芡實SBE3基因克隆及其生物信息學分析

　　摘要芡實淀粉是芡實品質的重要載體，淀粉分支酶SBE3能夠調控支鏈淀粉的合成，為了深入研究芡實SBE3基因的功能與調控機制，本研究克隆出芡實淀粉分支酶SBE3基因并對其進行相關生物信息學分析。通過提取芡實種子總RNA，采用RTPCR方法克隆芡實SBE3基因，利用軟件和在線網(wǎng)站對該基因及其編碼氨基酸序列的理化性質、蛋白質結構、系統(tǒng)發(fā)育樹和啟動子等進行生物信息學分析與預測。獲得EfSBE3基因全長2830bp，開放閱讀框長2736bp，編碼911個氨基酸;預測其為親水性蛋白，無跨膜區(qū)，無信號肽。系統(tǒng)進化分析表明該序列與同科植物睡蓮親緣關系最近，啟動子分析共預測出10類順式作用元件。本研究結果可為芡實分子育種提供理論依據(jù)。

　　關鍵詞芡實EuryaleferoxSalisb.);SBE3;基因克隆;生物信息學分析

　　芡實為睡蓮科水生草本植物芡EuryaleferoxSalisb.)的干燥成熟種仁，既是傳統(tǒng)中藥材，也是常見的食品材料，具有益腎固精，補脾止瀉，除濕止帶的功效宋晶和吳啟南,2010)。芡實中淀粉所占比重最大，達到70%以上。淀粉主要由直鏈淀粉和支鏈淀粉構成，直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例以及支鏈淀粉的結構能夠決定淀粉的性質(Linetal.,2019)，支鏈淀粉特性對芡實品質調控起重要作用。本研究基于前期轉錄組數(shù)據(jù)，篩選出不同品種芡實與淀粉合成途徑相關的差異基因SBE3。

　　淀粉分支酶(strarchbranchingenzyme,SBE)能夠催化直鏈淀粉變?yōu)橹ф湹矸�，在葡聚糖鏈上引�?alpha;1,6糖苷鍵，使其產(chǎn)生分支結構，是合成淀粉分支的關鍵酶劉玉匯等,2010)，對于淀粉的合成過程至關重要(Dumezetal.,2006)。植物淀粉中的SBEs可以分為個大類：SBEI型和SBEII型，SBEII型中存在種同工酶SBE3(SBEIIb)和SBE4(SBEIIa)，SBEIIa在植物體內(nèi)廣泛表達，而SBEIIb主要在發(fā)育中的胚乳里表達(Gorenetal.,2018)。在淀粉合成延伸階段中，與SBEIIa相比，SBEIIb傾向于轉移更短的鏈(Mizunoetal.,2001)。目前已在擬南芥Arabidopsisthaliana、水稻Oryzasativa、玉米Zeamays和甘薯Ipomoeabatatas等多種植物中鑒定并克隆出SBE3基因(Hanetal.,2007;Yanetal.,2009;Peietal.,2015)。

　　SBEIIb基對胚乳中支鏈淀粉的精細結構和淀粉結晶結構的形成起著特殊的作用，同時對淀粉內(nèi)部的顆粒結構也有一定的影響(Nakamuraetal.,2020)。芡實SBE1基因已被證實，其表達變化與不同品種芡實的支鏈淀粉差異相關徐旭等,2019)，但對于芡實中的其他類型淀粉分支酶相關研究仍較為缺乏。本研究結合課題組芡實轉錄組與芡實基因組數(shù)據(jù)，采用RTPCR克隆芡實中的SBE3全長序列，對該基因的開放閱讀框和氨基酸序列進行相關的生物信息學分析。以期為研究SBE3的功能及體內(nèi)表達，揭示芡實品質形成機制以及芡實的分子育種研究提供理論基礎。

　　1結果與分析

　　1.1芡實SBE3基因克隆及序列分析

　　電泳結果顯示28S和18S的條帶清晰完整，無彌散拖尾等現(xiàn)象，說明芡實種子RNA質量可靠，沒有發(fā)生降解，可以用于下一步實驗。將逆轉錄后的cDNA第一鏈作為模板，進行全長擴增，電泳結果顯示在約3000bp處出現(xiàn)目標條帶。

　　將目的條帶進行膠回收純化，膠回收產(chǎn)物經(jīng)連接轉化后進行測序，得到全長為2830bp的芡實SBE3基因序列，與預期大小基本一致，命名為EfSBE3。將SBE3基因的全長序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行blastx比對后發(fā)現(xiàn)，該序列與藍星睡蓮Nymphaeacolorata的SBE3基因同源性最高，相似性達到91.59%。利用NCBI的ORFfinder查詢，發(fā)現(xiàn)其包含一個長為2736bp的開放閱讀框(openreadingframe,ORF)。

　　1.2EfSBE3編碼蛋白的理化性質分析

　　通過NCBI中的ConservedDomain搜索后發(fā)現(xiàn)該編碼的蛋白質具有α淀粉酶保守結構域(223~2733)屬于PLN02960家族，PLN02960被歸類為一種可能跨越多個域的結構域，是超家族cl33608的唯一成員。利用ExPASyProtParam軟件對EfSBE3基因編碼氨基酸序列的理化性質進行在線分析，預測其分子式為476272061272137041，相對分子質量為105509.76，半衰期較長，為30h，等電點為5.97，脂肪族氨基酸指數(shù)為75.02，不穩(wěn)定系數(shù)為41.76，屬于不穩(wěn)定蛋白。在氨基酸組成中，亮氨酸(Leu)含量最高為9.20%，此外含有8.00%的谷氨酸(Glu)和7.00%的甘氨酸(Gly)等，其中包括130個負電荷殘基(Asp+Glu)和112個正電荷殘基(Arg+Lys)。

　　1.3EfSBE3編碼蛋白的親疏水性、跨膜結構和信號肽

　　利用ExPasyProtScale軟件在線預測編碼蛋白的親疏水性，結果顯示EfSBE3編碼蛋白的出現(xiàn)在最高值第500個氨基酸處為2.578;在第70個氨基酸處出現(xiàn)最低值為3.756，平均疏水性為0.490，親水性強，故推測該蛋白為親水性蛋白，與前文理化性質中的預測結果類似。通過TMHMM2.0在線軟件預測EfSBE3編碼蛋白序列有無跨膜螺旋結構，預測結果表明該蛋白不存在跨膜結構。在線軟件SignalP4.1信號肽預測分析結果顯示，得分最高為0.111，得分最高為0.108，得分最高為0.177，表明EfSBE3編碼氨基酸中不含信號肽，從而推測其為非分泌蛋白。

　　1.4EfSBE3編碼蛋白的糖基化位點和磷酸化位點

　　使用NetNGlyc1.0軟件，EfSBE3編碼蛋白預測各值得分均小于0.5，說明無可能的糖基化位點。通過NetPhos3.1軟件在線預測，編碼蛋白中共發(fā)現(xiàn)140個可能存在的磷酸化位點，其中共分析出82個特異性激酶位點，包括58個絲氨酸(S)、16個蘇氨酸(T)、個酪氨酸(Y)。參考蛋白激酶分類(Ho,2014)，特異性激酶共有15種，包括屬于ACG組的以環(huán)腺苷酸(cAMP)依賴的蛋白激酶PKA、環(huán)鳥苷酸(cGMP)依賴的蛋白酶PKG及鈣和磷脂依賴的蛋白激酶PKC以及近親激酶PKB，屬于CMGG組的作用于下游的磷酸化級聯(lián)系統(tǒng)的CK2，GSK3，p38MAPK，cdk5和cdc2，屬于傳統(tǒng)PTK組的EGFR以及其他植物蛋白激酶如INSR等。

　　2討論

　　已有研究表明，通過抑制SBE3基因的表達，可以使水稻中的直鏈淀粉含量增加(Weietal.,2010);而將SBE3anti轉入水稻中，直鏈淀粉含量有所降低趙江紅,2007)，SBE3基因在淀粉的合成尤其是支鏈淀粉的合成中起重要作用。為了探索芡實中SBE3的基因調控功能，解釋芡實淀粉特性的形成機制，本研究通過芡實轉錄組數(shù)據(jù)設計引物，獲得的EfSBE3的cDNA序列全長為2830bp，具有一個長為2736bp的完整的開放閱讀框，編碼有911個氨基酸，包含個α淀粉酶保守結構域。SBEs由中部的(β/α)桶裝區(qū)域或域，個氨基末端結構域和個羧基末端結構域組成(Abadetal.,2002);并預測其編碼氨基酸為不穩(wěn)定的親水性蛋白，無跨膜結構，無信號肽，不存在糖基化位點，含有140個磷酸化位點。

　　磷酸化是一種植物體內(nèi)常見的蛋白質翻譯后修飾方式，能夠參與植物的非生物脅迫及激素調控劉靜等,2021)。SBEs與其他參與淀粉合成的酶能夠形成異質蛋白復合物，這些蛋白復合物的組裝由蛋白磷酸化調控TetlowandEmes,2014)，所預測出磷酸化位點為研究芡實的表面修飾提供參考。本研究通過多序列比對可知，EfSBE3基因具有較強的保守性，有多個特征保守區(qū)域在序列中包含“EDAT”的SBE3特征氨基酸序列，而在SBEI和SBEII基因中該區(qū)域為“EDVS”氨基酸序列(KeelingandMyers,2010)，有助于開展EfSBE3基因的功能的深入研究。通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，芡實的SBE3基因能夠較好的與同為睡蓮科的種睡蓮聚為一支，推測SBE3基因在睡蓮科植物的進化過程中可能高度保守，為今后深入研究睡蓮科植物的進化行為提供參考。

　　本研究從啟動子區(qū)域中共預測出無氧誘導順式調節(jié)元件、MeJA反應順式調控元件、參與脫落酸反應的順式元件等10類作用元件;預測結果提示，當開展激素對芡實支鏈淀粉特性進行調控的相關研究時，可優(yōu)先考慮選擇茉莉酸甲酯、脫落酸和赤霉素。ARE，MBS，TCrich等脅迫響應元件表明它們可能在應對非生物脅迫中發(fā)揮潛在作用。這些植物相關順式作用元件為后續(xù)深入研究SBE3表達調控及環(huán)境脅迫影響提供了方向上的參考李濯雪和陳信波,2015)。

　　抗性淀粉作為淀粉中不能被人體消化的部分，在大腸中成為發(fā)酵的底物(BelloPerez,etal.,2020)。已有研究表明食用抗性淀粉有助于維持人體健康，改善多種疾病(DeMartinoandCockburn,2020)。在水稻SBE3基因中已發(fā)現(xiàn)一個控制水稻抗性淀粉合成的突變(Yangetal.,2012)，利用基因編輯技術編輯SBE3基因后，可以獲得具有高含量抗性淀粉的水稻白建江等,2018)。上述研究表明通過基因調控，可以改變淀粉特性，獲得具有高含量抗性淀粉的植株。本研究對芡實SBE3基因跨膜結構和蛋白結構進行預測，并對其保守序列和啟動子順式元件開展分析，為今后深入挖掘該基因的基因功能以及轉錄因子的調控，調節(jié)芡實淀粉特性，開展芡實基于淀粉的分子優(yōu)良育種提供了一定的理論依據(jù)。

　　3材料與方法

　　3.1實驗材料及試劑

　　芡實種子采集自江蘇省高郵市界首鎮(zhèn)芡實種子種苗基地(33°00′N,119°41′E)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學吳啟南教授鑒定為睡蓮科植物芡EuryaleferoxSalisb.)的種子，經(jīng)液氮快速冷凍后，保存于80℃，備用。RNA提取試劑盒、高保真酶及pMD19克隆載體購于大連寶生物科技有限公司;cDNA逆轉錄試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司;DNA凝膠回收試劑盒購于賽默飛世爾科技中國有限公司;DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞購于北京天根生化科技有限公司;2×EasyTaqMix購于北京全式金生物技術有限公司;引物合成和測序技術服務由生工生物工程上海股份有限公司提供。

　　3.2芡實種子總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成芡實樣品的總RNA提取參照TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtraction試劑盒中的多糖多酚組織提取操作進行。cDNA第一鏈合成按照HiScript®II1stStrandcDNASynthesis試劑盒操作進行。

　　3.3芡實SBE3基因克隆

　　基于CoGe數(shù)據(jù)庫中的芡實基因組數(shù)據(jù)，結合課題組前期芡實轉錄組數(shù)據(jù)比對，獲得SBE3基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件進行SBE3基因特異性引物設計(F:ATGGCCGTTGATTCTTCTTCGTT;R:CATCGGTACTCGCAGGAGCTTTC)。擴增體系總體積為25μL，包括高保真酶12.5μL，上游和下游引物共0.75μ，芡實種子cDNA2μL，滅菌水9.75μL，PCR反應的條件為：94℃預變性5min;98℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸3min;共35個循環(huán)，72℃保持10min，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用TheGeneJETGelExtraction試劑盒膠回收純化，并通過pMD19載體進行載體連接轉化至DH5α感受態(tài)細胞，培養(yǎng)單菌落，利用菌落PCR篩選陽性克隆送上海生工有限公司測序。

　　植物論文投稿刊物：《分子植物育種》(Molecular Plant Breeding)雜志創(chuàng)刊于2003年，由國家科技部批準，國家新聞出版署核準，海南省生物工程協(xié)會主辦，海南省科學技術會主管，國內(nèi)統(tǒng)一刊號：46-1068/S，國際標準刊號：1672-416X，郵發(fā)代號：84-23，單月28日出版。

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　　作者：王前嚴洪楷邵永芳景宗慧劉莉成鮑錁吳啟南

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