易發(fā)表見刊快淺析內蒙古4種白粉菌分析

所屬分類：農業(yè)論文閱讀次時間：2015-06-04 14:44

本文摘要：摘要：采用chelex-00法提取內蒙古地區(qū)4種白粉菌的基因組DNA，擴增其rDNA內轉錄間隔區(qū)序列ITS，連接載體測序，并基于ITS序列進行親緣關系分析。結果表明，4種白粉菌形成3個進化距離較遠的分支;寄生在豌豆和田旋花上的豌豆白粉菌和旋花白粉菌的ITS序列緊密聚在

　　摘要：采用chelex-00法提取內蒙古地區(qū)4種白粉菌的基因組DNA，擴增其rDNA內轉錄間隔區(qū)序列ITS，連接載體測序，并基于ITS序列進行親緣關系分析。結果表明，4種白粉菌形成3個進化距離較遠的分支;寄生在豌豆和田旋花上的豌豆白粉菌和旋花白粉菌的ITS序列緊密聚在支，其親緣關系較近，同屬白粉菌屬;寄生在紫花苜蓿上的托羅斯內絲白粉菌和寄生在山桃上的三指單囊白粉菌各自成支，與形態(tài)學分類結果相一致。ITS序列可用于內蒙古地區(qū)白粉菌分類鑒定研究。

　　關鍵詞：白粉菌;內轉錄間隔區(qū);親緣關系;內蒙古;序列分析　農業(yè)期刊

　　白粉菌(powdery mildews)是重要的植物病原菌，目前至少報道了25個屬873種，其中，有性型6個屬，無性型9個屬，由白粉菌引起的植物病害統(tǒng)稱為白粉病。白粉病在世界各地均有發(fā)生，寄主植物至少有 67屬9 838種被子植物[2]。近年來，我國由于玻璃溫室、塑料大棚和密植等栽培模式和耕作制度的改變，為作物白粉病的發(fā)生創(chuàng)造了良好的環(huán)境，常常造成瓜果、蔬菜和花卉等白粉病的大流行，白粉病發(fā)生相當普遍和嚴重，給農業(yè)生產(chǎn)帶來重大的經(jīng)濟損失。在許多地區(qū)，如芍藥、醉蝶花、荷蘭菊等觀賞花卉白粉病的發(fā)病率幾乎達到00%，林木和牧草白粉病更是隨處可見。

　　內蒙古自治區(qū)是典型的的中溫帶季風氣候地區(qū)，植物種類復雜多樣，為專性寄生的白粉菌提供了優(yōu)越的生長發(fā)育條件，通過經(jīng)典分類方法已鑒定出白粉菌0屬23個種和變種，寄主植物多達58科2屬400多種和變種[3]。農業(yè)是內蒙古的主要產(chǎn)業(yè)之一，為避免白粉菌對農業(yè)造成的經(jīng)濟損失，對內蒙古自治區(qū)農作物白粉菌進行系統(tǒng)分類研究很有必要。近幾年，隨著分子生物學的發(fā)展，對白粉菌系統(tǒng)分類研究已由傳統(tǒng)的經(jīng)典分類向分子生物方法分類過渡。本試驗對內蒙古自治區(qū)采集的白粉菌樣本進行rDNA-ITS序列分析及比對，構建白粉菌系統(tǒng)發(fā)育樹，從分子系統(tǒng)學角度探討不同白粉菌之間的親緣關系，以期為白粉菌的分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育等方面的研究提供依據(jù)，為該地區(qū)植物白粉病的有效防治及物種多樣性的研究提供科學依據(jù)及資料。

　　材料與方法

　　菌種樣本采集

　　在內蒙古自治區(qū)采集4種白粉菌樣本，寄主分別是豌豆(標本號：CFSZ 559)、田旋花(樣本號：CFSZ7249)、紫花苜蓿(樣本號：CFSZ7253)、山桃(樣本號：CFSZ7257)，保存于赤峰學院生命科學學院菌物實驗室。

　　2白粉菌孢子收集

　　白粉菌是專性寄生菌，只在活體寄主上生存，因此，將病菌樣本盡快帶回實驗室，在新鮮寄主植物表面，用滅菌的解剖針在顯微鏡下挑取大概數(shù)百個分生孢子，將其置于5 mL離心管中-20 ℃冰箱中保存，以備提取基因組DNA。

　　3主要試劑

　　[3]Chelex-00，購自美國伯樂公司;Taq酶、XbalⅠ、Hind Ⅲ、質粒DNA提取試劑盒、CR產(chǎn)物純化試劑盒和pMD 8-T Vector，均購自大連寶生物公司;通用引物ITS：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′、ITS4：5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′、ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′、ITS6：5′-AGGTAATCCCGGTTGGTTTC-3′[4]，均由大連寶生物公司合成。

　　4白粉菌基因組DNA的提取

　　選取數(shù)百個分生孢子置于5 mL離心管中，加入50 μL 5% Chelex-00，56 ℃溫育數(shù)小時;渦旋振蕩儀劇烈振蕩，沸水浴8 min;再次劇烈振蕩，5 000 g離心5 min;上清移入另一離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆肹5]。

　　5ITS序列的CR擴增

　　采用巢式CR方法，以提取的基因組DNA作為模板進行CR擴增。一次CR總體積為50 μL，反應參數(shù)為：94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)30次;72 ℃ 0 min。二次CR總體積為50 μL，反應參數(shù)為：94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)30次;72 ℃ 0 min。將CR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

　　6CR產(chǎn)物的克隆及序列測定

　　CR產(chǎn)物的回收與純化參照TaKaRa DNA Fragment urification Kit試劑盒說明進行，并與 pMD 8-T 載體連接轉化于DH5α感受態(tài)細胞，用CR法和 XbalⅠ、Hind Ⅲ雙酶切法篩選陽性克隆菌株，送大連寶生物生物技術有限公司測序。

　　7ITS序列的生物信息學分析

　　利用Clustal X程序將4種不同植物白粉病菌的ITS序列匹配排列，用MEGA 60軟件對序列進行比對分析，基于kimura-2-parameter雙參數(shù)模型，采用鄰近距離法(N法)構建系統(tǒng)進化樹以推演系統(tǒng)發(fā)生關系，同時，采用bootstrap法，經(jīng)000次循環(huán)檢驗系統(tǒng)進化樹的可靠性。

　　2結果與分析

　　2CR擴增結果

　　[2]由圖、圖2可見，采用真菌通用引物ITS5和ITS6作為外引物，ITS和ITS4作為內引物，對4種白粉菌基因組DNA進行擴增，均得到600 bp左右的DNA片段。測序結果表明，該片段包括了完整的核糖體內轉錄間隔區(qū)ITS和ITS2序列、部分8S rDNA、全部58S rDNA序列及部分28S rDNA序列。

　　22白粉病菌ITS序列分析和進化樹的構建

　　將已測得的序列去掉5′和3′端的載體序列，得到4種白粉菌的ITS序列，用Clustal X軟件中Alignment程序對ITS序列進行多重比對，結果由表、圖3可見，4種白粉菌部分8 S rDNA、全部58 S rDNA序列和部分28 S rDNA序列非常保守，而內轉錄間隔區(qū)ITS和ITS2序列變化較大�；贗TS序列，利用MEGA 60對4種白粉菌進行系統(tǒng)發(fā)育分析和進化樹的構建，由圖4可見，4種白粉菌形成3個進化距離較遠的大分支;寄生在豌豆(CFSZ 559)和田旋花(CFSZ7249)上的白粉菌遺傳距離較小，親緣關系較近，其ITS序列緊密聚在支;寄生在紫花苜蓿(CFSZ7253)上的托羅斯內絲白粉菌和寄生在山桃(CFSZ7257)上的三指單囊白粉菌各自成支，ITS序列分析結果與其在形態(tài)學上的分類結果相一致。