人體樣本中脂肪酸分析方法研究進(jìn)展

　　【摘要】綜述了人體樣本中脂肪酸分析常用的預(yù)處理方法、衍生化技術(shù)和儀器分析技術(shù)的發(fā)展情況;重點(diǎn)總結(jié)了衍生化技術(shù)在脂肪酸分析中的應(yīng)用現(xiàn)狀和進(jìn)展;闡述了最新儀器檢測方法，如“鳥槍”式直接進(jìn)樣法和“中心”二維質(zhì)譜法在該領(lǐng)域的最新發(fā)現(xiàn);回顧了重要脂肪酸參考值范圍。綜述認(rèn)為開發(fā)選擇性好、效率高、穩(wěn)定性強(qiáng)的衍生化技術(shù)，使用脂肪酸內(nèi)源性血漿/血清的質(zhì)量控制品以及與被測組分性質(zhì)相似的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品，是獲得脂肪酸分析準(zhǔn)確、可靠結(jié)果的有效途徑。

　　關(guān)鍵詞：脂肪酸;生物樣本;分析方法;研究進(jìn)展

　　脂肪酸是人體能量儲(chǔ)存、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生化途徑的重要代謝物。近期研究發(fā)現(xiàn)，某些脂肪酸組成變化與機(jī)體內(nèi)代謝水平異常以及疾病呈顯著相關(guān)，如肥胖、胰島素代謝紊亂、阿茲海默癥、癌癥等代謝異�；蛏�理異常都會(huì)影響體內(nèi)脂肪酸組成[1]。

　　脂肪酸論文范例： 反芻動(dòng)物肌內(nèi)脂肪及脂肪酸調(diào)控研究進(jìn)展

　　已有文獻(xiàn)報(bào)道，脂肪酸組成可以作為臨床綜合診斷指標(biāo)，如血清中C16:1n7/C16:0是鑒別脂肪肝與脂肪性肝炎的指標(biāo)[2];兒童注意缺陷與多動(dòng)障礙患者血漿中多不飽和脂肪酸濃度低于正常值[3]。由此可見，定量分析脂肪酸組成對(duì)營養(yǎng)評(píng)估及臨床診斷有重要價(jià)值。人體樣本中脂肪酸含量低、分類繁多且生物樣品基質(zhì)復(fù)雜，分析方法常常難以獲得令人滿意的定性能力和檢測靈敏度，極大制約了脂肪酸研究的進(jìn)一步深入。

　　目前，分析生物樣本中脂肪酸的檢測方法主要有氣相色譜類方法、液相色譜類方法以及酶聯(lián)免疫法，其中氣相色譜類方法是最成熟也最經(jīng)典的方法，非常適合脂肪酸組分分析。而液相色譜類方法近幾年來的創(chuàng)新點(diǎn)主要集中在設(shè)計(jì)、合成新型脂肪酸衍生化試劑，達(dá)到降低基質(zhì)效應(yīng)、提高靈敏度的目的。酶聯(lián)免疫法雖然能在短時(shí)間內(nèi)檢測生物樣品中的DHA，但一次只能獲得單種游離脂肪酸的檢測值。

　　本文綜述了近年來人體樣本中脂肪酸的分析方法及研究進(jìn)展，重點(diǎn)討論了不同樣品中脂肪酸的提取方法、基于衍生化的色譜和質(zhì)譜分析方法以及文獻(xiàn)報(bào)道中的參考值范圍;擬通過對(duì)這些研究成果的綜述，為建立我國人體樣本中脂肪酸檢測標(biāo)準(zhǔn)化方法和人群標(biāo)準(zhǔn)參考值提供借鑒。

　　1脂肪酸檢測的預(yù)處理方法

　　研究者通常根據(jù)研究目的不同，提取不同研究對(duì)象中的游離脂肪酸或/和酯化脂肪酸或是全脂質(zhì)。游離脂肪酸可在酸化條件下用烷類溶劑提取。Quehenberger等[4]用鹽酸甲醇酸化樣品后，用異辛烷提取了細(xì)胞、血漿、肝臟勻漿液、脂肪勻漿液中的游離脂肪酸。但此法不適合含磷酯較多的樣本，因?yàn)榱柞ピ谒峄瘲l件下易分解產(chǎn)生游離脂肪酸，對(duì)檢測造成干擾。

　　在分析血漿、血清、母乳等液體中的游離脂肪酸和酯化脂肪酸時(shí)，經(jīng)常采用先酸解再皂化的方法。美國CDC[5]取100μL人血清或血漿，加鹽酸乙腈溶液酸解，氫氧化鈉甲醇皂化，分析了人群血清中30種脂肪酸。Santos等[6]優(yōu)化了此法，將酸解和皂化的時(shí)間延長，建立了健康人血漿中31種脂肪酸含量參考范圍。長鏈多不飽和脂肪酸極性小、疏水性強(qiáng)，正己烷提取效果欠佳。

　　Serafim等[7]采用冰浴后的正己烷：異丙醇(3:2,v/v)，提高了溶劑萃取效率，獲得了血漿中5種長鏈/超長鏈不飽和脂肪酸。 在分析總脂質(zhì)成分時(shí)，常采用經(jīng)典的Folch[8]或Bligh-Dyer[9]脂質(zhì)萃取法。簡要來說，Bligh-Dye法中氯仿/甲醇/水的體積比為1:2:0.8，適用于組織、細(xì)胞內(nèi)少量脂質(zhì)提取;Folch法氯仿用量大，氯仿/甲醇/水的體積比為8:4:3，更適合含大量脂質(zhì)的樣品。在一些優(yōu)化方法中，常用毒性更小的二氯甲烷來代替氯仿，具有相似效果。腸道內(nèi)容物或糞便中含有較多的短鏈脂肪酸，具有分子量小、揮發(fā)性高、水溶性較大的特點(diǎn)，一般用沸點(diǎn)低、易去除的乙醚或乙醇提取[10]。提取時(shí)加入鹽酸、硫酸、偏磷酸等，可阻止短鏈脂肪酸水解，有效沉淀蛋白等雜質(zhì)，提高回收率。

　　2分析方法

　　脂肪酸這類物質(zhì)較難氣化，沒有良好的電離基團(tuán)和顯色基團(tuán)，在氣相色譜類或液相色譜類儀器中靈敏度較低。但脂肪酸在衍生化后，能獲得良好的色譜分離和質(zhì)譜定性效果，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜組分的準(zhǔn)確定量、定性。此外，使用同位素內(nèi)標(biāo)也能在一定程度上減小基質(zhì)效應(yīng)和操作誤差。

　　2.1氣相色譜法及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

　　氣相色譜類分析技術(shù)與衍生化方法聯(lián)用是目前應(yīng)用最廣泛的脂肪酸檢測方法，具有定性定量準(zhǔn)確、針對(duì)性強(qiáng)的特點(diǎn)。

　　其中，甲酯化方法是由脂肪酸與甲醇在各種催化劑條件下生成脂肪酸甲酯，其常用的方法有三氟化硼/甲醇法[11]、硫酸/甲醇法[6]、乙酰氯/甲醇法[12]等;脂肪酸甲酯具有正電性，適合GC-FID[11]、GC-MS-EI[13,14]、GC-TOF-MS[12]等儀器分析。Abdelmagid等[11]采用氣相色譜法檢測了人血漿中13種長鏈脂肪酸，建立了正常人群脂肪酸含量參考范圍，用以判斷缺乏、過剩及與慢性疾病的關(guān)聯(lián)。

　　方法用14%三氟化硼/甲醇法衍生化，外標(biāo)法定量，中強(qiáng)極性色譜柱檢測。但是由于血液樣品量少，無法進(jìn)行回流條件，三氟化硼不能快速甲酯化，反應(yīng)溫度高時(shí)間長，甲酯化效率較低。 為了進(jìn)一步降低檢測限，Santos等[6]采用大體積進(jìn)樣氣相色譜-真空紫外光譜法(LVI-GC-VUV)檢測了人血漿中31種脂肪酸，作為診斷代謝疾病的指標(biāo)。方法進(jìn)樣量400μl，用2%濃硫酸甲醇溶液甲酯化。研究者常根據(jù)待測物性質(zhì)和實(shí)驗(yàn)條件選擇不同濃度的濃硫酸/甲醇溶液，濃硫酸用量一般在2%-10%之間。

　　在脂肪酸檢測時(shí)，經(jīng)常發(fā)生幾種不同物質(zhì)具有相同保留時(shí)間或保留時(shí)間很接近的現(xiàn)象，如亞油酸和α-亞麻酸，使用質(zhì)譜有效避免了混淆。對(duì)于GC-MS，使用EI源得到大量碎片信息后，可以通過標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。Ukolov等[15]采用GC-MS-EI、非極性色譜柱分析血漿、尿液中39種游離脂肪酸，采用氫氧化四丁基銨催化劑、碘甲烷衍生化試劑對(duì)脂肪酸進(jìn)行甲酯化，二氯甲烷提取。

　　這種甲酯化方法可在室溫下快速反應(yīng)、無需禁水。方法考察了樣品的保存溫度和保存時(shí)間，發(fā)現(xiàn)樣品在-20℃或-70℃下保存沒有區(qū)別，但保存時(shí)間超過2個(gè)月時(shí)多數(shù)脂肪酸測定值明顯降低。ChanSeo等[13]采用三氟乙酰胺(MTBSTFA)與脂肪酸生成烷基化衍生物，在選擇離子模式下用GC-MS-EI分析人血漿中44種脂肪酸。脂肪酸烷基化衍生物在EI離子源中規(guī)律性地丟失叔丁基或甲基，形成響應(yīng)較強(qiáng)的特征離子對(duì)[M-57]+、[M-15]+以及脂肪酸帶電離子[M+]，易于辨別。但MTBSTFA衍生物遇酸和水立即分解，衍生物保存時(shí)要十分小心。

　　另一種GC-MS電離源，NCI負(fù)化學(xué)電離源的“軟電離”效應(yīng)保持了脂肪酸結(jié)構(gòu)的完整性，有利于脂肪酸衍生物的定性分析。衍生化試劑五氟芐基溴的衍生物具有很高的負(fù)電性，性質(zhì)與NCI源高度匹配，大幅提高了靈敏度。美國CDC[5]采用GC-MS-NCI法調(diào)查了人群血漿中30種脂肪酸情況，以五氟芐基溴為衍生化試劑，三乙胺催化反應(yīng)進(jìn)行，同位素內(nèi)標(biāo)定量，高極性色譜柱分析。此方法用NIST標(biāo)定值的冷凍人血清中脂肪酸等質(zhì)量控制物質(zhì)核查分析過程以及儀器準(zhǔn)確性，最大程度提高了血清/血漿中脂肪酸組分檢測的可信度。

　　氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-TOFMS)是最有潛力的氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)之一，TOF質(zhì)量分析器具有比四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀更高的分辨率和更寬泛的質(zhì)量范圍(1-1200amu)，質(zhì)量精度也高，極大改善了譜圖的信噪比。MichaelGoettel等[12]采用乙酰氯甲醇衍生化法，GC-TOF-MS定量分析了人血漿中44種脂肪酸，反映了戒煙前后人血漿中的脂肪酸譜的變化，精確定量了C4:0到C32:0的脂肪酸同分異構(gòu)體及其代謝物。

　　2.2液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法

　　脂肪酸與不同衍生化試劑結(jié)合，可接上紫外基團(tuán)或熒光基團(tuán)提高檢測信號(hào);也可實(shí)現(xiàn)脂肪酸在LC質(zhì)譜不同離子源的正、負(fù)離子模式下電離，提高檢測效能。硝基苯肼類是常用紫外衍生化試劑。Chen等[16]使用2-硝基苯肼衍生化方法分析了人血清中18種脂肪酸(C4:0-C26:0)，Phenyl-Hexyl(苯基-己基)色譜柱，方法中過量硝基苯肼類試劑和反應(yīng)副產(chǎn)物對(duì)LC-MS/MS分析的干擾性較小。高永平[17]自制熒光衍生化試劑1-[1-(哌嗪)乙酮]-2-[(4-二甲氨基)苯基]-菲[9,10-d]咪唑(DPPIPE)，柱前衍生化，高效液相色譜-熒光檢測器法分析了人體血漿中8種脂肪酸。熒光衍生試劑可以與目標(biāo)化合物耦合上能產(chǎn)生熒光的生色基團(tuán)，與熒光檢測器聯(lián)用，提高選擇性和10倍以上的靈敏度。

　　文中作者認(rèn)為分析長鏈脂肪酸時(shí)，C8色譜柱比C18色譜柱更能避免疏水性內(nèi)源干擾物質(zhì)。在液相質(zhì)譜中，通過酰胺衍生化可產(chǎn)生脂肪酸陽離子衍生物，配合正離子模式(ESI+)、流動(dòng)相中加入甲酸促電離，有效改善了色譜分離度、提高了靈敏度。Bian等[18]通過膽胺衍生化法，改進(jìn)了長鏈脂肪酸在人血清中的電離和分離效率，與長鏈脂肪酸非衍生化方法相比，平均LOD提高了大約60倍。反應(yīng)時(shí)脂肪酸先與鎓鹽類縮合劑反應(yīng)生成中間體，中間體再與膽胺發(fā)生反應(yīng)，加入的三乙胺提供了弱堿性環(huán)境促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行。Jiang等[19]提出了一種孿生化衍生化方法。

　　方法用磺酰哌嗪衍生血清樣品中的脂肪酸，用二甲基磺酰哌嗪衍生標(biāo)準(zhǔn)品作為定量參照品，進(jìn)樣前1:1混合，儀器中每個(gè)脂肪酸都有相應(yīng)的參照品。由于兩種衍生化產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)上都極其相似，血清中脂肪酸與參照品之間的定量差異比使用同位素內(nèi)標(biāo)更小，同時(shí)有利于在LC-MS/MS中提供一對(duì)一的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。短鏈脂肪酸的理化性質(zhì)與中長鏈脂肪酸有較大區(qū)別，衍生化能改變其出峰靠前、電離度差的特點(diǎn)。Jaochico等[20]采用含有吡啶的衍生化試劑O-芐基羥胺和碳二亞胺鹽酸(EDC·HCL)，建立了反相HPLC-MS/MS方法來定量人血漿和尿液基質(zhì)中的9種短鏈脂肪酸方法。

　　吡啶易電離提供了平衡態(tài)的弱堿性環(huán)境，能促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行。O-芐基羥胺衍生化操作簡單、反應(yīng)速度快、不用加熱，不過這種非目標(biāo)性衍生化反應(yīng)產(chǎn)生的中間副產(chǎn)物過多，過量衍生化試劑常會(huì)干擾檢測靈敏度和重現(xiàn)性。Song等[21]采用乙酰肼類化合物吉拉德-T試劑(Girard’sreagentT,GT)和EDC衍生化了直腸真桿菌體外培養(yǎng)基上清液中的5種短鏈脂肪酸(C2:0-C6:0)。丙酸經(jīng)GT試劑衍生化后，靈敏度是未衍生化的1.2×108倍，是3-硝基苯肼衍生化時(shí)的100倍，靈敏度顯著提高。

　　2.3其他分析方法

　　近年來，為了發(fā)現(xiàn)新的脂肪酸異構(gòu)體、研究脂肪酸及其代謝物，研究者們開發(fā)出一些新的脂質(zhì)組學(xué)分析法。Zhao等[22]利用“鳥槍”式直接進(jìn)樣法分析了人血漿中不飽和脂肪酸中“C═C”雙鍵異構(gòu)體。樣品不經(jīng)過色譜柱分離，進(jìn)樣后直接進(jìn)入質(zhì)譜，根據(jù)電荷差異在離子源內(nèi)進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人血漿中重要脂肪酸C18:1有兩種“C═C”位置(∆9和∆11)同分異構(gòu)體存在。

　　但此法不適合難電離的脂質(zhì)成分。Wang等[23]開發(fā)了一種中心切割二維液相色譜-質(zhì)譜方法，能在30分鐘內(nèi)識(shí)別了血漿中700余種游離脂肪酸及代謝物。化合物由預(yù)柱洗脫按極性分為代謝組和脂質(zhì)組，中心切割系統(tǒng)通過不同閥門將以上2個(gè)組分切割到不同的液相色譜柱中進(jìn)行分離。在一次進(jìn)樣中可得到代謝組分和脂質(zhì)組分的數(shù)千個(gè)代謝產(chǎn)物信息，準(zhǔn)確辨別雙鍵異構(gòu)體和對(duì)映異構(gòu)體。

　　3血漿/血清中游離脂肪酸及酯化脂肪酸參考值范圍

　　脂肪酸是機(jī)體重要代謝標(biāo)志物，健康人體血漿或血清樣本中脂肪酸組成相對(duì)穩(wěn)定。文獻(xiàn)[3,16,24,25]中，正常組中棕櫚酸、油酸、α-亞油酸的范圍在285.4-4064.5µmol/l、178.7～3900µmol/l、279.7～4970.5之間，最低值與最高值之間最大差異在21倍以內(nèi)。而人們頗為關(guān)注的Omega-3家族脂肪酸α-亞麻酸、EPA、DHA的范圍在0.8～400.1µmol/l、4.4～829µmol/l、6.4～437.7之間，最低值與最高值的最大差異可達(dá)500倍，其參考范圍出現(xiàn)了較大差異。

　　但是由于各實(shí)驗(yàn)室的分析方法不一樣、定量方法既有內(nèi)標(biāo)法又有外標(biāo)法、沒有使用標(biāo)定的質(zhì)量控制物質(zhì)校正結(jié)果等原因，結(jié)果的可靠性較難評(píng)判，研究成果僅適用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部使用，很難說明Omega-3脂肪酸參考范圍的差異是正常的還是異常的。此外，一些文獻(xiàn)中使用面積歸一法計(jì)算各脂肪酸峰面積的相對(duì)值(%)，沒有準(zhǔn)確定量值使其數(shù)據(jù)難以再次分析，無法將數(shù)據(jù)資源利用充分。而通過標(biāo)準(zhǔn)曲線定量來得到絕對(duì)值(臨床上常用摩爾濃度表示)，是一種能準(zhǔn)確表示脂肪酸含量，也能方便進(jìn)一步分析、統(tǒng)計(jì)的表示方式，具有先進(jìn)性，應(yīng)得到廣泛使用。

　　4展望

　　脂肪酸組分分析是和膳食攝入、營養(yǎng)健康息息相關(guān)的一個(gè)領(lǐng)域，對(duì)生命科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究意義重大。近年來脂肪酸組分分析方法的研究已取得諸多進(jìn)展，但在數(shù)據(jù)分析與整合(不同研究之間、不同人群之間)及與疾病因果關(guān)系的探討等方面仍面臨挑戰(zhàn)。為此，首先要開發(fā)選擇性好、效率高、穩(wěn)定性強(qiáng)的衍生化技術(shù)，在脂肪酸中引入易電離的特定基團(tuán)，能夠減弱其極性、增強(qiáng)其揮發(fā)性并產(chǎn)生特征化的離子。

　　其次，要開發(fā)脂肪酸內(nèi)源性血漿/血清的質(zhì)量控制樣品和對(duì)照品，實(shí)現(xiàn)不同檢測系統(tǒng)之間的可比性。從公共衛(wèi)生角度講，科學(xué)、有效的脂肪酸組分分析方法能有效地推動(dòng)國家水平脂肪酸參考值范圍的建立、實(shí)現(xiàn)某些疾病早期臨床診斷的生物標(biāo)志物篩選、指導(dǎo)公眾脂肪酸合理攝入，為促進(jìn)人類健康提供有力的科學(xué)支撐。

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　　作者：馬妍，陳晨，霍軍生

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