大球蓋菇菌渣對(duì)鹽堿土區(qū)林地土壤的改良研究

　　摘要：為研究濱海鹽堿土區(qū)林地栽培大球蓋菇出菇后，剩余的栽培基質(zhì)(菌渣)就地還田對(duì)濱海鹽堿土區(qū)林地土壤的改良效果，選用3種不同含鹽量的林地栽培大球蓋菇，將出菇后的菌渣就地混翻于0~20cm土層鹽堿土壤中，自然降解4個(gè)月后，測(cè)定試驗(yàn)林地土壤理化性質(zhì)、養(yǎng)分含量及土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：施入大球蓋菇菌渣后，3種濱海鹽堿土區(qū)林地土壤的EC值、含鹽量及容重均顯著降低;土壤孔隙度、水穩(wěn)性團(tuán)聚體、有機(jī)質(zhì)、速效磷、堿解氮含量均顯著提高;3個(gè)處理樣地真菌群落的β多樣性變化明顯，強(qiáng)度鹽化處理樣地(Z2s)土壤真菌群落的α多樣性顯著提高。環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析表明，濱海鹽堿土區(qū)林地理化性質(zhì)與土壤真菌群落分布顯著相關(guān)。本研究結(jié)果表明施入大球蓋菇菌渣能有效降低濱海鹽堿土區(qū)林地的土壤含鹽量，優(yōu)化土壤理化性質(zhì)，改善土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，改良效果顯著。

　　關(guān)鍵詞：大球蓋菇菌渣;鹽堿土改良;土壤理化性狀;土壤真菌群落

　　我國(guó)濱海鹽堿土總面積達(dá)500萬(wàn)hm2，多年來(lái)主要采取一些物理措施整土、覆蓋、深耕、添加磷石膏、沸石粉及井溝渠灌等措施，來(lái)改變鹽堿地的土壤結(jié)構(gòu)，降低其含鹽量[1]，這些措施達(dá)到了一定的改良效果。但物理措施和水利工程方法需較大的工程量和較高的投資成本，化學(xué)手段存在二次污染等問題。而食用菌栽培過(guò)程中，出菇后剩余的栽培基質(zhì)又稱為菌渣，具有容重小、通氣性好，富含大量纖維素、菌絲蛋白等有機(jī)質(zhì)和多種微生物及酶等其他活性物質(zhì)的特性[2，3]。

　　國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)菌渣對(duì)改良土壤理化性狀，增加土壤養(yǎng)分含量,改良土壤微生物群落結(jié)構(gòu),促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)吸收都有著積極作用[47]。大球蓋菇(Strophariarugosoannulata)是近年來(lái)我國(guó)新興起栽培的一種珍稀食用菌品種，可在田間、林下、大棚等地進(jìn)行栽培，其栽培模式主要以各種農(nóng)林廢棄物為原料，通過(guò)堆積發(fā)酵、鋪料、播種進(jìn)行栽培生產(chǎn)，岀菇后殘余的大量栽培基質(zhì)(菌渣)可以就地還田，有改良土壤的作用。

　　本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明大球蓋菇在林地栽培出菇后，菌渣就地還田對(duì)林地土壤有較好的土壤改良效果[8]。然而菌渣還田對(duì)濱海鹽堿土的影響研究尚未見相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)擬通過(guò)探究3種不同含鹽量濱海鹽堿土區(qū)林地栽培大球蓋菇出菇后，菌渣就地還田對(duì)鹽堿土壤理化性質(zhì)、養(yǎng)分含量以及真菌群落的影響，以期為大球蓋菇在鹽堿地的栽培及其菌渣還田改良鹽堿地技術(shù)的推廣提供理論參考。

　　1材料與方法

　　1.1試驗(yàn)地概況及材料

　　試驗(yàn)地位于山東省林業(yè)科學(xué)研究院東營(yíng)分院(E118°41'33",N37°24'35")栽植的白蠟林下，樹齡6年，株行距3m×4m，郁閉度0.7，土壤類型為中度～強(qiáng)度鹽化土，為典型的濱海林地鹽堿土(含鹽量2‰～6‰)，土壤性狀背景值見表1。當(dāng)?shù)啬昃鶜鉁?2.8℃，年均降水量555.9mm，年均日照時(shí)數(shù)2657.5h。供試菌渣為2018年10月—2019年5月在鹽堿區(qū)林下栽培大球蓋菇，出菇結(jié)束后剩余的栽培基質(zhì)�；�質(zhì)配方為稻殼45%、闊葉雜木屑38%、玉米芯10%、林地土5%、生石灰2%，666.7m2栽培料施用量6500㎏。

　　1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

　　2019年6月3日出菇結(jié)束后，將原栽培大球蓋菇的3塊鹽化程度不同的鹽堿地上的菌渣，用旋耕機(jī)就地旋耕于地下，深度20cm，菌渣施入量(自然干重，含部分土壤)約20㎏/m2。小區(qū)面積30m2，每處理重復(fù)3次，各重復(fù)地塊之間相隔5m，對(duì)照組與處理組相隔10m，對(duì)照組只旋耕不添加菌渣。

　　1.3取樣方法

　　菌渣施入土壤自然降解4個(gè)月后，用環(huán)刀法取土樣用于測(cè)定土壤物理指標(biāo);通過(guò)“五點(diǎn)法”采集0~20cm土層土壤，上下層土混勻，“四分法”留取土樣，之后立即過(guò)2mm網(wǎng)篩，裝入已消毒的密封塑料袋中，液氮保存帶回試驗(yàn)室，一半用于測(cè)定土壤微生物指標(biāo)，一半風(fēng)干用于測(cè)定土壤理化指標(biāo)。

　　1.4土壤理化性質(zhì)的測(cè)定

　　土壤容重用環(huán)刀法測(cè)定，孔隙度(%)=(1容重/土粒密度)×100，pH值采用pHS2C型數(shù)字酸度計(jì)測(cè)定，電導(dǎo)率(EC5:1)采用DDS11A型電導(dǎo)儀測(cè)定，土壤水穩(wěn)團(tuán)聚體采用濕篩法測(cè)定，有機(jī)質(zhì)含量采用水合熱重鉻酸鉀氧化比色法測(cè)定，堿解氮采用擴(kuò)散吸收法測(cè)定，有效磷采用NaHCO3浸提鉬銻抗比色法測(cè)定，土壤含鹽量(‰)使用電導(dǎo)率法測(cè)定[9]。

　　1.5土壤真菌高通量的測(cè)定

　　1.5.1土壤微生物

　　DNA提取、測(cè)序、處理采用CTAB方法[10]對(duì)所采樣本的基因組DNA進(jìn)行提取。以稀釋后的基因組DNA為模板，使用帶Barcode的特異引物ITS51737F(GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)/ITS22043R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)，以及高保真酶擴(kuò)增ITS1區(qū)域。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃45s，58℃45s，72℃60s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，對(duì)目的條帶使用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。使用TruSeq®DNAPCRFreeSamplePreparationKit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit和QPCR定量，使用HiSeq2500PE250進(jìn)行上機(jī)測(cè)序(北京諾禾致源生物信息科技有限公司)。

　　根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后使用FLASH對(duì)每個(gè)樣品的reads進(jìn)行拼接，得到的拼接序列為原始Tags數(shù)據(jù)(RawTags);拼接得到的RawTags，參照Qiime的Tags質(zhì)量控制流程，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的過(guò)濾處理得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)(CleanTags)[11，12]。經(jīng)過(guò)以上處理后得到的Tags序列通過(guò)UCHIMEAlgorithm與數(shù)據(jù)庫(kù)Golddatabase進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)并去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)(EffectiveTags)[13，14]。

　　1.5.2OTU聚類和物種注釋

　　利用Uparse軟件[15]對(duì)所有樣品的全部EffectiveTags進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs(OperationalTaxonomicUnits)，同時(shí)選取OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為代表序列。用SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)[16]對(duì)代表序列進(jìn)行物種注釋，獲得分類學(xué)信息并分別在各個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用PyNAST軟件[17]與GreenGene數(shù)據(jù)庫(kù)中的"CoreSet"數(shù)據(jù)信息進(jìn)行快速多序列比對(duì)，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后以reads數(shù)最少的樣品為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

　　1.6數(shù)據(jù)處理

　　土壤性質(zhì)數(shù)據(jù)及微生物相對(duì)豐富度數(shù)據(jù)采用MicrosoftExcel2010進(jìn)行處理和圖表繪制;應(yīng)用IBMSPSS21.0中的Duncan’s法進(jìn)行單因素方差分析。使用Qiime軟件(Version1.7.0)計(jì)算土壤Observedspecies、ShannonWienerindex、Simpsonindex、Chao1指數(shù);使用R軟件進(jìn)行AlphaDiversity、BetaDiversity分析。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1大球蓋菇菌渣對(duì)鹽堿土區(qū)林地土壤理化性質(zhì)的影響

　　2.1.1對(duì)土壤物理性質(zhì)的影響

　　與對(duì)照組(CK)相比，施入大球蓋菇菌渣的各處理土壤容重顯著降低，土壤孔隙度、水穩(wěn)性團(tuán)聚體顯著增加;M1s、Z1s、Z2s處理土壤容重分別降低34.07%、46.58%、48.48%，土壤孔隙度分別增加28.78%、52.90%、52.50%，水穩(wěn)性團(tuán)聚體分別增加58.54%、111.33%、123.82%。各處理組(S)間差異不顯著，對(duì)照組(CK)間，M1ck組的土壤容重、土壤孔隙度與Z1ck、Z2ck組間有顯著差異，M1ck組的水穩(wěn)性團(tuán)聚體與Z2ck組間有顯著差異。結(jié)果表明，施入大球蓋菇菌渣后改善了濱海鹽堿土區(qū)林地的物理性質(zhì)。

　　2.1.2對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)和養(yǎng)分的影響

　　與各對(duì)照組(CK)相比，施加大球蓋菇菌渣的各處理組土壤EC值、含鹽量均顯著降低，土壤EC值分別降低40.43%、83.03%、88.98%，含鹽量分別降低45.45%、85.34%、90.42%;各處理組間的EC值、含鹽量差異不顯著，各對(duì)照組間的差異顯著。各處理組土壤有機(jī)質(zhì)、速效磷、堿解氮均顯著提高，土壤有機(jī)質(zhì)分別提高87.15%、138.50%、238.90%，速效磷分別提高401.33%、642.28%、965.80%，堿解氮分別提高79.86%、179.57%、269.89%。各處理組間有機(jī)質(zhì)、速效磷、堿解氮差異不顯著，各對(duì)照組間的差異顯著(Z1ck與Z2ck速效磷除外)。

　　2.2大球蓋菇菌渣對(duì)鹽堿土區(qū)林地土壤真菌群落的影響

　　2.2.1對(duì)土壤真菌的群落分布特征的影響

　　各組得到有效序列(effectivetags)均超過(guò)55000個(gè)，OTUs數(shù)目在400～800之間。各組真菌的相對(duì)豐富度在門水平上差異較大。與其他組相比，M1ck組的球囊菌門Glomeromycota(0.17%)，M1s組的單毛壺菌門Monoblepharomycota(0.04%)，Z1ck組的優(yōu)被孢霉門Mortierellomycota(13.94%)、捕蟲霉門Zoopagomycota(0.002%)，Z1s組的羅茲菌門Rozellomycota(1.30%)、擔(dān)子菌門Basidiomycota(37.23%)、毛霉菌門Mucoromycota(0.003%)，Z2ck組的壺門菌Chytridiomycota(1.57%)、芽枝霉門Blastocladiomycota(5.19%)，Z2s組的梳霉門Kickxellomycota(0.002%)、新麗鞭毛菌門Neocallimastigomycota(0.003%)的相對(duì)豐富度最高。

　　除Z1s處理組外，各組的最優(yōu)勢(shì)真菌群落是子囊菌門Ascomycota(>35%)，Z1s處理組的最優(yōu)勢(shì)真菌群落擔(dān)子菌門Basidiomycota(37.23%);與各對(duì)照組(CK)相比，各處理組的子囊菌門Ascomycota相對(duì)豐富度菌以及top10真菌群落的相對(duì)豐富度之和均顯著降低，M1s、Z1s、Z2s處理組的子囊菌門Ascomycota的相對(duì)豐富度分別降低33.87%、70.23%、29.18%，top10真菌群落的相對(duì)豐富度之和分別降低34.09%、27.06%、30.29%。結(jié)果表明，施加大球蓋菇菌渣顯著降低了濱海鹽堿地的子囊菌門及top10真菌群落的相對(duì)豐富度。

　　2.2.2對(duì)土壤功能真菌豐富度的影響

　　鹽堿土區(qū)林地土壤中具有解磷功能的真菌有青霉屬Penicillium、曲霉屬Aspergillus、鐮刀菌屬Fusarium，具有解鉀功能的真菌有黑曲霉Aspergillusniger，具有生防功能的真菌有木霉菌屬Trichoderma、節(jié)叢孢屬Arthrobotrys，林木病原真菌有尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum。

　　與對(duì)照組相比，M1s處理組的Penicillium、Fusarium、Aspergillusniger、Fusariumoxysporum相對(duì)豐富度顯著降低，Trichoderma、Arthrobotrys相對(duì)豐富度顯著增加，Z1s處理組的Aspergillus、Fusarium、Fusariumoxysporum相對(duì)豐富度顯著降低，Z2s處理組的Penicillium、Trichoderma相對(duì)豐富度顯著增加。結(jié)果表明，施入大球蓋菇菌渣后，鹽堿土區(qū)林地土壤功能真菌豐富度變化顯著，中度鹽化地(M1s)的木霉菌屬、節(jié)叢孢屬分別增加604.11%、236.36%;強(qiáng)度鹽化地(Z2s)的青霉屬、木霉菌屬分別增加874.55%、218.10%，其原因同上述;中度鹽化地(M1s)、強(qiáng)度鹽化地(Z1s)的尖孢鐮刀菌分別降低80.43%、74.44%，F(xiàn)usariumoxysporum為林木病原菌，其減少后有利于樹木健康生長(zhǎng)。

　　3討論與結(jié)論

　　大球蓋菇菌渣含有大量有機(jī)質(zhì)和多種微生物及酶等其他活性物質(zhì)，將其就地翻混于林地鹽堿土4個(gè)月后，土壤容重降低34.07%～48.48%，土壤孔隙度增加28.78%～52.90%，水穩(wěn)性團(tuán)聚體增加58.54%～123.82%，含鹽量降低45.45%～90.42%，有機(jī)質(zhì)增加87.15%～238.90%，速效磷增加401.33%～965.80%，堿解氮增加79.86%～269.89%。這與謝修鴻等[18]關(guān)于姬松茸菌糠改良蘇打鹽堿土的研究，陳世昌等[19]關(guān)于平菇菌渣改良普通耕作土的研究，以及胡留杰等[20]關(guān)于杏鮑菇等其他菌渣改良普通耕作土的研究結(jié)果較為相似，不同之處為本研究是出菇后就地還田，不需要將菌渣粉碎和二次發(fā)酵，其改良成本低，改良效果更為顯著。

　　施加大球蓋菇菌渣后，濱海鹽堿土區(qū)林地土壤微生物中的子囊菌門Ascomycota及top10真菌群落的相對(duì)豐富度顯著降低;中度鹽化地(M1s)的木霉菌屬、節(jié)叢孢屬分別增加604.11%、236.36%;強(qiáng)度鹽化地(Z2s)的青霉屬、木霉菌屬分別增加874.55%、218.10%;中度鹽化地(M1s)、強(qiáng)度鹽化地(Z1s)的尖孢鐮刀菌分別降低80.43%、74.44%。這可能由于外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)施入土壤后，為真菌微生物提供了大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而改變真菌微生物的群落豐富度所致[21]。微生物群落結(jié)構(gòu)可反映微生物競(jìng)爭(zhēng)和協(xié)作等相互關(guān)系，群落結(jié)構(gòu)影響微生物群落的功能和變化，從而導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)的改變[22,23]。

　　本研究對(duì)濱海鹽堿土壤真菌群落Beta多樣性分析表明，菌渣對(duì)土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)改變顯著。濱海鹽堿地土壤微生物群落與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)與土壤孔隙度、有機(jī)質(zhì)等理化性質(zhì)顯著相關(guān)，這與陳莉莉等[24]關(guān)于土壤微生物群落與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性結(jié)果較為一致。但本研究表明，鹽堿土區(qū)林地土壤真菌微生物群落的豐富度變化幅度更大，分析原因?yàn)榇笄蛏w菇林地栽培特點(diǎn)是栽培基質(zhì)數(shù)量大，菌渣還田4個(gè)月測(cè)量數(shù)據(jù)時(shí)，剩余的菌絲和菌渣還未完全降解，之后隨著菌渣降解時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤群落豐富度變化趨勢(shì)會(huì)相對(duì)穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)得到驗(yàn)證[8]。

　　大球蓋菇在林地栽培出菇后，出菇畦面上仍有約20kg/m2的菌渣留在土壤中，菌渣剩余量大，就地翻混還田改良土壤成本低。本試驗(yàn)表明：濱海鹽堿土施加大球蓋菇菌渣后，土壤EC值、含鹽量及土壤容重均顯著降低;土壤孔隙度、有機(jī)質(zhì)、速效磷、堿解氮含量均顯著提高;土壤中子囊菌門Ascomycota及top10真菌群落的相對(duì)豐富度顯著降低;強(qiáng)度鹽化地(Z2s)土壤真菌群落豐富度顯著提高，Alpha多樣性顯著提高;鹽堿地土壤真菌群落的Beta多樣性顯著改變;鹽堿地理化性質(zhì)與土壤真菌群落結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)。本研究結(jié)果為濱海鹽堿土的改良探討了一條新的有效途徑。

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　　作者：齊廣耀1，張書菡1*，孫建平2，劉雅輝2，蘇斌1，呂騏羽1，姜淑霞1

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