本文摘要：摘要：設(shè)計(jì)不同濃度的CaCl2溶液，在對(duì)菠菜(Spinacia oleracea L.)鹽脅迫前采用根部澆灌和葉部噴施的方法進(jìn)行誘導(dǎo)，鈣誘導(dǎo)5 d后，對(duì)菠菜幼苗再進(jìn)行150 mmol/L NaCl溶液處理，測(cè)定其形態(tài)建成和生理生化指標(biāo)。結(jié)果表明，外源鈣能顯著提高鹽脅迫下菠菜的形態(tài)建成
摘要：設(shè)計(jì)不同濃度的CaCl2溶液，在對(duì)菠菜(Spinacia oleracea L.)鹽脅迫前采用根部澆灌和葉部噴施的方法進(jìn)行誘導(dǎo)，鈣誘導(dǎo)5 d后，對(duì)菠菜幼苗再進(jìn)行150 mmol/L NaCl溶液處理，測(cè)定其形態(tài)建成和生理生化指標(biāo)。結(jié)果表明，外源鈣能顯著提高鹽脅迫下菠菜的形態(tài)建成指標(biāo);顯著增加可溶性蛋白質(zhì)和葉綠素含量;顯著提高SOD和POD活性;顯著降低丙二醛(MDA)和游離脯氨酸含量。當(dāng)外源鈣離子濃度為30 mmol/L時(shí)，其降低鹽脅迫傷害效應(yīng)的效果較好。
關(guān)鍵詞：菠菜(Spinacia oleracea L.);鹽脅迫;外源鈣;化學(xué)誘抗劑;生理效應(yīng)
隨著鹽堿地面積的不斷增加和土壤鹽漬化程度的日益加劇，農(nóng)作物的生產(chǎn)受到極大影響，土壤鹽漬化成為制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素[1]。另外，隨著工業(yè)污染的加劇、海水的盲目開發(fā)利用、化肥的大量投入以及設(shè)施生產(chǎn)的迅猛發(fā)展，導(dǎo)致了土壤次生鹽漬化加重[2]，土壤鹽漬化已成為設(shè)施栽培中普遍存在的問(wèn)題。對(duì)北京、濟(jì)南、上海、江蘇等地大棚土壤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大棚土壤普遍存在著不同程度的次生鹽漬化現(xiàn)象，己嚴(yán)重影響了蔬菜作物的生長(zhǎng)發(fā)育[3]。鹽脅迫對(duì)植物的影響機(jī)理可綜合為阻礙植物的生長(zhǎng)發(fā)育[4]、造成滲透脅迫[5]、離子失衡[6]、活性氧傷害[7]、營(yíng)養(yǎng)虧缺[8]和抑制光合作用[9]等。目前，針對(duì)鹽害可采取2種措施來(lái)進(jìn)行改良，一是改良土壤;二是進(jìn)行農(nóng)作物耐鹽育種和栽培，提高農(nóng)作物的耐鹽性。而利用生物措施來(lái)治理鹽害被普遍認(rèn)為是最經(jīng)濟(jì)有效的方法[10]�；瘜W(xué)誘抗劑一般是指能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗逆反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)，也稱為抗逆誘導(dǎo)子或抗逆激發(fā)子，具有無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)污染的特點(diǎn)，因而采用化學(xué)誘抗劑提高作物耐鹽性是與發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)相適應(yīng)的一項(xiàng)重要綠色生產(chǎn)技術(shù)。Ca2+作為植物必需的一種礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，在保護(hù)植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性、穩(wěn)定細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)離子運(yùn)輸和選擇性、控制離子交換行為和細(xì)胞壁中酶活性中扮演了關(guān)鍵角色[11]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)Ca2+參與鹽脅迫等多種逆境脅迫過(guò)程，施加鈣一方面可以緩解因Ca2+不足而引起的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)脅迫，另一方面可以增強(qiáng)質(zhì)膜的穩(wěn)定性和鈣信號(hào)系統(tǒng)的正常功能，阻止細(xì)胞內(nèi)K+的外流和Na+的大量進(jìn)入，以維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡，從而提高植物的抗鹽性[12]。
菠菜(Spinacia oleracea L.) 是一種重要的葉菜類蔬菜，營(yíng)養(yǎng)豐富[13]， 在世界范圍內(nèi)均有較大栽培面積。菠菜為中等耐鹽作物，但是在鹽堿地栽培及次生鹽漬化比較嚴(yán)重的大棚栽培生產(chǎn)中，鹽脅迫嚴(yán)重影響了其產(chǎn)量與品質(zhì)。有關(guān)外源鈣離子作為化學(xué)誘抗劑能否提高鹽脅迫下菠菜耐鹽性、其運(yùn)用效果如何等方面的研究還未見報(bào)道。因此，本研究設(shè)計(jì)了6個(gè)不同濃度Ca2+進(jìn)行誘導(dǎo)，研究了外源鈣離子誘導(dǎo)后對(duì)鹽脅迫下菠菜幼苗的形態(tài)建成、生理生化指標(biāo)的影響，探討了其降低菠菜幼苗鹽害效應(yīng)的生理生化機(jī)制，為充分利用鹽堿地種植蔬菜，減輕設(shè)施園藝生產(chǎn)中土壤次生鹽漬化問(wèn)題，培養(yǎng)健壯幼苗并提高其耐鹽性等方面提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 種苗培養(yǎng)
以日本春秋大葉菠菜為試驗(yàn)材料，將菠菜種子播于塑料營(yíng)養(yǎng)缽中，采用基質(zhì)草炭∶蛭石=2∶1(體積比)，每立方米加入腐熟膨化雞糞5 kg、三元素復(fù)合肥1.5 kg，用50%多菌靈100 g/m3消毒。待幼苗長(zhǎng)到有6片真葉時(shí)，移入裝有相同基質(zhì)的塑料盆。
1.2 材料處理
菠菜移栽10 d后，進(jìn)行根際初始誘導(dǎo)，誘抗劑CaCl2的濃度分別設(shè)為0、10、20、30、40、50 mmol/L，共6個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。用根灌法在幼苗根部澆入不同濃度的CaCl2，每株20 mL;初始誘導(dǎo)2 d后葉面噴施進(jìn)行強(qiáng)化誘導(dǎo)，用手持小噴霧器，均勻噴灑幼苗葉部，以量足但不滴為準(zhǔn)。強(qiáng)化誘導(dǎo)3 d后施加鹽脅迫，用根灌法把150 mmol/L NaCl溶液緩慢注入根際基質(zhì)中，每盆40 mL，早晚各脅迫1次。
1.3 指標(biāo)測(cè)定與數(shù)據(jù)分析
鹽脅迫后第5天取樣進(jìn)行菠菜形態(tài)建成指標(biāo)和生理生化指標(biāo)的測(cè)定。測(cè)定幼苗株高(子葉節(jié)到生長(zhǎng)點(diǎn)之間的距離)、莖粗(莖基部)、展開葉片數(shù)、全株鮮重及全株干重，記錄數(shù)據(jù)最后計(jì)算出壯苗指數(shù)。
壯苗指數(shù)=莖粗/株高×全株干重
葉綠素含量的測(cè)定采用SPAD法測(cè)定;丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法;超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用NBT光化還原法;過(guò)氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定;可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法;游離脯氨酸活性的測(cè)定采用茚三酮法。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，并對(duì)平均數(shù)采用LSD法進(jìn)行多重比較。
2 結(jié)果與分析
2.1 外源Ca2+對(duì)NaCl脅迫下菠菜形態(tài)建成指標(biāo)的影響
由表1可知，不同濃度的Ca2+誘導(dǎo)對(duì)鹽脅迫下菠菜生長(zhǎng)發(fā)育的影響存在顯著差異。其中，30 mmol/L的Ca2+誘導(dǎo)下菠菜長(zhǎng)勢(shì)最好，未用Ca2+誘導(dǎo)的菠菜長(zhǎng)勢(shì)最差。其中株高、展開葉片、干重和壯苗指數(shù)中，30 mmol/L Ca2+處理與其他各濃度處理相比差異均達(dá)到顯著水平。表明施用Ca2+濃度為30 mmol/L時(shí)，能顯著促進(jìn)鹽脅迫下菠菜的生長(zhǎng)發(fā)育和提高壯苗指數(shù)，有效緩解和減輕菠菜的鹽害效應(yīng)，而較高濃度的Ca2+則顯著降低了壯苗指數(shù)，反而對(duì)菠菜幼苗的形態(tài)建成不利。
2.2 外源Ca2+對(duì)NaCl脅迫下菠菜葉片中葉綠素和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響
鹽脅迫下，外源鈣離子對(duì)菠菜葉片中葉綠素和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響存在差異(圖1)。對(duì)于葉綠素含量而言，與對(duì)照相比低濃度的外源Ca2+對(duì)葉綠素含量影響不顯著，但是當(dāng)其濃度增加到30 mmol/L時(shí)，則可以顯著提高菠菜葉片葉綠素含量;而進(jìn)一步提高外源Ca2+濃度其作用效果呈明顯下降的趨勢(shì)。由此可見，當(dāng)遭受鹽脅迫時(shí)，外施濃度為30 mmol/L Ca2+可使菠菜葉片葉綠素正常合成，從而緩解葉片鹽脅迫下光合作用的降低。對(duì)于可溶性蛋白質(zhì)含量來(lái)說(shuō)，低濃度Ca2+誘導(dǎo)后，幼苗葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量與對(duì)照相比差異未達(dá)到顯著水平(圖1)，表明外施低濃度的外源鈣離子沒有達(dá)到其效果;而較高濃度的Ca2+誘導(dǎo)后，其含量反而比低濃度處理的顯著降低。當(dāng)外源鈣離子為30 mmol/L時(shí)，可以顯著增加菠菜葉片可溶性蛋白質(zhì)的含量。
2.3 外源Ca2+對(duì)鹽脅迫下菠菜葉片中MDA和游離脯氨酸含量的影響
與對(duì)照相比，使用外源Ca2+誘導(dǎo)后可顯著降低鹽脅迫下菠菜葉片中MDA的累積(圖2)。但不同濃度的Ca2+誘導(dǎo)處理之間差異不顯著，說(shuō)明不同Ca2+濃度的誘導(dǎo)均能有效降低菠菜葉片中的MDA含量。對(duì)于游離脯氨酸而言，10～20 mmol/L的外源Ca2+誘導(dǎo)下其處理之間差異未達(dá)到顯著水平，但是當(dāng)外源Ca2+誘導(dǎo)濃度提高到30 mmol/L-1時(shí)，則可顯著增加菠菜葉片中游離脯氨酸的含量;而進(jìn)一步增加Ca2+誘導(dǎo)濃度，其作用效果則明顯下降(圖2)。
2.4 外源Ca2+對(duì)鹽脅迫下菠菜葉片中SOD和POD活性的影響
外源Ca2+對(duì)鹽脅迫下菠菜葉片中SOD和POD活性的影響見圖3。從圖3可知，隨著外源Ca2+誘導(dǎo)濃度的增加，菠菜葉片中SOD和POD活性呈先升高后降低的趨勢(shì)。使用一定濃度范圍內(nèi)的外源Ca2+誘導(dǎo)可顯著增加SOD和POD活性。對(duì)于SOD，10 mmol/L的Ca2+誘導(dǎo)濃度與對(duì)照相比能顯著提高菠菜葉片SOD活性， 但與20 mmol/L Ca2+誘導(dǎo)濃度處理間差異不顯著。而20～40 mmol/L Ca2+誘導(dǎo)濃度處理間差異也未達(dá)到顯著水平。當(dāng)Ca2+濃度增加到50 mmol/L時(shí)，反而使SOD活性顯著降低。當(dāng)Ca2+濃度為30 mmol/L時(shí)，菠菜葉片POD活性達(dá)到最高值，與其他處理間差異顯著。
3 討論
鹽脅迫是影響作物生長(zhǎng)和降低作物產(chǎn)量的主要障礙因子之一。從形態(tài)建成指標(biāo)來(lái)看，鹽分對(duì)非鹽生植物的脅迫效應(yīng)就是阻止其生長(zhǎng)[14]。在本試驗(yàn)中，NaCl脅迫使菠菜的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，而通過(guò)使用外源Ca2+進(jìn)行誘導(dǎo)后可顯著緩解這種抑制作用，且能顯著增加干物質(zhì)的積累和提高壯苗指數(shù)，增強(qiáng)植株的耐鹽性。但過(guò)高濃度的Ca2+進(jìn)行誘導(dǎo)后其作用效果反而顯著下降，可能是CaCl2也作為一種鹽分，增加了土壤根際中的Cl-，抑制根系對(duì)NO3ˉ等陰離子養(yǎng)分的吸收[15]。
研究表明，各種細(xì)胞器中受鹽分影響比較敏感的是葉綠素[16]。鹽脅迫條件下，NaCl能增強(qiáng)葉綠素酶的活性， 加速葉綠素分解。本研究中，使用30 mmol/L以上外源Ca2+后可顯著提高菠菜葉綠素含量，這與在蕓薹屬植物上的研究結(jié)果一致[17]。CaCl2能提高葉綠素含量，其可能的機(jī)理是CaCl2能提高抗氧化酶活性，清除活性氧，有效延緩葉綠素含量的下降，增強(qiáng)菠菜對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)，提高葉片捕捉和利用光能的能力。此外，外源鈣能提高菠菜葉片中的可溶性蛋白質(zhì)含量，這與劉雪琴等[18]在玉米上的研究結(jié)果一致。
鹽脅迫下MDA含量的增加可能是活性氧(ROS)所導(dǎo)致的氧化脅迫對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞[19]，而外源Ca2+減少或阻止鹽脅迫下Na+對(duì)Ca2+的替換，從而提高了膜的流動(dòng)性、減少了活性氧的產(chǎn)生[20]以及抑制了膜脂的過(guò)氧化，以維持細(xì)胞膜正常的結(jié)構(gòu)，保證植物體各種代謝循環(huán)的正常進(jìn)行。另外，游離脯氨酸作為一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在逆境條件下大量累積[21]，待逆境解除后主要用來(lái)參與葉綠素的合成，隨著逆境的緩解很快減少。本研究中采用外源Ca2+進(jìn)行誘導(dǎo)后，可以顯著提高菠菜幼苗葉片中游離脯氨酸的含量，與陳淑芳等[22]在黃瓜上的結(jié)論一致。脯氨酸的積累一方面可以增加細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，另一方面又可以避免細(xì)胞氨中毒。鹽脅迫下外源Ca2+能顯著提高菠菜幼苗葉片中游離脯氨酸的含量，是否是因?yàn)槠鋮⑴c了脯氨酸積累的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用還值得深入研究。
對(duì)于POD來(lái)說(shuō)，其影響趨勢(shì)與SOD相似，但是Ca2+誘導(dǎo)濃度為40 mmol/L時(shí)，POD活性就明顯降低。植物在遭受逆境脅迫時(shí)會(huì)引起氧化脅迫的產(chǎn)生[23]，導(dǎo)致生成活性氧(ROS)而破壞植物組織及細(xì)胞。植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，如SOD、POD等可有效減少這些活性氧的破壞作用。而采用外源Ca2+能顯著提高鹽脅迫下菠菜幼苗葉片中的SOD與POD活性，這與其他研究結(jié)果一致[24]。因此，外源Ca2+通過(guò)提高菠菜幼苗葉片中這些保護(hù)酶的活性，增強(qiáng)了清除活性氧的能力，從而減少其對(duì)膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞。
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