轉(zhuǎn)GhB301基因棉花響應(yīng)枯萎病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組分析

　　摘要:乙烯響應(yīng)因子(ethyleneresponsivefactor，ERF)可以激活或者抑制下游病程相關(guān)蛋白基因的表達，在植物抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要作用。為探究ERF-B3亞組基因GhB301在棉花抗枯萎病中的分子調(diào)控機制，本研究利用已獲得的轉(zhuǎn)GhB301基因棉花株系，通過孢子懸浮液蘸根的方法對轉(zhuǎn)GhB301基因棉花株系(N)和野生型對照(WT)進行接菌處理，抗病性鑒定結(jié)果表明，過表達GhB301的N株系增強了對枯萎病的抗病性，其病情指數(shù)為14.77，顯著低于WT(病情指數(shù)為37.50);枯萎病菌侵染0、6、12、24、48h后，利用RNA-seq技術(shù)對N和WT的根部組織進行測序分析，共得到273111170個cleanreads，其Q30均大于87.64%，將cleanreads與陸地棉參考基因組TM-1比對，獲得了14021個差異表達基因(DEGs)。與WT相比，轉(zhuǎn)基因株系能夠在病原菌侵染后更快速地做出響應(yīng)。GO及KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)共有135個DEGs參與氧化還原過程，67個DEGs參與防御反應(yīng)，31個DEGs參與苯丙烷類生物合成，推測這些DEGs可能與轉(zhuǎn)基因棉花的枯萎病抗性增強存在密切關(guān)系。本研究結(jié)果為闡明GhB301基因響應(yīng)棉花枯萎病菌侵染規(guī)律奠定了基礎(chǔ)。

　　關(guān)鍵詞:棉花;GhB301基因;枯萎病;功能;RNA-seq

　　棉花枯萎病(Fusariumoxysporumf.sp.Vasinfectum)作為棉花的土傳病害之一，其病菌可以從根部侵染棉花，毒害棉花維管束，造成棉花葉片青枯、落葉，甚至死亡。其病菌孢子在土壤中的休眠期長達10年之久，農(nóng)藥防治對病情控制的作用有限，并且會對土壤水源產(chǎn)生污染，因此培育棉花抗病品種是解決棉花枯萎病最為經(jīng)濟有效的措施。

　　近年來，較多的研究集中于棉花黃萎病，且主要集中在抗病種質(zhì)資源的篩選、抗性基因的定位以及基因的遺傳分析等方面[1-2]，而對棉花枯萎病的研究相對較少。隨著高通量測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，其具有時間短、通量大、靈敏度高等優(yōu)點，在研究差異表達基因(Differentiallyexpressedgenes，DEGs)方面顯示出強大的優(yōu)勢[3-4]。

　　第二代高通量轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)已被廣泛應(yīng)用于植物基因表達分析研究。韓澤剛等[5]通過Solexa高通量測序技術(shù)構(gòu)建棉花抗、感枯萎病品種的基因表達譜，發(fā)現(xiàn)1080個DEGs在棉花抗病和感病品種中差異表達，并發(fā)現(xiàn)在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，26個已知功能的基因可能參與植物抗病反應(yīng)。王琛等[6]通過分析比較接種和未接種枯萎病菌的棉花葉片轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)枯萎病菌侵染后，5062個基因的表達量發(fā)生顯著變化，其中2091個基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，2971個基因的轉(zhuǎn)錄水平下降。杜榮光[7]通過對抗感枯萎病海島棉材料接菌前后進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)眾多已知抗病相關(guān)基因均顯著高表達。而這些研究均未對比分析轉(zhuǎn)基因材料和對照材料。

　　本試驗在前期研究中獲得了1個ERF轉(zhuǎn)錄因子家族基因GhB301，在受到枯萎病菌誘導(dǎo)后，該基因的相對表達量明顯增加，并且在抗病品種中的表達量顯著高于感病品種;在煙草中過表達該基因，可以顯著增加防御保護酶活性以及抗病相關(guān)基因的表達，暗示該基因可能在棉花對抗枯萎病菌脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[8]。在此基礎(chǔ)上，本研究將GhB301轉(zhuǎn)入陸地棉中并獲得純合株系，研究轉(zhuǎn)基因棉花株系與野生型對照的抗病性變化，包括分析枯萎病菌誘導(dǎo)前后轉(zhuǎn)基因系和對照系中的差異表達基因，篩選與棉花抗枯萎病菌相關(guān)的候選基因，在轉(zhuǎn)錄水平上分析GhB301基因在棉花抗枯萎病中的功能。

　　1材料與方法

　　1.1棉花枯萎病菌和植物材料的制備

　　棉花枯萎病菌7號生理小種F430菌株由石河子大學(xué)棉花分子育種實驗室保存。棉花枯萎病菌在固體馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potatodextroseager，PDA)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d后(28℃)，轉(zhuǎn)移至查氏液體培養(yǎng)基中，于200r·min-1的孵育振蕩器(哈爾濱東安電子)中，在28℃黑暗培養(yǎng)7～10d。最后用無菌水將孢子懸浮液的濃度調(diào)整至1×107個·mL-1，備用。以轉(zhuǎn)GhB301基因棉花株系(N)與野生型受體YZ-1(WT)為材料，經(jīng)硫酸脫絨的種子用10%的雙氧水浸泡2～3h，無菌水沖洗5～6遍后，種植于無菌的營養(yǎng)缽(花土∶蛭石=2∶1)中。待棉苗長至第1片真葉完全展開時，進行傷根接菌處理從WT和N中分別采集枯萎病菌誘導(dǎo)后0、6、12、24和48h的棉花根部組織，液氮速凍后，保存于-80℃冰箱，用于轉(zhuǎn)錄組測序分析。

　　1.2表型鑒定與病情指數(shù)分析

　　接菌處理20d后，對N與WT進行抗病性鑒定(3次重復(fù)的植株分別為22、50和38株)。根據(jù)子葉和真葉的癥狀將棉花幼苗劃分為5個等級(0、1、2、3、4級)，計算棉花植株的病情指數(shù)(diseaseindex，DI):DI=[(∑病級數(shù)×各級病株數(shù))/(總株數(shù)×4)]×100[9-10]。利用SPSS和Excel2010軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。

　　1.3RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測序

　　參照RNAprepPurePlantKit(北京天根生化科技有限公司)說明書提取各處理樣品總RNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳，分析RNA的完整性及是否存在DNA污染，使用Qubit2.0Fluorometer(賽默飛，美國)對RNA濃度精確定量，使用Agilent2100bioanalyzer(Nanodrop，美國)精確檢測RNA的完整性。使用Illumina的NEBNext�RUltraTMRNALibraryPrepKit(NEB，美國)試劑盒構(gòu)建cDNA文庫。使用Qubit2.0Fluorometer(賽默飛，美國)對文庫進行初步定量，稀釋文庫至1.5ng·μL-1。使用Agilent2100bioanalyzer對文庫的insertsize進行檢測。庫檢合格后，委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司利用IlluminaHiSeq4000進行測序。

　　1.4數(shù)據(jù)指控和參考基因組比對

　　對原始數(shù)據(jù)進行過濾，去除帶接頭、無法確定堿基信息以及低質(zhì)量reads，得到cleanreads。對cleanreads分別進行Q20、Q30和GC含量計算。從CottonGene數(shù)據(jù)庫下載陸地棉TM-1參考基因組[11]和基因模型注釋文件，利用軟件Tophat2[12]將高質(zhì)量的cleanreads比對至參考基因組。

　　1.5基因表達量與注釋

　　使用FPKM(expectednumberoffragmentsperKboftranscriptsequencepermillionsbasepairssequenced)來表示RNA-seq的基因表達值[13]。使用edgeR軟件包[14](3.18.1)進行DEGs分析。當FPKM>1時認為該基因表達。以校正后的P值≤0.05以及|log2foldchange|≥2作為顯著差異表達的閾值。利用clusterProfilerR軟件(v3.10.1)進行DEGs的GO富集分析[15]和KEGG通路富集分析[16]。

　　1.6通過qRT-PCR驗證

　　RNA-seq隨機選取15個基因進行實時熒光定量PCR(quantitativereal-timePCR，qRT-PCR)驗證，反應(yīng)體系及程序參考北京全式金生物技術(shù)有限公司TransstartTipGreenqPCRSuperMix說明書進行，試驗設(shè)3個重復(fù)。采用2-ΔΔCt法[17]計算基因相對表達量，所用引物見表1(用Primer5軟件設(shè)計引物，由北京華大基因公司合成)。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1表型鑒定及病情指數(shù)調(diào)查

　　N和WT接種枯萎病菌15d后，WT株系開始發(fā)病，N株系無明顯病癥;接菌第20天后WT和N植株均發(fā)病，對發(fā)病情況進行調(diào)查。結(jié)果表明，N株系中病級多分布在1級或2級，而WT株系中病級則多分布在3級及4級，且明顯多于N株系，說明WT株系比N株系感染枯萎病菌的情況更為嚴重。對3次病級統(tǒng)計進行病情指數(shù)計算，發(fā)現(xiàn)WT棉花接種枯萎病菌后其病情指數(shù)平均值為37.50。而N株系接種枯萎病菌后其病情指數(shù)平均值僅為14.77。這說明GhB301基因的轉(zhuǎn)入可以顯著提高棉花對枯萎病菌的抗性。

　　2.2RNA-seq分析

　　轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，共獲得279114320個rawreads，過濾后保留273111170個cleanreads，數(shù)據(jù)量為81.95Gb，每個文庫平均8.20Gb，WT棉花測序共得到131456222個rawreads，對低質(zhì)量reads進行過濾后仍有128669540個cleanreads，其中cleanreads數(shù)最多的是N6，最少的是N48。

　　而N材料測序后共得到147658098個rawreads，過濾后剩余144441630個cleanreads，其中cleanreads數(shù)最多的是WT24，最少的是WT48。從測序結(jié)果可以看出，各樣本文庫的Q30值均超過87.64%，GC含量均大于43.06%，其平均值分別為89.86%和43.28%。將cleanreads比對到參考基因組中，發(fā)現(xiàn)比對率的均值是94.37%，其中最小的是N12，為92.94%，最大的是WT24，為94.95%，85.26%～87.56%的reads能夠比對到參考基因組的唯一位置，但是仍有7.27%～8.10%的reads比對到參考基因組的多個位置。綜合分析10個樣本材料可以看出，平均有27311117個cleanreads以94.37%的平均比對率比對至參考基因組上，并且86.78%的cleanreads可以比對至參考基因組的唯一位置，為后續(xù)分析奠定了堅實的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

　　2.3DEGs篩選與注釋

　　為了研究轉(zhuǎn)基因棉花和野生型棉花接種枯萎病菌后不同時期的轉(zhuǎn)錄組情況，利用EdgeR進行差異表達基因的篩選，以P≤0.05，|log2foldchange|≥2為篩選條件，共發(fā)現(xiàn)14021個DEGs(其中1290個新基因)能夠響應(yīng)枯萎病菌誘導(dǎo)。對這些DEGs進行GO富集分析，共富集注釋到30個亞類，涉及生物過程，細胞組成和分子功能三大類，主要富集在抗氧化活性、氧化還原酶活性、過氧化物酶活性、氧化應(yīng)激的反應(yīng)、光系統(tǒng)Ⅱ、碳水化合物結(jié)合以及細胞壁等功能類別，其中富集DEGs最多的是氧化還原酶活性(GO:0016684)，共注釋到135個基因，最少的是光系統(tǒng)Ⅱ，僅注釋到24個基因。

　　成對比較結(jié)果顯示：野生型樣本W(wǎng)T6、WT12、WT24、WT48與對照WT0相比，DEGs的數(shù)目分別為3494、4807、3137、3814個，WT12vsWT0的DEGs最多，WT24vsWT0的DEGs最少;而轉(zhuǎn)基因樣本N6、N12、N24、N48與對照N0相比，DEGs的數(shù)目分別為6019、5220、4859、2620個，N6vsN0的DEGs最多，N48vsN0的DEGs最少。比較發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系在病原菌侵染后6h內(nèi)大量的DEGs即開始做出響應(yīng)，而野生型株系則需要12h。由此推測，轉(zhuǎn)基因棉花在應(yīng)對枯萎病菌脅迫時響應(yīng)時更迅速，差異表達基因更多。

　　組間比較結(jié)果顯示，N0vsWT0的DEGs有790個，N6vsWT6的DEGs最多，共有935個，N12vsWT12存在DEGs610個，N24vsWT24的DEGs最少，僅有607個，N48vsWT48存在918個DEGs。綜上所述，WT組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)共存在694個共同的DEGs，轉(zhuǎn)N組內(nèi)比較則有829個共同的DEGs。

　　組間比較結(jié)果顯示，存在41個共同的DEGs，推測這些共同的DEGs可能與棉花枯萎病脅迫響應(yīng)具有密切關(guān)系。其中，值得特別關(guān)注的是，Gh_A03G0673(MYB1R1)和Gh_A06G1626(抗病蛋白RPS5)在N植株中均不表達，而在WT植株中表達，推測轉(zhuǎn)入GhB301基因可能促進ERF轉(zhuǎn)錄因子的表達而抑制MYB轉(zhuǎn)錄因子和PR基因的表達。Gh_A02G1734(戊二酸/鐵依賴性雙加氧酶)基因在N植株中的表達量均高于WT，推測轉(zhuǎn)入GhB301基因可以提高氧化還原酶相關(guān)基因的表達。Gh_A13G2026(生長素應(yīng)答蛋白SAUR32)只在N株系中表達，推測轉(zhuǎn)入GhB301基因合影響棉花植株的生長發(fā)育。

　　2.4氧化還原過程中相關(guān)

　　DEGs活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)作為植物活性氧產(chǎn)生與清除的氧化還原產(chǎn)物，能夠參與植物的生長發(fā)育及應(yīng)激反應(yīng)[18]。對DEGs進行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)共有135個DEGs參與氧化還原過程(GO:0016684) 。

　　呼吸爆發(fā)氧化酶同系物(respiratoryburstoxidasehomologs，RBOHs)，又被稱作植物NADPH氧化酶，在細胞生長、植物發(fā)育、植物對非生物環(huán)境約束以及與生物相互作用的反應(yīng)中作為ROS生產(chǎn)者發(fā)揮作用，是重要的分子“中樞”[19]。本研究共鑒定出9個RBOHs參與氧化還原過程，即1個RBOHA(Gh_D08G1257)，2個RBOHB(Gh_D11G2743和Gh_A11G2426)，2個RBOHC(Gh_D07G0463和Gh_A07G0398)，3個RBOHD(Gh_A05G2211、Gh_D01G0990和Gh_D05G2471)，1個RBOHF(Gh_A12G2653)。其中RBOHB在2種材料中均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在N株系中，其表達量在6h即達到峰值，WT中則在12h達到峰值。而RBOHC、RBOHD、RBOHF在N植株中呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在WT中則呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢。

　　對ROS清除劑抗壞血酸過氧化物酶(ascorbicacidperoxidase，APX)，過氧化氫酶(catalase，CAT)，過氧化物酶(peroxidase，POD)，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase，GPX)等進行表達模式分析，共檢測到5種APX蛋白質(zhì)基因(Gh_D13G2402、Gh_A06G0383、Gh_A08G1745、Gh_A02G1648、Gh_A01G1388)，這些基因在N株系中表達量均明顯高于WT。

　　共鑒定到2種CAT基因(Gh_D03G0021和Gh_A05G1539)，在2種材料中均表現(xiàn)出先上調(diào)后下調(diào)的趨勢;2種POD基因(Gh_A08G0714和Gh_D08G0832)，在N株系中上調(diào)表達，在WT中則先上調(diào)后下調(diào);鑒定出3種GPX基因(Gh_A09G2408、Gh_D12G2260和Gh_A08G0673)，其在2種材料中的表達無明顯變化。另外，鑒定得到2個1-Cys(1-Cysperoxiredoxin)基因(Gh_D10G1825和Gh_A10G1567)和2個DOX(alphadioxygenase)基因(Gh_A05G3137和Gh_D09G1660)，在N株系中的表達量均低于WT。綜上，在ROS產(chǎn)生與清除過程中，眾多DEGs參與其中，其表達量復(fù)雜多樣的動態(tài)變化也反映出棉花在抵抗枯萎病感染的動態(tài)平衡中，氧化還原過程相關(guān)基因起著重要作用。

　　2.5植物防御反應(yīng)相關(guān)

　　DEGs在植物與病原物長期演化過程中，植物產(chǎn)生了一系列防御反應(yīng)機制來阻止病原物的侵害[20]。對所有DEGs進行GO富集，發(fā)現(xiàn)共有67個與防御反應(yīng)(GO:0006952)相關(guān)的DEGs，共注釋到33個PR10基因。這些PR10基因中存在20個MLP(majorlatexprotein)基因、7個BETV1(majorpollenallergenbetv 1)基因、4個NCS2(s-norcoclaurinesynthase2)基因、2個STH-2(pathogenesis-relatedproteinSTH-2)基因。Gh_D02G1678、Gh_A03G1240和Gh_D04G1394均注釋為MLP423基因，前2個基因在2種材料中均呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢，而Gh_D04G1394在N株系和WT中的表達模式不同，其在N株系先上調(diào)后下調(diào)，而在WT中則先下調(diào)后上調(diào)。

　　3討論

　　研究表明ERF轉(zhuǎn)錄因子與植物抗病響應(yīng)密切相關(guān)[23]。ERF1作為ET/JA響應(yīng)應(yīng)答調(diào)控因子起作用，過表達ERF1的擬南芥對枯萎病菌抗性增強，ERF2也具有類似的功能[24]。在擬南芥中過表達B3亞組的 AtERF14基因能夠增強防衛(wèi)基因的表達，并且ERF14突變體對枯萎病菌表現(xiàn)為更易感病[25]。本研究通過抗病性鑒定，發(fā)現(xiàn)接種枯萎病菌后過表達GhB301轉(zhuǎn)基因棉花與WT相比病情指數(shù)顯著降低，表明轉(zhuǎn)GhB301基因可以增強棉花的抗病性。

　　Fradin等[26]研究發(fā)現(xiàn)真菌孢子的萌發(fā)以及向表皮細胞的滲透一般發(fā)生在接菌后的0～12h。而植物的應(yīng)激反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和信息交換一般發(fā)生在真菌感染早期的40h左右[18，27]。本研究通過比較差異表達基因，發(fā)現(xiàn)接菌后6h時，轉(zhuǎn)基因棉花中大量的差異表達基因開始響應(yīng)，而WT棉花則在12h開始大量表達差異表達基因，說明轉(zhuǎn)GhB301棉花能夠更快響應(yīng)枯萎病菌的脅迫，這些差異表達基因的提前響應(yīng)可能會增強棉花的抗病性。在這些差異表達基因中，本研究重點關(guān)注了參與氧化還原過程、植物防御反應(yīng)以及苯丙烷代謝途徑的基因，其中氧化還原過程主要是植物產(chǎn)生和清除ROS的過程[19]。

　　本研究鑒定了9個呼吸爆發(fā)氧化酶同系物(RBOHs)，并且發(fā)現(xiàn)在N株系中的表達早于在WT中的表達。當植物受到病原菌等非生物脅迫時，植物在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，如果無法及時清除ROS，則會傷害植株。本研究鑒定出多個調(diào)控APX、CAT、POD和GPX等防御保護性酶合成的基因，并發(fā)現(xiàn)在N株系中的表達量高于WT。研究表明，這些酶可以清除植物體內(nèi)多余的ROS，從而保護植株免受枯萎病侵害[28]，本研究結(jié)果與其一致。在植物防御反應(yīng)中共鑒定到33個PR10蛋白，而PR10蛋白是植物抵御外界生物脅迫與非生物脅迫產(chǎn)生的一類病程相關(guān)蛋白。植物在受到尖孢鐮刀菌、黃萎病、青枯菌或者外源激素侵染后均能夠誘導(dǎo)PR10蛋白的表達[29-31]。

　　本研究還發(fā)現(xiàn)了3個MLP423基因，而前人研究發(fā)現(xiàn)煙草NbMLP423通過內(nèi)源激素信號途徑參與調(diào)控?zé)煵輰Τ嘈遣〉目剐约捌渌�生物過程[32]。推測GhB301基因轉(zhuǎn)入激活了植物防御反應(yīng)從而提高了棉花對枯萎病的抗性。本研究還發(fā)現(xiàn)9個MLO基因，在2個材料中的表達量差異較大，說明轉(zhuǎn)入ERF轉(zhuǎn)錄因子能夠影響MLO基因的表達，而MLO基因在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用[33]。

　　此外，Wang等[34]研究表明，NIMIN1.2可以通過介導(dǎo)在擬南芥中的氧化還原穩(wěn)態(tài)和JA/ET途徑來積極調(diào)控灰霉病的抗性。推測本研究發(fā)現(xiàn)的4個NIMIN-1基因可能通過茉莉酸/乙烯途徑影響棉花對枯萎病的抗性。HSPRO2基因在植物防御反應(yīng)中起重要作用，能夠響應(yīng)丁香假單胞菌的防御反應(yīng)[35-36]。本研究檢測到6個HSPRO2蛋白在N株系中的表達量高于WT，說明HSPRO2蛋白在棉花抵御枯萎病中發(fā)揮作用。

　　在苯丙烷代謝途徑中，研究發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要集中在BGLU、CAD和4CL等相關(guān)基因，其中BGLU基因作為香豆素合成的重要前體，其上調(diào)表達可以增加香豆素的含量。香豆素作為一種植物抗毒素，當植物受到病原菌侵染后迅速生成[37]。接種枯萎病菌后，BGLU相關(guān)基因表達量增加，表明轉(zhuǎn)GhB301基因可能 通過增加植物抗毒素從而使棉花抗病性增強。綜上所述，與WT相比，轉(zhuǎn)GhB301的棉花中存在大量的DEGs，其在表達量及表達時效方面均呈現(xiàn)出較強優(yōu)勢，能夠參與多種植物抗病反應(yīng)，從而增強棉花對枯萎病的抗性。

　　4結(jié)論

　　對轉(zhuǎn)基因棉花株系與野生型對照進行抗病性調(diào)查，發(fā)現(xiàn)過表達GhB301轉(zhuǎn)基因的棉花株系對枯萎病的抗病性顯著增強。對枯萎病菌侵染初期的棉花材料進行RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)了大量表達有關(guān)ROS產(chǎn)生和清除的氧化還原基因，以及與植物防御反應(yīng)相關(guān)的基因，并篩選出多個可能與棉花抗枯萎病有關(guān)的候選基因。推測過表達GhB301基因在棉花抵抗枯萎病的動態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物病原體相互作用和苯丙烷生物合成等途徑。本研究結(jié)果為揭示GhB301基因的功能及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。

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　　作者：劉戈輝1韓澤剛2孫士超1張薇1，*

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