本文摘要：摘要：設計不同濃度的CaCl2溶液，在對菠菜(Spinacia oleracea L.)鹽脅迫前采用根部澆灌和葉部噴施的方法進行誘導，鈣誘導5 d后，對菠菜幼苗再進行150 mmol/L NaCl溶液處理，測定其形態(tài)建成和生理生化指標。結果表明，外源鈣能顯著提高鹽脅迫下菠菜的形態(tài)建成
摘要：設計不同濃度的CaCl2溶液，在對菠菜(Spinacia oleracea L.)鹽脅迫前采用根部澆灌和葉部噴施的方法進行誘導，鈣誘導5 d后，對菠菜幼苗再進行150 mmol/L NaCl溶液處理，測定其形態(tài)建成和生理生化指標。結果表明，外源鈣能顯著提高鹽脅迫下菠菜的形態(tài)建成指標;顯著增加可溶性蛋白質和葉綠素含量;顯著提高SOD和POD活性;顯著降低丙二醛(MDA)和游離脯氨酸含量。當外源鈣離子濃度為30 mmol/L時，其降低鹽脅迫傷害效應的效果較好。
關鍵詞：菠菜(Spinacia oleracea L.);鹽脅迫;外源鈣;化學誘抗劑;生理效應
隨著鹽堿地面積的不斷增加和土壤鹽漬化程度的日益加劇，農(nóng)作物的生產(chǎn)受到極大影響，土壤鹽漬化成為制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素[1]。另外，隨著工業(yè)污染的加劇、海水的盲目開發(fā)利用、化肥的大量投入以及設施生產(chǎn)的迅猛發(fā)展，導致了土壤次生鹽漬化加重[2]，土壤鹽漬化已成為設施栽培中普遍存在的問題。對北京、濟南、上海、江蘇等地大棚土壤調查發(fā)現(xiàn)，大棚土壤普遍存在著不同程度的次生鹽漬化現(xiàn)象，己嚴重影響了蔬菜作物的生長發(fā)育[3]。鹽脅迫對植物的影響機理可綜合為阻礙植物的生長發(fā)育[4]、造成滲透脅迫[5]、離子失衡[6]、活性氧傷害[7]、營養(yǎng)虧缺[8]和抑制光合作用[9]等。目前，針對鹽害可采取2種措施來進行改良，一是改良土壤;二是進行農(nóng)作物耐鹽育種和栽培，提高農(nóng)作物的耐鹽性。而利用生物措施來治理鹽害被普遍認為是最經(jīng)濟有效的方法[10]�；瘜W誘抗劑一般是指能夠誘導植物產(chǎn)生抗逆反應的化學物質，也稱為抗逆誘導子或抗逆激發(fā)子，具有無毒、無害、無污染的特點，因而采用化學誘抗劑提高作物耐鹽性是與發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)相適應的一項重要綠色生產(chǎn)技術。Ca2+作為植物必需的一種礦質營養(yǎng)元素，在保護植物細胞膜結構和功能的完整性、穩(wěn)定細胞壁結構、調節(jié)離子運輸和選擇性、控制離子交換行為和細胞壁中酶活性中扮演了關鍵角色[11]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)Ca2+參與鹽脅迫等多種逆境脅迫過程，施加鈣一方面可以緩解因Ca2+不足而引起的礦質營養(yǎng)脅迫，另一方面可以增強質膜的穩(wěn)定性和鈣信號系統(tǒng)的正常功能，阻止細胞內K+的外流和Na+的大量進入，以維持細胞內離子平衡，從而提高植物的抗鹽性[12]。
菠菜(Spinacia oleracea L.) 是一種重要的葉菜類蔬菜，營養(yǎng)豐富[13]， 在世界范圍內均有較大栽培面積。菠菜為中等耐鹽作物，但是在鹽堿地栽培及次生鹽漬化比較嚴重的大棚栽培生產(chǎn)中，鹽脅迫嚴重影響了其產(chǎn)量與品質。有關外源鈣離子作為化學誘抗劑能否提高鹽脅迫下菠菜耐鹽性、其運用效果如何等方面的研究還未見報道。因此，本研究設計了6個不同濃度Ca2+進行誘導，研究了外源鈣離子誘導后對鹽脅迫下菠菜幼苗的形態(tài)建成、生理生化指標的影響，探討了其降低菠菜幼苗鹽害效應的生理生化機制，為充分利用鹽堿地種植蔬菜，減輕設施園藝生產(chǎn)中土壤次生鹽漬化問題，培養(yǎng)健壯幼苗并提高其耐鹽性等方面提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 種苗培養(yǎng)
以日本春秋大葉菠菜為試驗材料，將菠菜種子播于塑料營養(yǎng)缽中，采用基質草炭∶蛭石=2∶1(體積比)，每立方米加入腐熟膨化雞糞5 kg、三元素復合肥1.5 kg，用50%多菌靈100 g/m3消毒。待幼苗長到有6片真葉時，移入裝有相同基質的塑料盆。
1.2 材料處理
菠菜移栽10 d后，進行根際初始誘導，誘抗劑CaCl2的濃度分別設為0、10、20、30、40、50 mmol/L，共6個處理，每個處理3次重復。用根灌法在幼苗根部澆入不同濃度的CaCl2，每株20 mL;初始誘導2 d后葉面噴施進行強化誘導，用手持小噴霧器，均勻噴灑幼苗葉部，以量足但不滴為準。強化誘導3 d后施加鹽脅迫，用根灌法把150 mmol/L NaCl溶液緩慢注入根際基質中，每盆40 mL，早晚各脅迫1次。
1.3 指標測定與數(shù)據(jù)分析
鹽脅迫后第5天取樣進行菠菜形態(tài)建成指標和生理生化指標的測定。測定幼苗株高(子葉節(jié)到生長點之間的距離)、莖粗(莖基部)、展開葉片數(shù)、全株鮮重及全株干重，記錄數(shù)據(jù)最后計算出壯苗指數(shù)。
壯苗指數(shù)=莖粗/株高×全株干重
葉綠素含量的測定采用SPAD法測定;丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法;超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用NBT光化還原法;過氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚比色法測定;可溶性蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍法;游離脯氨酸活性的測定采用茚三酮法。試驗數(shù)據(jù)采用DPS統(tǒng)計軟件進行方差分析，并對平均數(shù)采用LSD法進行多重比較。
2 結果與分析
2.1 外源Ca2+對NaCl脅迫下菠菜形態(tài)建成指標的影響
由表1可知，不同濃度的Ca2+誘導對鹽脅迫下菠菜生長發(fā)育的影響存在顯著差異。其中，30 mmol/L的Ca2+誘導下菠菜長勢最好，未用Ca2+誘導的菠菜長勢最差。其中株高、展開葉片、干重和壯苗指數(shù)中，30 mmol/L Ca2+處理與其他各濃度處理相比差異均達到顯著水平。表明施用Ca2+濃度為30 mmol/L時，能顯著促進鹽脅迫下菠菜的生長發(fā)育和提高壯苗指數(shù)，有效緩解和減輕菠菜的鹽害效應，而較高濃度的Ca2+則顯著降低了壯苗指數(shù)，反而對菠菜幼苗的形態(tài)建成不利。
2.2 外源Ca2+對NaCl脅迫下菠菜葉片中葉綠素和可溶性蛋白質含量的影響
鹽脅迫下，外源鈣離子對菠菜葉片中葉綠素和可溶性蛋白質含量的影響存在差異(圖1)。對于葉綠素含量而言，與對照相比低濃度的外源Ca2+對葉綠素含量影響不顯著，但是當其濃度增加到30 mmol/L時，則可以顯著提高菠菜葉片葉綠素含量;而進一步提高外源Ca2+濃度其作用效果呈明顯下降的趨勢。由此可見，當遭受鹽脅迫時，外施濃度為30 mmol/L Ca2+可使菠菜葉片葉綠素正常合成，從而緩解葉片鹽脅迫下光合作用的降低。對于可溶性蛋白質含量來說，低濃度Ca2+誘導后，幼苗葉片中可溶性蛋白質含量與對照相比差異未達到顯著水平(圖1)，表明外施低濃度的外源鈣離子沒有達到其效果;而較高濃度的Ca2+誘導后，其含量反而比低濃度處理的顯著降低。當外源鈣離子為30 mmol/L時，可以顯著增加菠菜葉片可溶性蛋白質的含量。
2.3 外源Ca2+對鹽脅迫下菠菜葉片中MDA和游離脯氨酸含量的影響
與對照相比，使用外源Ca2+誘導后可顯著降低鹽脅迫下菠菜葉片中MDA的累積(圖2)。但不同濃度的Ca2+誘導處理之間差異不顯著，說明不同Ca2+濃度的誘導均能有效降低菠菜葉片中的MDA含量。對于游離脯氨酸而言，10～20 mmol/L的外源Ca2+誘導下其處理之間差異未達到顯著水平，但是當外源Ca2+誘導濃度提高到30 mmol/L-1時，則可顯著增加菠菜葉片中游離脯氨酸的含量;而進一步增加Ca2+誘導濃度，其作用效果則明顯下降(圖2)。
2.4 外源Ca2+對鹽脅迫下菠菜葉片中SOD和POD活性的影響
外源Ca2+對鹽脅迫下菠菜葉片中SOD和POD活性的影響見圖3。從圖3可知，隨著外源Ca2+誘導濃度的增加，菠菜葉片中SOD和POD活性呈先升高后降低的趨勢。使用一定濃度范圍內的外源Ca2+誘導可顯著增加SOD和POD活性。對于SOD，10 mmol/L的Ca2+誘導濃度與對照相比能顯著提高菠菜葉片SOD活性， 但與20 mmol/L Ca2+誘導濃度處理間差異不顯著。而20～40 mmol/L Ca2+誘導濃度處理間差異也未達到顯著水平。當Ca2+濃度增加到50 mmol/L時，反而使SOD活性顯著降低。當Ca2+濃度為30 mmol/L時，菠菜葉片POD活性達到最高值，與其他處理間差異顯著。
3 討論
鹽脅迫是影響作物生長和降低作物產(chǎn)量的主要障礙因子之一。從形態(tài)建成指標來看，鹽分對非鹽生植物的脅迫效應就是阻止其生長[14]。在本試驗中，NaCl脅迫使菠菜的生長受到嚴重抑制，而通過使用外源Ca2+進行誘導后可顯著緩解這種抑制作用，且能顯著增加干物質的積累和提高壯苗指數(shù)，增強植株的耐鹽性。但過高濃度的Ca2+進行誘導后其作用效果反而顯著下降，可能是CaCl2也作為一種鹽分，增加了土壤根際中的Cl-，抑制根系對NO3ˉ等陰離子養(yǎng)分的吸收[15]。
研究表明，各種細胞器中受鹽分影響比較敏感的是葉綠素[16]。鹽脅迫條件下，NaCl能增強葉綠素酶的活性， 加速葉綠素分解。本研究中，使用30 mmol/L以上外源Ca2+后可顯著提高菠菜葉綠素含量，這與在蕓薹屬植物上的研究結果一致[17]。CaCl2能提高葉綠素含量，其可能的機理是CaCl2能提高抗氧化酶活性，清除活性氧，有效延緩葉綠素含量的下降，增強菠菜對鹽脅迫的適應，提高葉片捕捉和利用光能的能力。此外，外源鈣能提高菠菜葉片中的可溶性蛋白質含量，這與劉雪琴等[18]在玉米上的研究結果一致。
鹽脅迫下MDA含量的增加可能是活性氧(ROS)所導致的氧化脅迫對細胞膜結構的破壞[19]，而外源Ca2+減少或阻止鹽脅迫下Na+對Ca2+的替換，從而提高了膜的流動性、減少了活性氧的產(chǎn)生[20]以及抑制了膜脂的過氧化，以維持細胞膜正常的結構，保證植物體各種代謝循環(huán)的正常進行。另外，游離脯氨酸作為一種重要的滲透調節(jié)物質，在逆境條件下大量累積[21]，待逆境解除后主要用來參與葉綠素的合成，隨著逆境的緩解很快減少。本研究中采用外源Ca2+進行誘導后，可以顯著提高菠菜幼苗葉片中游離脯氨酸的含量，與陳淑芳等[22]在黃瓜上的結論一致。脯氨酸的積累一方面可以增加細胞的滲透調節(jié)能力，另一方面又可以避免細胞氨中毒。鹽脅迫下外源Ca2+能顯著提高菠菜幼苗葉片中游離脯氨酸的含量，是否是因為其參與了脯氨酸積累的信號轉導作用還值得深入研究。
對于POD來說，其影響趨勢與SOD相似，但是Ca2+誘導濃度為40 mmol/L時，POD活性就明顯降低。植物在遭受逆境脅迫時會引起氧化脅迫的產(chǎn)生[23]，導致生成活性氧(ROS)而破壞植物組織及細胞。植物體內的抗氧化系統(tǒng)，如SOD、POD等可有效減少這些活性氧的破壞作用。而采用外源Ca2+能顯著提高鹽脅迫下菠菜幼苗葉片中的SOD與POD活性，這與其他研究結果一致[24]。因此，外源Ca2+通過提高菠菜幼苗葉片中這些保護酶的活性，增強了清除活性氧的能力，從而減少其對膜結構和功能的破壞。
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