本文摘要：摘要：采用chelex-00法提取內(nèi)蒙古地區(qū)4種白粉菌的基因組DNA，擴(kuò)增其rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列ITS，連接載體測(cè)序，并基于ITS序列進(jìn)行親緣關(guān)系分析。結(jié)果表明，4種白粉菌形成3個(gè)進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的分支;寄生在豌豆和田旋花上的豌豆白粉菌和旋花白粉菌的ITS序列緊密聚在
摘要：采用chelex-00法提取內(nèi)蒙古地區(qū)4種白粉菌的基因組DNA，擴(kuò)增其rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列ITS，連接載體測(cè)序，并基于ITS序列進(jìn)行親緣關(guān)系分析。結(jié)果表明，4種白粉菌形成3個(gè)進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的分支;寄生在豌豆和田旋花上的豌豆白粉菌和旋花白粉菌的ITS序列緊密聚在支，其親緣關(guān)系較近，同屬白粉菌屬;寄生在紫花苜蓿上的托羅斯內(nèi)絲白粉菌和寄生在山桃上的三指單囊白粉菌各自成支，與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果相一致。ITS序列可用于內(nèi)蒙古地區(qū)白粉菌分類鑒定研究。
關(guān)鍵詞：白粉菌;內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū);親緣關(guān)系;內(nèi)蒙古;序列分析 農(nóng)業(yè)期刊
白粉菌(powdery mildews)是重要的植物病原菌，目前至少報(bào)道了25個(gè)屬873種，其中，有性型6個(gè)屬，無(wú)性型9個(gè)屬，由白粉菌引起的植物病害統(tǒng)稱為白粉病。白粉病在世界各地均有發(fā)生，寄主植物至少有 67屬9 838種被子植物[2]。近年來(lái)，我國(guó)由于玻璃溫室、塑料大棚和密植等栽培模式和耕作制度的改變，為作物白粉病的發(fā)生創(chuàng)造了良好的環(huán)境，常常造成瓜果、蔬菜和花卉等白粉病的大流行，白粉病發(fā)生相當(dāng)普遍和嚴(yán)重，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)損失。在許多地區(qū)，如芍藥、醉蝶花、荷蘭菊等觀賞花卉白粉病的發(fā)病率幾乎達(dá)到00%，林木和牧草白粉病更是隨處可見(jiàn)。
內(nèi)蒙古自治區(qū)是典型的的中溫帶季風(fēng)氣候地區(qū)，植物種類復(fù)雜多樣，為專性寄生的白粉菌提供了優(yōu)越的生長(zhǎng)發(fā)育條件，通過(guò)經(jīng)典分類方法已鑒定出白粉菌0屬23個(gè)種和變種，寄主植物多達(dá)58科2屬400多種和變種[3]。農(nóng)業(yè)是內(nèi)蒙古的主要產(chǎn)業(yè)之一，為避免白粉菌對(duì)農(nóng)業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)作物白粉菌進(jìn)行系統(tǒng)分類研究很有必要。近幾年，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)白粉菌系統(tǒng)分類研究已由傳統(tǒng)的經(jīng)典分類向分子生物方法分類過(guò)渡。本試驗(yàn)對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)采集的白粉菌樣本進(jìn)行rDNA-ITS序列分析及比對(duì)，構(gòu)建白粉菌系統(tǒng)發(fā)育樹，從分子系統(tǒng)學(xué)角度探討不同白粉菌之間的親緣關(guān)系，以期為白粉菌的分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育等方面的研究提供依據(jù)，為該地區(qū)植物白粉病的有效防治及物種多樣性的研究提供科學(xué)依據(jù)及資料。
材料與方法
菌種樣本采集
在內(nèi)蒙古自治區(qū)采集4種白粉菌樣本，寄主分別是豌豆(標(biāo)本號(hào)：CFSZ 559)、田旋花(樣本號(hào)：CFSZ7249)、紫花苜蓿(樣本號(hào)：CFSZ7253)、山桃(樣本號(hào)：CFSZ7257)，保存于赤峰學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院菌物實(shí)驗(yàn)室。
2白粉菌孢子收集
白粉菌是專性寄生菌，只在活體寄主上生存，因此，將病菌樣本盡快帶回實(shí)驗(yàn)室，在新鮮寄主植物表面，用滅菌的解剖針在顯微鏡下挑取大概數(shù)百個(gè)分生孢子，將其置于5 mL離心管中-20 ℃冰箱中保存，以備提取基因組DNA。
3主要試劑
[3]Chelex-00，購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司;Taq酶、XbalⅠ、Hind Ⅲ、質(zhì)粒DNA提取試劑盒、CR產(chǎn)物純化試劑盒和pMD 8-T Vector，均購(gòu)自大連寶生物公司;通用引物ITS：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′、ITS4：5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′、ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′、ITS6：5′-AGGTAATCCCGGTTGGTTTC-3′[4]，均由大連寶生物公司合成。
4白粉菌基因組DNA的提取
選取數(shù)百個(gè)分生孢子置于5 mL離心管中，加入50 μL 5% Chelex-00，56 ℃溫育數(shù)小時(shí);渦旋振蕩儀劇烈振蕩，沸水浴8 min;再次劇烈振蕩，5 000 g離心5 min;上清移入另一離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆肹5]。
5ITS序列的CR擴(kuò)增
采用巢式CR方法，以提取的基因組DNA作為模板進(jìn)行CR擴(kuò)增。一次CR總體積為50 μL，反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)30次;72 ℃ 0 min。二次CR總體積為50 μL，反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)30次;72 ℃ 0 min。將CR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
6CR產(chǎn)物的克隆及序列測(cè)定
CR產(chǎn)物的回收與純化參照TaKaRa DNA Fragment urification Kit試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，并與 pMD 8-T 載體連接轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用CR法和 XbalⅠ、Hind Ⅲ雙酶切法篩選陽(yáng)性克隆菌株，送大連寶生物生物技術(shù)有限公司測(cè)序。
7ITS序列的生物信息學(xué)分析
利用Clustal X程序?qū)?種不同植物白粉病菌的ITS序列匹配排列，用MEGA 60軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析，基于kimura-2-parameter雙參數(shù)模型，采用鄰近距離法(N法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹以推演系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，同時(shí)，采用bootstrap法，經(jīng)000次循環(huán)檢驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)化樹的可靠性。
2結(jié)果與分析
2CR擴(kuò)增結(jié)果
[2]由圖、圖2可見(jiàn)，采用真菌通用引物ITS5和ITS6作為外引物，ITS和ITS4作為內(nèi)引物，對(duì)4種白粉菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，均得到600 bp左右的DNA片段。測(cè)序結(jié)果表明，該片段包括了完整的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS和ITS2序列、部分8S rDNA、全部58S rDNA序列及部分28S rDNA序列。
22白粉病菌ITS序列分析和進(jìn)化樹的構(gòu)建
將已測(cè)得的序列去掉5′和3′端的載體序列，得到4種白粉菌的ITS序列，用Clustal X軟件中Alignment程序?qū)TS序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果由表、圖3可見(jiàn)，4種白粉菌部分8 S rDNA、全部58 S rDNA序列和部分28 S rDNA序列非常保守，而內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS和ITS2序列變化較大�；贗TS序列，利用MEGA 60對(duì)4種白粉菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和進(jìn)化樹的構(gòu)建，由圖4可見(jiàn)，4種白粉菌形成3個(gè)進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的大分支;寄生在豌豆(CFSZ 559)和田旋花(CFSZ7249)上的白粉菌遺傳距離較小，親緣關(guān)系較近，其ITS序列緊密聚在支;寄生在紫花苜蓿(CFSZ7253)上的托羅斯內(nèi)絲白粉菌和寄生在山桃(CFSZ7257)上的三指單囊白粉菌各自成支，ITS序列分析結(jié)果與其在形態(tài)學(xué)上的分類結(jié)果相一致。
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