芡實SBE3基因克隆及其生物信息學(xué)分析

　　摘要芡實淀粉是芡實品質(zhì)的重要載體，淀粉分支酶SBE3能夠調(diào)控支鏈淀粉的合成，為了深入研究芡實SBE3基因的功能與調(diào)控機制，本研究克隆出芡實淀粉分支酶SBE3基因并對其進行相關(guān)生物信息學(xué)分析。通過提取芡實種子總RNA，采用RTPCR方法克隆芡實SBE3基因，利用軟件和在線網(wǎng)站對該基因及其編碼氨基酸序列的理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育樹和啟動子等進行生物信息學(xué)分析與預(yù)測。獲得EfSBE3基因全長2830bp，開放閱讀框長2736bp，編碼911個氨基酸;預(yù)測其為親水性蛋白，無跨膜區(qū)，無信號肽。系統(tǒng)進化分析表明該序列與同科植物睡蓮親緣關(guān)系最近，啟動子分析共預(yù)測出10類順式作用元件。本研究結(jié)果可為芡實分子育種提供理論依據(jù)。

　　關(guān)鍵詞芡實EuryaleferoxSalisb.);SBE3;基因克隆;生物信息學(xué)分析

　　芡實為睡蓮科水生草本植物芡EuryaleferoxSalisb.)的干燥成熟種仁，既是傳統(tǒng)中藥材，也是常見的食品材料，具有益腎固精，補脾止瀉，除濕止帶的功效宋晶和吳啟南,2010)。芡實中淀粉所占比重最大，達到70%以上。淀粉主要由直鏈淀粉和支鏈淀粉構(gòu)成，直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例以及支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)能夠決定淀粉的性質(zhì)(Linetal.,2019)，支鏈淀粉特性對芡實品質(zhì)調(diào)控起重要作用。本研究基于前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出不同品種芡實與淀粉合成途徑相關(guān)的差異基因SBE3。

　　淀粉分支酶(strarchbranchingenzyme,SBE)能夠催化直鏈淀粉變?yōu)橹ф湹矸�，在葡聚糖鏈上引�?alpha;1,6糖苷鍵，使其產(chǎn)生分支結(jié)構(gòu)，是合成淀粉分支的關(guān)鍵酶劉玉匯等,2010)，對于淀粉的合成過程至關(guān)重要(Dumezetal.,2006)。植物淀粉中的SBEs可以分為個大類：SBEI型和SBEII型，SBEII型中存在種同工酶SBE3(SBEIIb)和SBE4(SBEIIa)，SBEIIa在植物體內(nèi)廣泛表達，而SBEIIb主要在發(fā)育中的胚乳里表達(Gorenetal.,2018)。在淀粉合成延伸階段中，與SBEIIa相比，SBEIIb傾向于轉(zhuǎn)移更短的鏈(Mizunoetal.,2001)。目前已在擬南芥Arabidopsisthaliana、水稻Oryzasativa、玉米Zeamays和甘薯Ipomoeabatatas等多種植物中鑒定并克隆出SBE3基因(Hanetal.,2007;Yanetal.,2009;Peietal.,2015)。

　　SBEIIb基對胚乳中支鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)和淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)的形成起著特殊的作用，同時對淀粉內(nèi)部的顆粒結(jié)構(gòu)也有一定的影響(Nakamuraetal.,2020)。芡實SBE1基因已被證實，其表達變化與不同品種芡實的支鏈淀粉差異相關(guān)徐旭等,2019)，但對于芡實中的其他類型淀粉分支酶相關(guān)研究仍較為缺乏。本研究結(jié)合課題組芡實轉(zhuǎn)錄組與芡實基因組數(shù)據(jù)，采用RTPCR克隆芡實中的SBE3全長序列，對該基因的開放閱讀框和氨基酸序列進行相關(guān)的生物信息學(xué)分析。以期為研究SBE3的功能及體內(nèi)表達，揭示芡實品質(zhì)形成機制以及芡實的分子育種研究提供理論基礎(chǔ)。

　　1結(jié)果與分析

　　1.1芡實SBE3基因克隆及序列分析

　　電泳結(jié)果顯示28S和18S的條帶清晰完整，無彌散拖尾等現(xiàn)象，說明芡實種子RNA質(zhì)量可靠，沒有發(fā)生降解，可以用于下一步實驗。將逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA第一鏈作為模板，進行全長擴增，電泳結(jié)果顯示在約3000bp處出現(xiàn)目標(biāo)條帶。

　　將目的條帶進行膠回收純化，膠回收產(chǎn)物經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后進行測序，得到全長為2830bp的芡實SBE3基因序列，與預(yù)期大小基本一致，命名為EfSBE3。將SBE3基因的全長序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行blastx比對后發(fā)現(xiàn)，該序列與藍星睡蓮Nymphaeacolorata的SBE3基因同源性最高，相似性達到91.59%。利用NCBI的ORFfinder查詢，發(fā)現(xiàn)其包含一個長為2736bp的開放閱讀框(openreadingframe,ORF)。

　　1.2EfSBE3編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

　　通過NCBI中的ConservedDomain搜索后發(fā)現(xiàn)該編碼的蛋白質(zhì)具有α淀粉酶保守結(jié)構(gòu)域(223~2733)屬于PLN02960家族，PLN02960被歸類為一種可能跨越多個域的結(jié)構(gòu)域，是超家族cl33608的唯一成員。利用ExPASyProtParam軟件對EfSBE3基因編碼氨基酸序列的理化性質(zhì)進行在線分析，預(yù)測其分子式為476272061272137041，相對分子質(zhì)量為105509.76，半衰期較長，為30h，等電點為5.97，脂肪族氨基酸指數(shù)為75.02，不穩(wěn)定系數(shù)為41.76，屬于不穩(wěn)定蛋白。在氨基酸組成中，亮氨酸(Leu)含量最高為9.20%，此外含有8.00%的谷氨酸(Glu)和7.00%的甘氨酸(Gly)等，其中包括130個負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)和112個正電荷殘基(Arg+Lys)。

　　1.3EfSBE3編碼蛋白的親疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽

　　利用ExPasyProtScale軟件在線預(yù)測編碼蛋白的親疏水性，結(jié)果顯示EfSBE3編碼蛋白的出現(xiàn)在最高值第500個氨基酸處為2.578;在第70個氨基酸處出現(xiàn)最低值為3.756，平均疏水性為0.490，親水性強，故推測該蛋白為親水性蛋白，與前文理化性質(zhì)中的預(yù)測結(jié)果類似。通過TMHMM2.0在線軟件預(yù)測EfSBE3編碼蛋白序列有無跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，預(yù)測結(jié)果表明該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。在線軟件SignalP4.1信號肽預(yù)測分析結(jié)果顯示，得分最高為0.111，得分最高為0.108，得分最高為0.177，表明EfSBE3編碼氨基酸中不含信號肽，從而推測其為非分泌蛋白。

　　1.4EfSBE3編碼蛋白的糖基化位點和磷酸化位點

　　使用NetNGlyc1.0軟件，EfSBE3編碼蛋白預(yù)測各值得分均小于0.5，說明無可能的糖基化位點。通過NetPhos3.1軟件在線預(yù)測，編碼蛋白中共發(fā)現(xiàn)140個可能存在的磷酸化位點，其中共分析出82個特異性激酶位點，包括58個絲氨酸(S)、16個蘇氨酸(T)、個酪氨酸(Y)。參考蛋白激酶分類(Ho,2014)，特異性激酶共有15種，包括屬于ACG組的以環(huán)腺苷酸(cAMP)依賴的蛋白激酶PKA、環(huán)鳥苷酸(cGMP)依賴的蛋白酶PKG及鈣和磷脂依賴的蛋白激酶PKC以及近親激酶PKB，屬于CMGG組的作用于下游的磷酸化級聯(lián)系統(tǒng)的CK2，GSK3，p38MAPK，cdk5和cdc2，屬于傳統(tǒng)PTK組的EGFR以及其他植物蛋白激酶如INSR等。

　　2討論

　　已有研究表明，通過抑制SBE3基因的表達，可以使水稻中的直鏈淀粉含量增加(Weietal.,2010);而將SBE3anti轉(zhuǎn)入水稻中，直鏈淀粉含量有所降低趙江紅,2007)，SBE3基因在淀粉的合成尤其是支鏈淀粉的合成中起重要作用。為了探索芡實中SBE3的基因調(diào)控功能，解釋芡實淀粉特性的形成機制，本研究通過芡實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計引物，獲得的EfSBE3的cDNA序列全長為2830bp，具有一個長為2736bp的完整的開放閱讀框，編碼有911個氨基酸，包含個α淀粉酶保守結(jié)構(gòu)域。SBEs由中部的(β/α)桶裝區(qū)域或域，個氨基末端結(jié)構(gòu)域和個羧基末端結(jié)構(gòu)域組成(Abadetal.,2002);并預(yù)測其編碼氨基酸為不穩(wěn)定的親水性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)，無信號肽，不存在糖基化位點，含有140個磷酸化位點。

　　磷酸化是一種植物體內(nèi)常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，能夠參與植物的非生物脅迫及激素調(diào)控劉靜等,2021)。SBEs與其他參與淀粉合成的酶能夠形成異質(zhì)蛋白復(fù)合物，這些蛋白復(fù)合物的組裝由蛋白磷酸化調(diào)控TetlowandEmes,2014)，所預(yù)測出磷酸化位點為研究芡實的表面修飾提供參考。本研究通過多序列比對可知，EfSBE3基因具有較強的保守性，有多個特征保守區(qū)域在序列中包含“EDAT”的SBE3特征氨基酸序列，而在SBEI和SBEII基因中該區(qū)域為“EDVS”氨基酸序列(KeelingandMyers,2010)，有助于開展EfSBE3基因的功能的深入研究。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，芡實的SBE3基因能夠較好的與同為睡蓮科的種睡蓮聚為一支，推測SBE3基因在睡蓮科植物的進化過程中可能高度保守，為今后深入研究睡蓮科植物的進化行為提供參考。

　　本研究從啟動子區(qū)域中共預(yù)測出無氧誘導(dǎo)順式調(diào)節(jié)元件、MeJA反應(yīng)順式調(diào)控元件、參與脫落酸反應(yīng)的順式元件等10類作用元件;預(yù)測結(jié)果提示，當(dāng)開展激素對芡實支鏈淀粉特性進行調(diào)控的相關(guān)研究時，可優(yōu)先考慮選擇茉莉酸甲酯、脫落酸和赤霉素。ARE，MBS，TCrich等脅迫響應(yīng)元件表明它們可能在應(yīng)對非生物脅迫中發(fā)揮潛在作用。這些植物相關(guān)順式作用元件為后續(xù)深入研究SBE3表達調(diào)控及環(huán)境脅迫影響提供了方向上的參考李濯雪和陳信波,2015)。

　　抗性淀粉作為淀粉中不能被人體消化的部分，在大腸中成為發(fā)酵的底物(BelloPerez,etal.,2020)。已有研究表明食用抗性淀粉有助于維持人體健康，改善多種疾病(DeMartinoandCockburn,2020)。在水稻SBE3基因中已發(fā)現(xiàn)一個控制水稻抗性淀粉合成的突變(Yangetal.,2012)，利用基因編輯技術(shù)編輯SBE3基因后，可以獲得具有高含量抗性淀粉的水稻白建江等,2018)。上述研究表明通過基因調(diào)控，可以改變淀粉特性，獲得具有高含量抗性淀粉的植株。本研究對芡實SBE3基因跨膜結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，并對其保守序列和啟動子順式元件開展分析，為今后深入挖掘該基因的基因功能以及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，調(diào)節(jié)芡實淀粉特性，開展芡實基于淀粉的分子優(yōu)良育種提供了一定的理論依據(jù)。

　　3材料與方法

　　3.1實驗材料及試劑

　　芡實種子采集自江蘇省高郵市界首鎮(zhèn)芡實種子種苗基地(33°00′N,119°41′E)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定為睡蓮科植物芡EuryaleferoxSalisb.)的種子，經(jīng)液氮快速冷凍后，保存于80℃，備用。RNA提取試劑盒、高保真酶及pMD19克隆載體購于大連寶生物科技有限公司;cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司;DNA凝膠回收試劑盒購于賽默飛世爾科技中國有限公司;DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購于北京天根生化科技有限公司;2×EasyTaqMix購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;引物合成和測序技術(shù)服務(wù)由生工生物工程上海股份有限公司提供。

　　3.2芡實種子總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成芡實樣品的總RNA提取參照TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtraction試劑盒中的多糖多酚組織提取操作進行。cDNA第一鏈合成按照HiScript®II1stStrandcDNASynthesis試劑盒操作進行。

　　3.3芡實SBE3基因克隆

　　基于CoGe數(shù)據(jù)庫中的芡實基因組數(shù)據(jù)，結(jié)合課題組前期芡實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對，獲得SBE3基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件進行SBE3基因特異性引物設(shè)計(F:ATGGCCGTTGATTCTTCTTCGTT;R:CATCGGTACTCGCAGGAGCTTTC)。擴增體系總體積為25μL，包括高保真酶12.5μL，上游和下游引物共0.75μ，芡實種子cDNA2μL，滅菌水9.75μL，PCR反應(yīng)的條件為：94℃預(yù)變性5min;98℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸3min;共35個循環(huán)，72℃保持10min，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用TheGeneJETGelExtraction試劑盒膠回收純化，并通過pMD19載體進行載體連接轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)單菌落，利用菌落PCR篩選陽性克隆送上海生工有限公司測序。

　　植物論文投稿刊物：《分子植物育種》(Molecular Plant Breeding)雜志創(chuàng)刊于2003年，由國家科技部批準(zhǔn)，國家新聞出版署核準(zhǔn)，海南省生物工程協(xié)會主辦，海南省科學(xué)技術(shù)會主管，國內(nèi)統(tǒng)一刊號：46-1068/S，國際標(biāo)準(zhǔn)刊號：1672-416X，郵發(fā)代號：84-23，單月28日出版。

　　參考文獻：

　　AbadM.C.,BinderupK.,RiosSteinerJ.,ArniR.K.,PreissJ.,andGeigerJ.H.,2002,TheXraycrystallographicstructureofEscherichiacolibranchingenzyme,J.Biol.Chem.,277(44):4216442170.

　　BaiJ.J.,ZhangJ.M.,PiaoZ.Z.,FangJ.,LiG.S.,WangY.,andYangR.F.,2018,ObtainofnewricevarietywithhighresistantstarchbasedontheeditionofriceSBE3genebyCRISPR/Cas9system,FenziZhiwuYuzhong(MolecularPlantBreeding),16(5):15101516.

　　(白建江,張建明,樸鐘澤,方軍,李剛燮,王亞,楊瑞芳,2018,應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯水稻SBE3基因獲得高抗性淀粉水稻新品系,分子植物育種,16(5):15101516.)

　　BelloPerezL.A.,FloresSilvaP.C.,AgamaAcevedoE.,andTovarJ.,2020,Starchdigestibility:past,present,andfuture,J.Sci.FoodAgric.,100(14):50095016.DemartinoP.,andCockburnD.W.,2020,Resistantstarch:impactonthegutmicrobiomeandhealth,Curr.Opin.Biotechnol.,61:6671.

　　DumezS.,WattebledF.,DauvilleeD.,DelvalleD.,PlanchotV.,BallS.G.,andD'HulstC.,2006,MutantsofArabidopsislackingstarchbranchingenzymeIIsubstituteplastidialstarchsynthesisbycytoplasmicmaltoseaccumulation,PlantCell,18(10):26942709.

　　GorenA.,AshlockD.,andTetlowI.J.,2018,Starchformationinsideplastidsofhigherplants,Protoplasma,255(6):18551876.HanY.,SunF.J.,RosalesMendozaS.,andKorbanS.S.,2007,Threeorthologsinrice,Arabidopsis,andPopulusencodingstarchbranchingenzymes(SBEs)aredifferentfromotherSBEgenefamiliesinplants,Gene,401(12):123130.HoH.L.,2014,Plantproteinkinaseandproteinproteininteraction,J.Biodivers.Biopros.Dev.,2(1):1000142.

　　作者：王前嚴(yán)洪楷邵永芳景宗慧劉莉成鮑錁吳啟南

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