本文摘要：本篇文章是由 《中國實(shí)用醫(yī)刊》 發(fā)表的一篇醫(yī)學(xué)論文， (半月刊)創(chuàng)刊于1974年，由中華醫(yī)學(xué)會(huì)主辦。是國家科技部和國家新聞出版總署批準(zhǔn)的國內(nèi)外分開發(fā)行的綜合性醫(yī)學(xué)期刊。面向臨床、面向基層、刊登臨床各專業(yè)(包括護(hù)理)的新理論、新方法、新成果和新經(jīng)驗(yàn)決結(jié)
本篇文章是由《中國實(shí)用醫(yī)刊》發(fā)表的一篇醫(yī)學(xué)論文，(半月刊)創(chuàng)刊于1974年，由中華醫(yī)學(xué)會(huì)主辦。是國家科技部和國家新聞出版總署批準(zhǔn)的國內(nèi)外分開發(fā)行的綜合性醫(yī)學(xué)期刊。面向臨床、面向基層、刊登臨床各專業(yè)(包括護(hù)理)的新理論、新方法、新成果和新經(jīng)驗(yàn)決結(jié)等。2007年中華醫(yī)學(xué)會(huì)與萬方數(shù)據(jù)攜手推動(dòng)醫(yī)藥信息服務(wù)，該刊電子版已獨(dú)家授權(quán)萬方數(shù)據(jù)來實(shí)現(xiàn)其數(shù)字化服務(wù)推廣。
【摘要】：目的 探索僵蠶水煎液、醇沉液和凝膠色譜餾分各部位中的抗凝活性成分。方法 用水煎煮、60%醇沉處理和凝膠色譜方法制備抗凝活性部位,用化學(xué)反應(yīng)鑒別、氮測定法、電導(dǎo)、紫外吸收光譜和高效液相色譜方法檢測各部位中的蛋白質(zhì)或多肽和氨基酸類及草酸銨等成分。結(jié)果 僵蠶的水煎煮提取、醇沉和凝膠色譜分離所得抗凝活性部位中,多肽、氨基酸類和草酸銨都是其中的主要成分,其含量在80%以上。醇沉處理使草酸銨含量下降約52%,而多肽、氨基酸類含量僅降低約8%。凝膠色譜凈化后,多肽、氨基酸類含量與水煎部位比約提高28%,與醇沉處理部位比約提高39%,而草酸銨含量與醇沉液部位相當(dāng),但比水煎煮部位降低約1倍。各部位的固形物中,15種氨基酸含量在40%～50%,占定氮法測定的蛋白質(zhì)含量的60%～76%;多肽類成分的分子量為1.0～4.4 kDa。結(jié)論 本研究為僵蠶抗凝活性成分的進(jìn)一步分離純化提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】 僵蠶 抗凝活性部位 化學(xué)成分 凝膠色譜法 高效液相色譜法 氮測定法
僵蠶為蠶蛾科昆蟲家蠶Bombyx mori L.4～5齡的幼蟲感染(或人工接種)白僵菌而致死的干燥體,為傳統(tǒng)中藥,性味咸、辛、平,歸肝、肺、胃經(jīng)[1]。具熄風(fēng)止痙、活血通絡(luò)、化痰散結(jié)等功效,可用于治療急性驚風(fēng)、癲癇、中風(fēng)、面癱及頑固性頭痛等。僵蠶含有蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、草酸銨、白僵菌素以及微量元素等成分[2-4],其水提液在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗凝、抗血栓、促纖溶及抗內(nèi)毒素所致紅細(xì)胞膜損傷等作用[5-7],草酸銨和蛋白質(zhì)(或多肽)、氨基酸等可能為其主要活性成分[8]。為進(jìn)一步研究僵蠶的抗凝活性成分,本實(shí)驗(yàn)探討了僵蠶水煎煮液的醇沉液和凝膠色譜分離凈化,及其抗凝活性成分中氨基酸和草酸銨等的定性定量分析,現(xiàn)報(bào)道如下。
1 實(shí)驗(yàn)材料
護(hù)理論文發(fā)表
Waters 515 HPLC系統(tǒng)(Waters 公司);BS100A自動(dòng)部分收集系統(tǒng)(上海市滬西儀器廠);Start-4半自動(dòng)四通道血凝儀(法國STAGO公司);4300-Pro紫外分光光度計(jì)(瑞士安瑪西亞公司);HR2838型勻漿機(jī)(菲力普公司);LP115 pH計(jì)(METTER TOLEDO公司);DDS-ⅡA電導(dǎo)率儀(上海理達(dá)儀器廠);移液槍(0.1 mL和1.0 mL,日本);半微量凱氏定氮裝置;Z-16和Z-26層析柱(上海化學(xué)儀器廠)。制僵蠶(購自湖南振興中藥飲片有限公司);葡聚糖凝膠(Biotech公司);凝血酶試劑(上海太陽生物技術(shù)公司,批號(hào)N25006);兔血漿(自制);15種氨基酸對照品(Sigma公司);水為超純水;甲醇(色譜純)、三氟乙酸(THF)、2-巰基乙醇、鄰苯二甲醛(OPA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等化學(xué)試劑均為分析純。
2 方法與結(jié)果
2.1 樣品溶液的制備
稱取制僵蠶1 500 g(樣品A),用8倍量水浸泡過夜,以3 000 r/min勻漿,然后煎煮2次,每次30 min,過濾,合并濾液,離心,得提取液8 450 mL(樣品B),將其濃縮至含原藥材2 g/mL,加無水乙醇濃度至60%,4 ℃放置過夜,3 000 r/min離心,取上清液水浴濃縮至含原藥材約6 g/mL,即得粗提液240 mL(樣品C)。將30 mL該液加到用0.05 mol/L NaCl的0.02 mol/L Tris-HCl (pH 7.4)緩沖液平衡的Sephadex G-25凝膠柱(φ2.6 cm×80 cm)上,用相同緩沖液洗脫,自動(dòng)分步收集器收集,2.5 mL/ (10 min·管),每2～3管按文獻(xiàn)方法[8]測定凝血酶時(shí)間(TT,s)、紫外吸收光譜,用重量法測定質(zhì)量百分濃度(m/v)、電導(dǎo)率儀測定溶液電導(dǎo)率,得洗脫曲線(見圖1)。將TT在40～100 s之間的組分合并得洗脫液69 mL(樣品D),TT≥100 s的組分合并得洗脫液82.5 mL(樣品E),E即為抗凝活性部位。
圖1表明, 紫外吸收光譜法(UV)檢測的最強(qiáng)色譜峰的前半部分為具有抗凝活性的部位,與UV法測得的G-25凝膠色譜峰值不重合,而按質(zhì)量百分濃度(M/V)和電導(dǎo)率法測得的色譜峰值與抗凝活性峰值基本重合。
2.2 抗凝活性部位的化學(xué)成分理化鑒別
2.2.1 茚三酮反應(yīng)、pH值、電導(dǎo)率、AgNO3/HNO3反應(yīng)和CaCl2/HNO3反應(yīng) 分別取B～E樣品溶液進(jìn)行理化測定,結(jié)果表明,僵蠶提取分離后的B～E樣品所檢測的理化性質(zhì)結(jié)果一致,提示所含主要成分基本相同。茚三酮反應(yīng)陽性,活性部分電導(dǎo)很大,與AgNO3產(chǎn)生白色沉淀,滴加HNO3后沉淀部分溶解,與CaCl2產(chǎn)生沉淀,滴加HNO3沉淀溶解。提示抗凝活性成分可能是鹽類(如氯化物、草酸鹽等)、蛋白質(zhì)、肽類或其它含氨基酸的化合物。
2.2.2 紫外吸收光譜
取各樣品稀釋適當(dāng)后在200～400 nm掃描,其紫外吸收光譜見圖2。
圖2表明,樣品B～E的UV光譜形狀均不相同,表明提取分離所得樣品化學(xué)成分有所不同。提取分離后除去了大量的無活性物質(zhì),特別是經(jīng)過凝膠色譜純化后,UV光譜變化較大。
2.2.3 樣品E的凝膠色譜分析及其分子量分析
取樣品E中TT≥600 s的餾分2 mL上Sephadex G-15(φ1.6 cm×50 cm)柱,用水洗脫鹽,4.0 mL/(10 min·管),自動(dòng)分步收集器收集,測定各管的TT值、260 nm和280 nm處的吸光度及化學(xué)反應(yīng)特性,結(jié)果見表1。表1 TT≥600 s餾分的凝膠柱脫鹽中餾分的抗凝活性和理化特性檢
測結(jié)果(略)注：*必要時(shí),通過稀釋餾分,測定吸光度在0.2～0.8之間,計(jì)算而得
2.3 定量分析護(hù)理論文發(fā)表
2.3.1 固形物含量測定
精密吸取樣品B～E各2.0 mL,80 ℃下烘至近干,100 ℃下烘至恒重,精密稱定,按每1 mL樣品溶液扣除5.0 mg的Tris和NaCl重量,得固形物重量和濃度(各樣品均為n=3,RSD不超過0.8%),結(jié)果見表2。表2 僵蠶各部位中的固形物和蛋白質(zhì)測定結(jié)果(略)注：*與樣品A比
2.3.2 指標(biāo)檢測
蛋白質(zhì)：按《中華人民共和國藥典》中半微量氮測定法操作,計(jì)算總氮含量。將該氮含量扣除銨態(tài)氮含量,再與6.25相乘,即為蛋白質(zhì)質(zhì)量和百分濃度(W/V)。各樣品均為n=3,RSD不超過1.4%。銨根[9]：按《中華人民共和國藥典》中半微量氮測定法操作(40% NaOH試液用120 g/L氧化鎂懸濁液代替),計(jì)算銨根質(zhì)量和百分濃度(W/V)。各樣品均為n=3,RSD不超過1.2%。草酸根[3]：精密取B～E樣品液約5 mL,氯化鈣沉淀-高錳酸鉀滴定法測定(各樣品均為n=3,RSD不超過1.0%)。結(jié)果見表3、表4。表3 僵蠶各部位中銨根和草酸根的測定結(jié)果(略)注：*與樣品B比表4 僵蠶各部位固形物中蛋白質(zhì)和草酸銨含量比較(略)
2.3.3 HPLC法測定氨基酸含量
2.3.3.1 色譜條件
色譜柱：Agilent ODS(4.6 mm×200 mm, 5 μm);流動(dòng)相A為50 mmol/L NaAc(pH 6.8)-甲醇-THF(82∶17∶1),流動(dòng)相B為50 mmol/L NaAc(pH 6.8)-甲醇-THF(22∶77∶1),梯度洗脫;柱溫：27 ℃;流速：1.0 mL/min;熒光檢測器：λex 338 nm,λem 425 nm。
2.3.3.2 樣品測定 樣品溶液B～E經(jīng)5.7 mol/L鹽酸液,在110 ℃水解24 h,OPA試劑衍生化,然后取20 μL注入液相色譜儀。測定結(jié)果見表5。表5 僵蠶各部位中氨基酸的測定結(jié)果(略)
3 討論
本研究表明,僵蠶的水煎煮提取、醇沉和凝膠色譜分離所得抗凝活性部位中,多肽、氨基酸類和草酸銨都是其中的主要成分。已有報(bào)道,草酸銨具有抗凝活性[8],本研究表明,凝膠色譜分離部位中不含草酸銨,但含多肽和氨基酸類成分的餾分具有抗凝活性,因此,僵蠶中的多肽類或氨基酸類成分可能是抗凝活性成分之一。本研究對僵蠶抗凝活性部位的化學(xué)成分和理化特性進(jìn)行的初步探索,也為今后對僵蠶抗凝成分的分離純化提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【參考文獻(xiàn)】
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護(hù)理論文發(fā)表
[4] 趙建國,彭延古,彭新君,等.薄層色譜法分離僵蠶中蛋白質(zhì)和氨基酸類成分的研究[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,25(2)：26-27.
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