燈盞花及多舌飛蓬葉綠體基因組特征與系統(tǒng)發(fā)育分析

　　摘要本研究利用二代測(cè)序技術(shù)IlluminaHiseq平臺(tái)對(duì)飛蓬屬(Erigeron)藥用植物燈盞花(ErigeronBreviscapus)及其近緣種多舌飛蓬(Erigeronmultiradiatus)進(jìn)行了葉綠體全基因組測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)分析方法進(jìn)行序列組裝、注釋和基本結(jié)構(gòu)分析，并將其與19個(gè)已發(fā)表的植物葉綠體全基因組進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示，葉綠體全基因組長(zhǎng)度范圍為152175~152372bp，大單拷貝區(qū)的范圍為84684~84881bp，小單拷貝區(qū)的范圍為18102~18133bp，兩個(gè)反向重復(fù)區(qū)的范圍為24667~24699bp。葉綠體全基因組中的GC含量范圍為37.1%~37.2%，共注釋到129個(gè)基因，其中蛋白編碼基因(PCGs)84個(gè)，tRNA基因37個(gè)，rRNA基因8個(gè)。在飛蓬屬葉綠體基因組中共檢測(cè)到簡(jiǎn)單重復(fù)序列88~92個(gè)，長(zhǎng)重復(fù)序列47~49個(gè);此外，在變異熱點(diǎn)區(qū)域篩選到9個(gè)高變片段。系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示，多舌飛蓬與燈盞花以100%的支持率聚為一支，互為姊妹群。本研究結(jié)果將為燈盞花保護(hù)遺傳學(xué)和資源開發(fā)利用等研究提供理論基礎(chǔ)。

　　關(guān)鍵詞燈盞花;多舌飛蓬;葉綠體基因組;SSR;系統(tǒng)發(fā)育

　　燈盞花(Erigeronbreviscapus(Vant.)HandMazz.)又名燈盞細(xì)辛和短葶飛蓬，為菊科(Compositae)飛蓬屬(Erigeron)多年生草本植物，主要分布于中國(guó)云南、四川等西部和西南部海拔1200~3500m的中山和高山開闊山坡草地、林緣或疏林下(中國(guó)植物志編輯委員會(huì),1985,科學(xué)出版社,pp.308)。燈盞花藥材味辛、微苦，性溫，歸心、肝經(jīng)。具有散寒解表、祛風(fēng)除濕、舒筋活血、消積止痛等功效(中國(guó)藥典委員會(huì),2020,中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,pp.154)。

　　現(xiàn)臨床上主要用于心腦血管疾病及其后遺癥、癱瘓等治療。燈盞花作為治療心血管病的原料藥，是云南的道地藥材之一。燈盞花成片分布的地區(qū)很少，隨著人們對(duì)燈盞花藥材需求量的不斷增加以及對(duì)野生資源量的過(guò)度采集，野生資源蘊(yùn)藏量已不能滿足人類需求和企業(yè)生產(chǎn)的需要。

　　燈盞花種子細(xì)小、世代周期短，品種極易退化，而且其嚴(yán)格的自交不親和性也容易引起品種的混雜退化，因此，需要不斷篩選優(yōu)良野生種源，培育成分專用型新品種，擴(kuò)大新藥源以滿足藥材生產(chǎn)的需求(李銳等,2019)。多舌飛蓬(Erigeronmultiradiatus(Wall.)Benth.)與燈盞花為同屬植物，分布于中國(guó)四川和云南等地，常生長(zhǎng)于海拔2500~4600m亞高山和高山草地、山坡和林緣;資源豐富，在藏醫(yī)藥中以全草入藥。

　　一般來(lái)說(shuō)，植物物種之間的親緣關(guān)系越近，所含的化學(xué)成分也越相近。因此，利用植物類群之間的親緣關(guān)系，就能較快地發(fā)現(xiàn)新藥源和替代品。已有報(bào)道對(duì)燈盞花及其近緣種多舌飛蓬進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，得出多舌飛蓬質(zhì)量尚可，有替代燈盞花藥材的可能(肖琳婧等,2019)。 葉綠體是植物中重要的細(xì)胞器，在光合作用和碳固定中起著關(guān)鍵作用，現(xiàn)在普遍認(rèn)為葉綠體起源于內(nèi)共生藍(lán)藻，具有自主遺傳基因組(Dyalletal.,2004)。研究表明，大部分被子植物的葉綠體基因組具有典型的環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)(張明英等,2020)。

　　包括：1個(gè)大單拷貝區(qū)(largesinglecopyregion,LSC)、1個(gè)小單拷貝區(qū)(smallsinglecopyregion,SSC)以及2個(gè)反向重復(fù)區(qū)(invertedrepeatregions,IRa/IRb)，大小一般在120~220kb，大約包括130個(gè)基因，主要包括3類：與基因表達(dá)相關(guān)的基因，與光合作用相關(guān)的基因和RNA基因(Yangetal.,2017)。與核基因組和線粒體基因組相比，葉綠體基因組具有結(jié)構(gòu)保守、單親遺傳不存在重組、序列變異度適中等特點(diǎn)，是分子生物學(xué)研究中的重要工具(Jansenetal.,2007)。

　　自從1986年葉綠體全基因組在煙草(Shinozakietal.,1986)、地錢(Ohyamaetal.,1986)中首次公布以來(lái)，現(xiàn)在已經(jīng)超過(guò)3300條葉綠體基因組被GenBank收錄(姜汶君等,2020)。葉綠體全基因組序列的測(cè)定不僅加速了物種在進(jìn)化、遷徙方面的研究，還對(duì)物種的鑒定、分子標(biāo)記、系統(tǒng)發(fā)育等研究起著巨大的推進(jìn)作用(武立偉等,2020)。

　　本研究基于二代高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法，對(duì)不同居群燈盞花及其近緣種多舌飛蓬進(jìn)行葉綠體全基因組測(cè)序、組裝、注釋，并且對(duì)其序列變異和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行解析，并選擇了17個(gè)已發(fā)表的菊科植物，2個(gè)與菊科親緣關(guān)系較近的桔�？浦参�(外類群)葉綠體全基因組進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。旨在為燈盞花的資源開發(fā)利用、飛蓬屬植物種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、物種鑒定以及尋找新藥源等研究奠定了基礎(chǔ)。

　　1結(jié)果與分析

　　1.1燈盞花、多舌飛蓬葉綠體全基因組基本特征及分類燈盞花、多舌飛蓬具有與大多數(shù)被子植物葉綠體基因相似的環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)。不同居群燈盞花的葉綠體全基因組長(zhǎng)度范圍為152175~152372bp，多舌飛蓬葉綠體全基因組長(zhǎng)度為152281bp，GC含量范圍為37.1%~37.2%;燈盞花大單拷貝區(qū)(LSC)長(zhǎng)度為84684~84881bp，小單拷貝區(qū)(SSC)長(zhǎng)度為18102~18133bp，兩個(gè)反向重復(fù)區(qū)(IRa/IRb)范圍為24667~24699bp;多舌飛蓬的LSC長(zhǎng)度為84789bp，SSC長(zhǎng)度為18110bp，IR區(qū)長(zhǎng)度為24691bp。所有居群葉綠體基因組均注釋到129個(gè)基因，其中蛋白編碼基因(PCGs)84個(gè)，tRNA基因37個(gè)，rRNA基因8個(gè)。

　　燈盞花與多舌飛蓬基因分類情況，根據(jù)其功能可以將它們分為3類：第一類是與光合作用系統(tǒng)有關(guān)的基因，包括光系統(tǒng)I基因(5個(gè))、光系統(tǒng)Ⅱ基因(15個(gè))、NADPH氧化還原酶基因(11個(gè))、二磷酸核酮糖羧化酶大亞基基因(1個(gè))、ATP酶基因和細(xì)胞色素b/f復(fù)合體基因各6個(gè);第二類是與轉(zhuǎn)錄、翻譯有關(guān)的基因，包括核糖體RNA基因(4個(gè))、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)基因(30個(gè))、RNA聚合酶亞基基因(4個(gè))、核糖體蛋白基因(21個(gè))和翻譯起始密碼子基因(1個(gè))等;第三類是與其他生物合成相關(guān)的基因，如matK、ccsA等。

　　在這些基因中含有17個(gè)雙拷貝基因，包括1個(gè)ATP酶基因(atpF)、2個(gè)細(xì)胞色素b/f復(fù)合體基因(petB,petD)、2個(gè)NADPH氧化還原酶基因(ndhA,ndhB)、1個(gè)RNA聚合酶亞基基因(rpoC1)、核糖體蛋白大/小亞基基因各2個(gè)(rpl2,rpl16,rps12,rps16)、6個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因(trnAUGC,trnGUCC,trnIGAU,trnKUUU,trnLUAA,trnVUAC)、未知功能基因1個(gè)(ycf3)。

　　1.2長(zhǎng)重復(fù)序列及SSR分析

　　本研究利用在線微衛(wèi)星識(shí)別軟件MISA，在燈盞花和多舌飛蓬葉綠體基因組中共檢測(cè)到簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simplezsequencerepeat,SSR)88~92個(gè)。其中單核苷酸重復(fù)(Mononucleotides)32~36個(gè)(34.78%~40.45%)，二核苷酸重復(fù)(Dinucleotides)19~23個(gè)(20.88%~25.00%)，三核苷酸重復(fù)(Trinucleotides)14~15個(gè)(15.91%~16.85%)，四核苷酸重復(fù)(Tetranucleotides)13~16個(gè)(14.61%~18.18%)，五核苷酸重復(fù)(Pentanucleotide)4~6個(gè)(4.35%~6.74%)，六核苷酸重復(fù)(Hexanucleotide)除居群ML、SM、XW檢測(cè)到1個(gè)外(1.09%~1.12%)，其余居群未檢測(cè)到。

　　除SSRs外，長(zhǎng)度≥30bp的重復(fù)被認(rèn)為是長(zhǎng)重復(fù)序列。對(duì)本研究的6個(gè)居群進(jìn)行長(zhǎng)重復(fù)序列檢測(cè)，除SM居群檢測(cè)到47個(gè)長(zhǎng)重復(fù)序列外，其他居群均檢測(cè)到49個(gè)長(zhǎng)重復(fù)。多舌飛蓬總的49個(gè)長(zhǎng)重復(fù)，包括23個(gè)回文重復(fù)、19個(gè)正向重復(fù)、6個(gè)反向重復(fù)、1個(gè)互補(bǔ)重復(fù);燈盞花的回文重復(fù)為22~23個(gè)，正向重復(fù)17~19個(gè)，反向重復(fù)4~8個(gè)，互補(bǔ)重復(fù)1~3個(gè)。這些重復(fù)序列中大部分序列在基因間隔區(qū)，長(zhǎng)度在30~42bp之間。

　　2討論

　　燈盞花是云南重點(diǎn)開發(fā)的“五大天然系列”藥物之一，由于其在心腦血管系統(tǒng)疾病上具有較高的藥用價(jià)值，在醫(yī)藥生產(chǎn)方面需求較大。目前，燈盞花人工種植現(xiàn)已初具規(guī)模，為了保證其原材料的品質(zhì)和穩(wěn)定性，已有報(bào)道通過(guò)RADP(周利杰等,2005;楊生超等,2008)、DALP(劉潔,2006)、ISSR(楊生超等,2010)、燈盞花DNA指紋圖譜(熊勇等,2012)、AFLP(張薇等,2013)等分子手段為燈盞花育種提供了理論依據(jù)和育種素材。

　　本研究基于葉綠體全基因組及系統(tǒng)發(fā)育分析的角度，對(duì)上述研究進(jìn)行補(bǔ)充�；�于二代高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法對(duì)燈盞花及其近緣種多舌飛蓬葉綠體全基因組進(jìn)行了分析研究。結(jié)果顯示，燈盞花、多舌飛蓬均具有被子植物葉綠體基因組典型的四分體結(jié)構(gòu)，所編碼的基因數(shù)量、類別和排列順序高度一致，基因組序列總長(zhǎng)152175~152372bp，葉綠體基因組總共編碼129個(gè)基因，其中蛋白編碼基因(PCGs)84個(gè)，tRNA基因37個(gè)，rRNA基因8個(gè)。

　　葉綠體全基因組中的GC含量范圍為37.1%~37.2%，這與大多數(shù)被子植物葉綠體基因組具有31.0%~38.0%的GC含量相似，如橢圓葉花錨(王虹雨等,2021,私人通信)、花園君子蘭(吳海紅等,2021,私人通信)、平托花生(張小利等,2021,私人通信)等。在SSC、LSC和IR區(qū)的GC含量表現(xiàn)出明顯的差別，分別為31.0%、35.0%~35.1%、43.1%~43.2%。IR區(qū)的GC含量較高可能是由于該區(qū)域的rRNA基因具有高水平的GC值，而SSC區(qū)的低GC含量可能與位于該區(qū)域的NADH相關(guān)(Zhengetal.,2006)。

　　葉綠體基因組中的SSRs因含量豐富、多態(tài)性高，且為母系遺傳等優(yōu)點(diǎn)而被作為分子標(biāo)記廣泛用于物種群體遺傳學(xué)(Jayaswalletal.,2021)、譜系地理學(xué)(Chmielewskietal.,2015)等研究。本研究通過(guò)在線軟件分析共得到燈盞花、多舌飛蓬簡(jiǎn)單重復(fù)88~92個(gè)，長(zhǎng)重復(fù)47~49個(gè)，這些重復(fù)序列可以為燈盞花、多舌飛蓬的遺傳多樣性及保護(hù)遺傳學(xué)等相關(guān)研究提供候選分子標(biāo)記。

　　IR區(qū)邊界的擴(kuò)張和收縮被認(rèn)為是被子植物葉綠體基因組大小變化的主要原因。本研究通過(guò)對(duì)燈盞花與多舌飛蓬葉綠體基因組IR/SC邊界分析發(fā)現(xiàn)，燈盞花與其近緣種多舌飛蓬葉綠體基因組IRs區(qū)大小和基因組成高度保守。被子植物葉綠體基因組序列中的一些高變異區(qū)由于其序列短，能作為DNA條形碼經(jīng)濟(jì)、快速的區(qū)分不同屬的植物，往往可以作為物種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析等相關(guān)研究的分子標(biāo)記(Lietal.,2019)。

　　基于mVISTA和DNAsp軟件分析結(jié)果顯示，在7個(gè)非編碼區(qū)(rps2atpI,trnTpsbD,trnTtrnL,ndhCatpE,ndhFtrnL,trnTUGUtrnLUAA,ccsAndhD)和2個(gè)編碼區(qū)(ycf3,ndhD)存在明顯變異。這些區(qū)域可能在物種水平上進(jìn)行更快速地核苷酸取代，了解和掌握這些變異熱點(diǎn)，不僅有利于理解飛蓬屬葉綠體基因組進(jìn)化特點(diǎn)，而且基于這些序列片段設(shè)計(jì)分子標(biāo)記，可為燈盞花分子鑒定的DNA條形碼篩選提供參考。 本研究利用從NCBI下載的17條菊科、2條桔�？浦参�(外類群)的葉綠體基因組序列以及本試驗(yàn)測(cè)得的5個(gè)燈盞花和1個(gè)多舌飛蓬葉綠體基因組序列構(gòu)建ML系統(tǒng)進(jìn)化樹，以探討燈盞花和多舌飛蓬的系統(tǒng)進(jìn)化位置關(guān)系。結(jié)果以100%的支持率把多舌飛蓬與燈盞花聚為一支，互為姊妹群。

　　綜上所述，燈盞花與多舌飛蓬葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征相似，序列差異較小。因此，本研究從葉綠體基因組角度認(rèn)為多舌飛蓬可作為燈盞花的替代品。此研究結(jié)果進(jìn)一步支持了肖琳婧等(2019)對(duì)燈盞花及其近緣種質(zhì)量評(píng)價(jià)研究得出的結(jié)論。本研究對(duì)燈盞花及其近緣種多舌飛蓬葉綠體全基因組測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析不僅豐富了菊科植物葉綠體基因組序列的數(shù)量，同時(shí)為飛蓬屬物種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、篩選優(yōu)良種質(zhì)及選取替代藥材、實(shí)現(xiàn)該藥用植物的可持續(xù)利用提供理論基礎(chǔ)。

　　3材料與方法

　　3.1試驗(yàn)材料

　　采集飛蓬屬內(nèi)的兩個(gè)種，其中燈盞花(Ebreviscapus)5個(gè)野生居群，多舌飛蓬(E.multiradiatus)1個(gè)野生居群。樣品由云南中醫(yī)藥大學(xué)李國(guó)棟副教授鑒定。采集到的新鮮幼嫩葉片放入硅膠中快速脫水干燥，用于基因組DNA提取。憑證標(biāo)本存放于云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥材優(yōu)良種苗繁育工程研究中心。

　　3.2基因組

　　DNA提取與測(cè)序取新鮮幼嫩葉片，利用植物基因組DNA提取試劑盒(BioTeke公司,北京)提取總DNA。使用瓊脂糖凝膠電泳和NanodropOne超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量及濃度。將檢測(cè)合格的DNA送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司采用IlluminaHiSeq2500PE150平臺(tái)進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序。

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　　作者：田星1李中霽1劉小莉2*李國(guó)棟1*

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