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

　　菌液PCR反應(yīng)體系：菌液1μL、10μmol/LT7通用上下游引物各1μL、2×HieffPCRMasterMix12.5μL、無(wú)核酸酶水9.5μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3.0min;95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸2.5min，20個(gè)循環(huán);72℃延伸5.0min。

　　1.3數(shù)據(jù)分析

　　使用SPSS21軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用LSD法對(duì)小菜蛾不同發(fā)育時(shí)期及不同組織中PxToll-6基因的表達(dá)量及Toll6蛋白的結(jié)合能力進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法對(duì)不同處理之間小菜蛾Toll-6基因的表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1小菜蛾

　　Toll-6基因的克隆及生物信息學(xué)分析通過(guò)PCR克隆得到小菜蛾的Toll-6基因序列(GenBank登錄號(hào)為MW446554)，全長(zhǎng)2313bp，編碼770個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)Toll6蛋白的等電點(diǎn)和分子量分別為6.04kD和87.5kD。多序列比對(duì)和SMART軟件分析表明該氨基序列包含1個(gè)由1~16位氨基酸組成的信號(hào)肽、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)Toll與白介素1受體同源(Toll/interleukin1receptorhomologous，TIR)結(jié)構(gòu)域、3個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列(leucinerichrepeats，LRR)結(jié)構(gòu)域以及1個(gè)典型富含亮氨酸重復(fù)序列亞家族(leucinerichrepeats,typicalsubfamily，LRRTYP)結(jié)構(gòu)域，屬于保守型序列。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，鱗翅目、雙翅目和鞘翅目昆蟲的Toll受體在進(jìn)化樹上形成3個(gè)獨(dú)立的分支，其中鱗翅目與雙翅目昆蟲的Toll受體親緣關(guān)系較近，在鱗翅目昆蟲中小菜蛾Toll6與大債避蛾EumetajaponicaToll6的親緣關(guān)系最近。

　　3討論

　　本研究從小菜蛾基因組中成功克隆到Toll-6基因，其編碼的氨基酸序列具有典型Toll受體家族特征——LRR胞外區(qū)、跨膜區(qū)和TIR胞內(nèi)區(qū)，與果蠅、家蠶Bombyxmori、意大利蜜蜂Apismellifera等昆蟲的Toll受體有相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(Hoffmann&Reichhart，2002;Sunetal.，2017;Aronstein&Saldivar，2005;Chengetal.，2008)。家蠶Toll受體的胞外LRR結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)Toll受體與多肽的高親和力結(jié)合(Chengetal.，2008)，含有LRR結(jié)構(gòu)域的CD14蛋白通過(guò)直接與細(xì)菌脂多糖結(jié)合參與巨噬細(xì)胞對(duì)入侵細(xì)菌的先天免疫反應(yīng)(Hailmanetal.，1994;Kobe&Deisenhofer，1995)。

　　此外，在許多與發(fā)育和先天免疫反應(yīng)相關(guān)的基因中均存在TIR結(jié)構(gòu)域，它可以與下游接頭分子上相應(yīng)區(qū)域相互作用，進(jìn)而激活通路中下游元件發(fā)揮作用(孫佩璐等，2019)。因此推測(cè)小菜蛾Toll6蛋白胞外LRR結(jié)構(gòu)域可能與細(xì)菌的脂多糖和肽聚糖等結(jié)合，而其胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域則通過(guò)與下游接頭分子互作參與小菜蛾的先天免疫反應(yīng)。此外，小菜蛾Toll6蛋白含有一個(gè)1~16位氨基酸組成的信號(hào)肽，推測(cè)其可能屬于分泌蛋白。系統(tǒng)發(fā)育分析表明小菜蛾Toll6蛋白與大債避蛾EumetajaponicaToll6蛋白親緣關(guān)系最近，推測(cè)它們可能在先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮著類似的功能，鱗翅目、雙翅目和鞘翅目昆蟲的Toll受體在進(jìn)化樹上形成3個(gè)獨(dú)立的分支，表明Toll受體在不同目中具有保守性。

　　本研究結(jié)果顯示，Toll-6基因在小菜蛾成蟲期表達(dá)量最高，究其原因可能是成蟲活動(dòng)環(huán)境復(fù)雜，接觸病原物的機(jī)會(huì)更多，小菜蛾通過(guò)提高其體內(nèi)Toll-6基因表達(dá)水平來(lái)應(yīng)對(duì)病原物的入侵。此外，Toll-6基因在小菜蛾4齡幼蟲中的表達(dá)量?jī)H次于成蟲期，其原因可能是處于暴食期的4齡幼蟲在大量攝取食物的同時(shí)接觸各種病原物的概率大大增加，小菜蛾同樣需要較高表達(dá)Toll-6基因來(lái)應(yīng)對(duì)病原物的入侵。

　　中腸是小菜蛾重要的免疫器官，其內(nèi)存在Toll、免疫缺陷(immunedeficiency，IMD)和Janus激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Januskinasesignaltransducerandactivatoroftranscription，JAKSTAT)等復(fù)雜多樣的免疫通路，參與小菜蛾先天免疫反應(yīng)(Linetal.，2018)。本研究結(jié)果顯示Toll-6基因在小菜蛾4齡幼蟲中腸中表達(dá)量最高，表明Toll-6基因很可能作為Toll信號(hào)通路中的一員參與調(diào)節(jié)小菜蛾中腸先天免疫應(yīng)答。Lunaetal(2002)研究結(jié)果表明Toll-9基因在岡比亞按蚊Anophelesgambiae成蟲中腸中高表達(dá)，其可能參與抵抗入侵病原物的先天免疫反應(yīng)，與本研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)小菜蛾Toll-6基因既可以響應(yīng)革蘭氏陰性細(xì)菌又可以響應(yīng)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。

　　家蠶中腸Toll基因既可以響應(yīng)大腸桿菌又可以響應(yīng)金黃色葡萄球菌(Wuetal.，2010a，b)，與本研究結(jié)果相似;而果蠅Toll基因只響應(yīng)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和真菌(Buchonetal.，2014;曾令瑜等，2019)，表明小菜蛾和家蠶的Toll基因可能與果蠅的Toll基因在功能上存在差異。小菜蛾Toll-6基因?qū)Σ煌�微生物的侵染具有不同的響�?yīng)，經(jīng)蘇云金芽胞桿菌菌株Bt8010刺激6h后，Toll-6基因表達(dá)被顯著抑制，表明蘇云金芽胞桿菌可能通過(guò)抑制Toll-6基因的表達(dá)來(lái)逃避小菜蛾的免疫防御反應(yīng)。

　　本研究中所使用的重組小菜蛾Toll6蛋白是通過(guò)大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的，因此在研究其功能時(shí)，無(wú)法絕對(duì)排除由大腸桿菌宿主本身產(chǎn)生的殘留細(xì)菌對(duì)蛋白的影響，后續(xù)研究中可以通過(guò)在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)一個(gè)已知無(wú)菌結(jié)合能力的其他蛋白，經(jīng)過(guò)同樣純化后將其作為對(duì)照來(lái)排除這種影響，或者使用RNA干擾、規(guī)律成簇間隔短回文序列(clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR)及其相關(guān)Cas9蛋白介導(dǎo)的新一代基因編輯技術(shù)等進(jìn)行體內(nèi)基因敲除，與體外試驗(yàn)相互驗(yàn)證，從而明確該蛋白的功能。

　　參考文獻(xiàn)(References)

　　AronsteinK,SaldivarE.2005.CharacterizationofahoneybeeTollrelatedreceptorgeneAm18wanditspotentialinvolvementinantimicrobialimmunedefense.

　　Apidologie,36(1):314BautistaMAM,MiyataT,MiuraK,TanakaT.2009.RNAinterferencemediatedknockdownofacytochromeP450,CYP6BG1,fromthediamondbackmoth,Plutellaxylostella,reduceslarvalresistancetopermethrin.InsectBiochemistryandMolecularBiology,39(1):3846

　　BuchonN,SilvermanN,CherryS.2014.ImmunityinDrosophilamelanogaster:frommicrobialrecognitiontowholeorganismphysiology.NatureReviewsImmunology,14(12):796810

　　作者：張姍姍1,2賈元虹1,2李金洋1,2林俊涵1,2,3尤民生1,2*夏曉峰1,2*

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