本文摘要：摘要：為了獲得山葵愈傷組織誘導和增殖的最佳培養(yǎng)條件，選擇山葵真葉片、真葉柄和胚軸為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，配以不同濃度的2，4-D和6-BA植物激素進行愈傷組織誘導，并將誘導的愈傷組織接種于增殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。結(jié)果表明：誘導山葵愈傷組織的最佳
摘要：為了獲得山葵愈傷組織誘導和增殖的最佳培養(yǎng)條件，選擇山葵真葉片、真葉柄和胚軸為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，配以不同濃度的2，4-D和6-BA植物激素進行愈傷組織誘導，并將誘導的愈傷組織接種于增殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。結(jié)果表明：誘導山葵愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方為MS+4 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA，培養(yǎng)25 d后真葉片、真葉柄、胚軸的愈傷組織誘導率分別為(100.0±0.00)%、(60.5±3.29)%、(62.5±3.74 )%;山葵胚軸外植體產(chǎn)生的愈傷組織增殖倍數(shù)最高，培養(yǎng)35 d后的愈傷組織增殖倍數(shù)可達(2.48±0.93)倍。
關(guān)鍵詞：山葵;愈傷組織;配方;外植體;誘導率;增殖倍數(shù)
山葵(Wasabia japonica)別稱山崳菜，為十字花科山崳菜屬多年生草本半陰生植物，原產(chǎn)中國和日本，被譽為“綠色黃金”[1-2]。山葵具有強烈的辛辣味及特殊的芳香，不僅具有很強的殺菌和助消化功能[3]，而且能促進淀粉性食物的消化，穩(wěn)定胃腸中的維生素C和消滅消化道中的寄生蟲，具有很好的防病治病作用[4-5]。目前山葵多采用分株繁殖和種子繁殖，分株繁殖存在品種退化、繁殖系數(shù)低和種苗帶菌等問題，極易導致病害大面積發(fā)生[6]。種子繁殖具有速度快、 數(shù)量多和能部分減少病害發(fā)生的特點，但是由于山葵種子屬頑拗性種子，失水過多極易導致種子活力喪失，因此常采用低溫高濕保存;同時，山葵種子存在休眠，需有效破除休眠才能促使種子盡快萌發(fā)[7-9]。本研究采用植物組培快繁技術(shù)，通過篩選培養(yǎng)基配方和外植體種類，以獲得山葵愈傷組織誘導的最佳條件，為山葵后續(xù)的生物學研究奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1試驗材料
山葵種子采自四川省廣元市;試驗材料山葵植物的真葉片、真葉柄、胚軸外植體均取自山葵種子萌發(fā)所得的幼苗。
1.2試驗方法
1.2.1外植體消毒和培養(yǎng)選取山葵種子萌發(fā)25 d的幼苗，取其真葉片、真葉柄和胚軸外植體，將其放在超凈工作臺上用濃度為0.1 g/L的氯化汞消毒處理3 min后，用無菌水清洗5次，再用無菌濾紙吸干材料表面的水分，將其接入愈傷組織誘導培養(yǎng)基中。
1.2.2培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件愈傷組織誘導培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，激素6-BA 的濃度均為0.5 mg/L，2，4-D 的濃度設定為0、2、4、6、8 mg/L，分別記作A1、A2、A3、A4、A5處理;在20 ℃、12 h/d的光照時長、2 000 lx的光照強度條件下培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計各外植體的愈傷組織誘導率。
1.2.3不同外植體誘導的愈傷組織增殖選取由山葵真葉片、真葉柄、胚軸外植體誘導產(chǎn)生的愈傷組織，接種于MS+2 mg/L NAA +0.3 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中，分別記作B1、B2、B3處理，在20 ℃、10 h/d光照時長、1 800 lx的光照強度條件下增殖培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計其愈傷組織的增殖倍數(shù)。
1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計及計算公式
上述試驗均重復3次，數(shù)據(jù)用SPSS 13.0 統(tǒng)計學軟件進行方差分析，并采用新復極差(Duncans)法進行多重比較，P<0.05 為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異，數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果以“x±s”表示。愈傷組織的誘導率、增殖倍數(shù)的計算公式如下：愈傷組織誘導率=(誘導出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100%;愈傷組織的增殖倍數(shù) = 收獲時質(zhì)量/接種時質(zhì)量。
2結(jié)果與分析
2.1山葵不同部位外植體的愈傷組織誘導
由表1可知，隨著2，4-D濃度增高，山葵真葉片、真葉柄、胚軸的愈傷組織誘導率均呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢;其中未添加2，4-D激素的A1處理，即培養(yǎng)基配方為MS+0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA，均不適宜山葵各外植體的愈傷組織誘導，3 種外植體的愈傷組織誘導率均為最低，真葉片的愈傷組織誘導率為(37.5±2.73)%，真葉柄為(0.0±000)%，胚軸為(0.0±0.00)%。由此說明，在培養(yǎng)基中添加生長素2，4-D對山葵愈傷組織的誘導非常重要。培養(yǎng)基配方為MS+4 mg/L 2，4-D +0.5 mg/L 6-BA的A3處理，最適宜3種外植體的愈傷組織誘導，愈傷組織的誘導率均為最高，真葉片的愈傷組織誘導率為(100±0.00)%，真葉柄為(60.5±3.29)%，胚軸為(62.5±3.74)%。然而，隨著2，4-D濃度進一步升高到6 mg/L 以上時，山葵各外植體的愈傷組織誘導率均呈現(xiàn)出下降趨勢，以2，4-D濃度升高到8 mg/L 時的各外植體愈傷組織誘導率下降最為顯著，其中真葉柄外植體的愈傷組織誘導率降低了35.5百分點，表明針對不同的植物，選擇適宜的2，4-D濃度顯得尤為重要。表1山葵不同部位外植體的愈傷組織誘導
處理編號激素濃度配比(mg/L)愈傷組織誘導率(%)2，4-D6-BA胚軸真葉片真葉柄A100.50.0±0.0037.5±2.730.0±0.00A220.525.0±2.3487.5±2.1612.5 ±1.78A340.562.5±3.74100.0±0.0060.5±3.29A460.550.2±1.5787.5±1.7537.5 ±2.13A580.537.5±1.6362.5±1.2625.0±1.46
在試驗中觀察各外植體產(chǎn)生愈傷組織的情況，發(fā)現(xiàn)真葉片外植體在接種3 d后葉片開始卷曲，并且真葉片切口處開始變?yōu)槟劬G色且增厚，隨后在切口和葉脈處都開始產(chǎn)生黃綠色的愈傷組織;試驗中無論是將真葉片正接或反接到培養(yǎng)基上，愈傷組織最先在葉片的切口和與培養(yǎng)基接觸的一面長出淺綠色顆粒狀愈傷組織，而葉片的游離面產(chǎn)生愈傷組織的時間較晚，并且產(chǎn)生的愈傷組織顏色也多為綠色。真葉柄外植體在插入培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d后，其游離端出現(xiàn)膨大，隨后膨大明顯并脹裂表皮，接著從表皮的內(nèi)層細胞長出淺黃色愈傷組織;而將真葉柄直接平放在培養(yǎng)基上的處理，其真葉柄是從中間開始產(chǎn)生膨大，最后整個葉柄膨大后也發(fā)生脹裂表皮的情況，隨后也從表皮里面產(chǎn)生出愈傷組織。胚軸外植體正接和反接的情況一樣，均是先從培養(yǎng)基上部的游離端長出黃綠色和淺黃色顆粒狀愈傷組織;而直接將胚軸平接于培養(yǎng)基中則是從胚軸兩端長出黃綠色愈傷組織，隨后整個胚軸愈傷化，長出愈傷組織。
2.2山葵不同部位愈傷組織的增殖
將培養(yǎng)生長25 d的上述各愈傷組織接種于MS+2 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中，在20 ℃、10 h/d光照時長、1 800 lx光照強度條件下增殖培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計其愈傷組織的增殖倍數(shù)(表2)。
表2不同外植體愈傷組織的增殖
處理
編號愈傷組
織來源增殖倍數(shù)生長狀況B1真葉片0.86±1.24質(zhì)地緊密;深綠色和褐色，褐變嚴重B2真葉柄1.57±1.15質(zhì)地較疏松;黃綠色和黃褐色，少量褐變B3胚軸2.48±0.93質(zhì)地較緊密;黃綠色和淺綠色，無褐變
由表2愈傷組織的增殖倍數(shù)和生長狀況可知，由胚軸外植體產(chǎn)生的愈傷組織的繼代增殖效果最好，在增殖培養(yǎng)35 d后，其愈傷組織的增殖倍數(shù)可達(2.48±0.93)倍，并且增殖產(chǎn)生的愈傷組織多為淺綠色和黃綠色，未出現(xiàn)有愈傷組織褐變的情況。真葉柄外植體產(chǎn)生的愈傷組織增殖倍數(shù)為(1.57±1.15)倍，增殖培養(yǎng)的愈傷組織多為黃綠色，但也有少量的愈傷組織產(chǎn)生了褐變并呈現(xiàn)為黃褐色。真葉片外植體產(chǎn)生的愈傷組織在繼代增殖生長過程中，不僅生長速度慢，愈傷組織的增殖倍數(shù)低，僅為(0.86±1.24 )倍，而且愈傷組織在增殖生長過程中易產(chǎn)生褐化，非常不利于愈傷組織的快速增殖生長。
3結(jié)論與討論
本試驗采用山葵的真葉片、真葉柄、胚軸為外植體，在添加了不同濃度的2，4-D生長激素的MS培養(yǎng)基中誘導愈傷，獲得了適宜山葵3種外植體的愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基配方，即MS+4 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA;通過增殖培養(yǎng)研究，表明由胚軸外植體產(chǎn)生的愈傷組織繼代生長速度最快，增殖倍數(shù)最高。通過對不同外植體的誘導比較，發(fā)現(xiàn)真葉片外植體的愈傷組織誘導率明顯地高于真葉柄、胚軸的外植體，然而在后續(xù)愈傷組織增殖生長過程中，真葉片愈傷組織的生長速度卻最慢，增殖倍數(shù)也最低。組成真葉片外植體的細胞組織在適宜的激素配比條件下，易成功脫分化進而產(chǎn)生愈傷組織，但又由于其產(chǎn)生的愈傷組織細胞中含有較高的多酚類物質(zhì)，造成在后續(xù)愈傷組織的增殖過程中極易發(fā)生氧化。因而在山葵真葉片誘導的愈傷組織增殖培養(yǎng)過程中，常出現(xiàn)增殖材料的嚴重褐變，使得山葵愈傷組織在大量增殖過程中由于嚴重褐變而造成增殖材料的增殖倍數(shù)明顯降低。
防止培養(yǎng)的細胞產(chǎn)生褐變可從外植體的選擇、在培養(yǎng)基中添加抗褐化物質(zhì)以及改變培養(yǎng)條件等多個途徑實現(xiàn)。筆者針對山葵真葉片愈傷組織易產(chǎn)生褐變的問題，采用了低培養(yǎng)溫度的方法(另一篇論文報道)，收到了很好的試驗效果。這主要是因為低溫可有效地降低愈傷組織細胞中多酚氧化酶的活性并抑制酚類化合物被氧化[10-11]，從而很好地解決了山葵愈傷組織產(chǎn)生褐變的問題。
參考文獻：
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