本文摘要：摘要通過生物信息學(xué)技術(shù)分析比較認知完好的老年人(60~99歲)與中青年人(20~59歲)腦部海馬組織(hippocampaltissue，HC)的基因芯片數(shù)據(jù)，初步篩選出差異表達基因，進而預(yù)測治療腦老化的潛在中藥藥物。從基因表達數(shù)據(jù)庫(GeneExpressionOmnibus，GEO)下載GSE11882
摘要通過生物信息學(xué)技術(shù)分析比較認知完好的老年人(60~99歲)與中青年人(20~59歲)腦部海馬組織(hippocampaltissue，HC)的基因芯片數(shù)據(jù)，初步篩選出差異表達基因，進而預(yù)測治療腦老化的潛在中藥藥物。從基因表達數(shù)據(jù)庫(GeneExpressionOmnibus，GEO)下載GSE11882基因芯片，基于R語言軟件篩選差異表達基因(differentiallyexpressedgenes,DEGs)，通過STRING數(shù)據(jù)庫、Cytoscape軟件及其插件分析得到差異表達基因的關(guān)鍵基因，對關(guān)鍵基因進行基因本體論(geneontology，GO)及京都基因與基因組百科全書(Kyotoencyclopediaofgenesandgnomes，KEGG)分析，通過關(guān)鍵基因與醫(yī)學(xué)本體信息檢索平臺(CoremineMedical)相互映射，篩選治療腦老化的中藥，并構(gòu)建“藥物活性成分作用靶點”網(wǎng)絡(luò)。篩選出268個差異表達基因，包括246個下調(diào)基因和22個上調(diào)基因。差異表達基因共得出15個關(guān)鍵基因，關(guān)鍵基因主要參與白細胞遷移、中性粒細胞活化、細胞趨化運動、小膠質(zhì)細胞活化、免疫效應(yīng)過程的調(diào)節(jié)等生物過程。KEGG通路分析顯示關(guān)鍵基因主要富集于炎癥過程、免疫反應(yīng)、細胞因子細胞因子受體相互作用、PI3KAkt信號通路、Rap1信號通路、趨化因子信號通路、Toll樣受體信號通路、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)通路等。篩選得到治療腦老化的潛在中藥為三七、人參、丹參、黃芪等。差異表達基因和關(guān)鍵基因的分析促進了對腦老化機制的理解，該研究為腦老化中藥干預(yù)的新藥開發(fā)提供了潛在基因靶標與研發(fā)思路。
關(guān)鍵詞腦老化;生物信息學(xué);差異表達基因;中藥預(yù)測
衰老是隨著年齡增加而緩慢出現(xiàn)、普遍發(fā)生的生物學(xué)過程[1]，大腦在衰老過程中主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)和記憶、注意力、決策速度、感官感知和運動協(xié)調(diào)能力的下降[2]。腦老化是大多數(shù)神經(jīng)退行性疾病的主要危險因素，包括阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease)和帕金森病(Parkinson'sdisease)，其患病率隨著年齡的增長而不斷增加，與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病很少或沒有有效的治療方法，這些疾病往往以不可逆轉(zhuǎn)的方式進展，已成為日益嚴重的全球公共衛(wèi)生問題，給家庭和社會帶來了巨大的負擔[3]。
腦老化過程涉及多個復(fù)雜的分子途徑，機制尚未闡明，單個通路不足以解釋腦老化的發(fā)生、發(fā)展過程，而中醫(yī)藥多成分、多靶點、多途徑的特征，有利于緩解腦老化進程進而起到治療作用。因此，識別腦老化中特定、敏感和可靠的生物標志物和病理基因，挖掘潛在中藥治療，有利于衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的早期診斷與治療。故本研究基于基因表達數(shù)據(jù)庫(GeneExpressionOmnibusdatabase，GEO)數(shù)據(jù)庫中原始芯片數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)的分析方法，初步篩選差異表達基因，進一步發(fā)掘關(guān)鍵基因，對關(guān)鍵基因的功能和通路進行富集分析，并將關(guān)鍵基因與中藥相互映射，得到潛在的治療靶點及藥物，為腦老化分子機制和治療藥物的新發(fā)現(xiàn)提供實驗研究的思路和理論依據(jù)。
1資料與方法
1.1數(shù)據(jù)提取從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載編號為GSE11882的基因片段原始數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)集包括24位認知完好的老年人(6099歲)與18位中青年(2059歲)死后腦部海馬組織(hippocampaltissue，HC)的基因芯片數(shù)據(jù)。該片段平臺為GPL570[HGU133_Plus_2]AffymetrixHumanGenomeU133Plus2.0Array。
1.2數(shù)據(jù)預(yù)處理
基于語言Bioconductor庫(http://www.bioconductor.org/)相關(guān)包對表達譜芯片進行數(shù)據(jù)預(yù)處理，通過“GEOquery”包[4]從GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE11882，去除掉個探針對應(yīng)多個分子的探針，當遇到對應(yīng)同一個分子的探針時，僅保留信號值最大的探針，過濾后的數(shù)據(jù)通過箱式圖查看樣本標準化的情況，通過主成分分析(principalcomponentsanalysis，PCA)圖以及統(tǒng)一流形逼近與投影(uniformmanifoldapproximationandprojection，UMAP)圖查看樣本分組間聚類情況。
1.3差異基因
差異表達基因的篩選通過語言“limmar”包[5]對芯片表達譜中每個探針進行檢驗和貝葉斯檢驗，差異表達基因以|log(foldchange)|>和調(diào)整的<0.05為篩選標準，來定義差異表達探針，負數(shù)代表下調(diào)，正數(shù)代表上調(diào)，通過GPL570平臺將探針轉(zhuǎn)換成基因名稱，利用語言制作差異表達基因的熱圖和火山圖[6]。
1.4關(guān)鍵基因及功能注釋
將差異表達基因(differentiallyexpressedgenes,DEGs)導(dǎo)入在線分析工具STRING11.0(https://stringdb.org/)，分別通過Cytoscape3.7.1軟件的CytoHubba插件、MCODE插件進行蛋白質(zhì)相互作用(proteinproteininteraction，PPI)分析篩選標準：有效結(jié)合分數(shù)>0.4)、網(wǎng)絡(luò)分析(CytoHubba根據(jù)nodes在網(wǎng)絡(luò)中的屬性進行排名，高degree的蛋白更傾向于是關(guān)鍵蛋白，因此以degree對節(jié)點進行排名、模塊分析篩選標準：degree=2,nodescore=0.2,core=2,max.Depth=100)等種方式綜合篩選關(guān)鍵基因(hubgene)。
接著對關(guān)鍵基因進行注釋，包括基因本體論(geneontology，GO)及京都基因與基因組百科全書(Kyotoencyclopediaofgenesandgnomes，KEGG)分析，GO分析劃分為生物學(xué)過程(biologicalrocess,BP)、分子功能(molecularfunction,MF)、細胞組件(cellularcomponent,CC)個方面。通過軟件“clusterProfiler”包[7]和“ggplot2”包[8]進行GO和KEGG富集分析和可視化。
1.5關(guān)鍵靶點對接及中藥預(yù)測
將篩選出的關(guān)鍵基因與CoremineMedical(http://www.coremine.com/)相互映射，篩選出關(guān)鍵基因相關(guān)的中藥，<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)中藥預(yù)測結(jié)果，從TCMSP(TraditionalChineseMedicineSystemspharmacology)數(shù)據(jù)庫篩選其活性成分(口服生物利用度≥30%，類藥性≥0.18)，并獲得上述活性成分的靶點信息，使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProt(http://www.uniprot.org/uploadlists/)將其轉(zhuǎn)換為統(tǒng)一基因名稱。基于CytoHubba進行網(wǎng)絡(luò)分析，通過MCC方法篩選排列前20的靶點并通過Cytoscape展示結(jié)果。
2結(jié)果
2.1數(shù)據(jù)預(yù)處理
箱式圖結(jié)果顯示各個樣本中位數(shù)基本在一個水平線上，說明樣本間歸一化程度好。PCA圖和UMAP圖樣本聚類情況顯示當各組的樣本分開，分組間差異明顯，說明后續(xù)差異分析有意義的結(jié)果可能會比較多。過濾后最終匯總獲取21655個基因表達水平數(shù)據(jù)。
2.2差異基因
基于GSE11882的基因片段原始數(shù)據(jù)，滿足|log(foldchange)|>和調(diào)整的<0.05標準的差異基因有268個，其中包括246個下調(diào)基因和22個上調(diào)基因;下調(diào)和上調(diào)最顯著的40個基因見2.3關(guān)鍵基因及功能注釋對268個差異基因進行關(guān)鍵基因的篩選。
首先，在STRING數(shù)據(jù)庫進行PPI分析，設(shè)置置信度>0.4，并下載相關(guān)TSV格式文件，得到PPI關(guān)系對文件;接著，使用Cytoscape軟件的插件CytoHubba對其進一步分析，以發(fā)現(xiàn)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵目標和子網(wǎng)絡(luò);然后使用ytoscape軟件的MCODE插件對其進行模塊分析。結(jié)果顯示，差異基因CytoHubba分析后依據(jù)degree定義前15個關(guān)鍵基因，MCODE分析后得到所得功能模塊最大者由34個節(jié)點，334條邊組成，score為20.242，該模塊即為PPI網(wǎng)絡(luò)中緊密聯(lián)系的區(qū)域。分析差異表達基因后，構(gòu)建了15個關(guān)鍵基因的PPI網(wǎng)絡(luò)。
2.4關(guān)鍵靶點對接及中藥預(yù)測
將關(guān)鍵基因映射到CoremineMedical數(shù)據(jù)庫，篩選治療腦老化的潛在中藥(<0.05)，得到人參、三七、黃芪、丹參等多味中藥，其中人參和三七味中藥具有益氣活血之功效，三七是PTPRC、TYROBP、VEGFA等多個關(guān)鍵基因映射的中藥。多項研究表明，人參具有抗衰老[913]以及改善認知障礙和保護神經(jīng)的作用[1419]，兩者可能作為分子治療藥物的潛在來源，故篩選上述味中藥構(gòu)建“藥物活性成分作用靶點”網(wǎng)絡(luò)。
基于CytoHubba插件通過MCC方法篩選排列前20的靶點，并以不同色階進行展示。人參和三七的藥物活性成分參與調(diào)控PTGS1、PTGS2、核受體輔激活蛋白(NCOA2)、類視黃醇受體(RXRA)、β腎上腺素能受體(ADRB2)、心臟鈉通道基因(SCN5A)等關(guān)鍵基因，可能成為治療腦老化的潛在中藥。
3討論
研究表明，衰老是大多數(shù)神經(jīng)退行性疾病的主要危險因素，它們與衰老的個生物學(xué)特征的關(guān)系如下：基因組不穩(wěn)定性、端粒磨損、表觀遺傳改變、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性喪失、線粒體功能障礙、細胞衰老、營養(yǎng)物質(zhì)傳感失調(diào)、細胞凋亡、干細胞衰竭和細胞間通訊的改變[3]。其中基因表達水平的改變在腦老化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，有助于解釋沒有嚴重的組織病理學(xué)變化下的輕度認知衰退[20]。
盡管對于阿爾茨海默病等認知深度衰退條件下的基因表達變化開展了許多研究[2123]，但對于認知完好的人類大腦在正常成年壽命中發(fā)生的基因組變化卻知之甚少。相關(guān)網(wǎng)絡(luò)和差異表達生物信息學(xué)分析已應(yīng)用于許多疾病，揭示了復(fù)雜的發(fā)病機制和新的生物標志物的診斷和治療[2425]。通過對芯片的挖掘分析，可以更好地研究腦老化的中心生物學(xué)機制，進而發(fā)現(xiàn)治療神經(jīng)退行性疾病的新靶點和新藥物。
3.1差異表達基因的功能與炎癥免疫的信號通路密切相關(guān)
本研究提取芯片GSE11882，通過生物信息學(xué)方法分析，篩選差異表達基因268個，其中包括246個下調(diào)基因和22個上調(diào)基因，然后繼續(xù)篩選出15個關(guān)鍵基因。為了明確關(guān)鍵基因之間的相互作用關(guān)系，MCODE分析后得到功能模塊最大者由34個節(jié)點，334條邊組成，提取PPI網(wǎng)絡(luò)中連接最為緊密且位于重要節(jié)點位置的15個基因，分別是PTPRC、ITGAM、TLR2、TYROBP、CD86、ITGB2、CSF1R、C3AR1、VEGFA、CCR1、CCL4、CCL2、FCER1G、LCP2、CXCR4。其中，PTPRC和ITGAM發(fā)揮核心作用，PTPRC(又稱CD45，白細胞共同抗原)是最豐富的跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶，在所有有核造血細胞上均有表達，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[26]。
研究表明，PTPRC基因缺失會加速腦淀粉樣變，導(dǎo)致促炎和抗β吞噬的小膠質(zhì)細胞活化[27]。ITGAM參與單核細胞、巨噬細胞和粒細胞的各種粘附相互作用，以及介導(dǎo)補體包被顆粒和病原體的攝取[28]。在小膠質(zhì)細胞中需要酪氨酸BP/DAP12來控制小膠質(zhì)細胞超氧化物離子的產(chǎn)生，這些離子促進腦發(fā)育過程中發(fā)生的神經(jīng)元凋亡[29]。研究表明，ITGAM作為微膠質(zhì)基因在神經(jīng)退化和大腦老化中起著重要作用[30]。GO分析表明關(guān)鍵基因參與的主要生物學(xué)過程為白細胞遷移、細胞趨化運動、小膠質(zhì)細胞活化、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、免疫效應(yīng)過程的調(diào)節(jié)等。在腦老化的發(fā)展和進程中，炎癥老化和免疫衰老，這是生物老化的個特征[31]。
在成長過程中，免疫系統(tǒng)對塑造大腦至關(guān)重要，神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)都會隨著年齡的增長而變化[32]，而炎癥是機體對任何損傷的基本保護性反應(yīng)，隨著年齡的增長，炎癥水平逐漸升高，過度的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[33]。研究表明，免疫衰老和炎癥可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細胞向更活躍的促炎癥狀態(tài)發(fā)展，從而促進神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致神經(jīng)保護功能喪失，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙和腦組織損傷累積[34]。
因此，調(diào)節(jié)免疫衰老和炎癥反應(yīng)是治療腦老化和神經(jīng)退行性疾病的重要靶標。通過對關(guān)鍵基因的KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，通路主要涉及細胞因子細胞因子受體相互作用、PI3KAkt信號通路、Rap1信號通路、趨化因子信號通路、Toll樣受體信號通路、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)通路等，進一步表明的腦老化的發(fā)生發(fā)展與免疫過程和炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。細胞因子是可溶性細胞外蛋白或糖蛋白，是細胞間重要的調(diào)節(jié)因子和動員因子，參與先天性和適應(yīng)性炎癥宿主防御、細胞生長、分化、細胞死亡、血管生成以及旨在恢復(fù)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的發(fā)育和修復(fù)過程[35]。
它們可以影響幾乎所有的生理系統(tǒng)，包括神經(jīng)內(nèi)分泌相互作用、神經(jīng)遞質(zhì)代謝和神經(jīng)可塑性，從而影響行為和認知功能。當小膠質(zhì)細胞持續(xù)激活和隨后促炎癥介質(zhì)的持續(xù)釋放，和氧化應(yīng)激的增加，活化的小膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)一氧化氮和促炎細胞因子，如ILβ、IL和腫瘤壞死因子(TNF)，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥[36]。以及隨著年齡的增長，功能失調(diào)的線粒體產(chǎn)生的活性氧和增加的NFκB信號增強了NLRP3炎癥體，隨后導(dǎo)致腦內(nèi)ILβ的釋放，導(dǎo)致衰老相關(guān)的慢性炎癥反應(yīng)[37]。
PI3KAkt信號通路涉及細胞增殖、新陳代謝、生長、分化、凋亡和其他生命現(xiàn)象的調(diào)節(jié)，可以通過調(diào)控細胞能量代謝感受器AMP激活蛋白激酶(AMPK)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和線粒體生物合成調(diào)控因子過氧化酶增殖因子活化受體γ共激活因子α(PGCα來調(diào)節(jié)大腦的能量代謝[38]。研究表明，激活PI3K/Akt信號通路可以改善老年癡呆癥小鼠的神經(jīng)炎癥反應(yīng)和認知障礙[39]。Rap1信號通路在細胞極性的形成、細胞增殖、分化和癌變、細胞黏附和運動等生物功能中起著至關(guān)重要的作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)Rap1信號通路的紊亂會促進癌癥的進展，Rap1的定位信號可能是控制癌癥轉(zhuǎn)移發(fā)展的方法[40]。
而對于神經(jīng)系統(tǒng)，Rap1信號可調(diào)控神經(jīng)極性建立、神經(jīng)突生長、突觸可塑性和神經(jīng)元遷移等，最新研究發(fā)現(xiàn)Rap1是壓力驅(qū)動神經(jīng)元和行為病理學(xué)的關(guān)鍵調(diào)解者，并突出了Rap1對前額皮質(zhì)功能障礙影響[41]。在產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)通路中，IgA抗體作為對抗微生物的第一道防線，分泌的IgA通過將食物抗原和微生物包埋在粘液中促進免疫排斥，起到中和毒素和病原微生物[42]、調(diào)節(jié)腸道微生物群的組成、并在維持腸道微生物群和宿主之間的靜態(tài)關(guān)系方面發(fā)揮作用[43]。
近年來“腸腦軸”的相互作用成為了研究熱點，腸道微生物群的年齡相關(guān)變化，特別是物種多樣性的減少，以及其它因素如腸道運動受損、腸道血屏障受損和免疫功能抑制，可能與年齡相關(guān)的神經(jīng)退化有關(guān)[44]。有研究表明，人類腦膜含有IgA分泌的血漿細胞，腦膜IgA細胞代表一個關(guān)鍵的免疫屏障，可以防止病原體蔓延到腦膜影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)[45]。以上這些信號通路和參與調(diào)節(jié)的細胞因子可能作為腦老化以及神經(jīng)退行性疾病預(yù)防及治療的潛在靶點，值得進一步研究。
醫(yī)學(xué)論文投稿刊物：《國際老年醫(yī)學(xué)》創(chuàng)刊于1980年，由吉林大學(xué)主辦。本刊為全國性正式期刊，屬于國家醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)類雜志。本刊遵循“洋為中用”以助我國老年醫(yī)學(xué)事業(yè)發(fā)展的宗旨，主要報道國外有關(guān)老年醫(yī)學(xué)的最新實用信息。以從事老年醫(yī)學(xué)的臨床、教學(xué)、科研工作者為對象。
4結(jié)論
通過對腦老化基因芯片的數(shù)據(jù)挖掘及生物信息學(xué)分析，篩選出PTPRC、ITGAM、TLR2等15個與腦老化關(guān)系密切的基因，發(fā)現(xiàn)炎癥過程、免疫反應(yīng)、PI3KAkt通路信號、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)通路等在腦老化過程中起著重要作用，顯示腦老化的發(fā)生發(fā)展是多因素共同作用的結(jié)果。而人參、三七、黃芪、丹參等中藥及其活性成分可能成為治療腦老化的新藥物，為后續(xù)腦老化分子機制及其藥物的研究提供潛在靶標，未來仍需進一步的實驗來驗證關(guān)鍵基因和中藥活性成分的潛在治療作用。基因芯片技術(shù)與生物信息學(xué)方法為中醫(yī)藥學(xué)帶來了新的契機，通過挖掘中藥潛在的治療靶點，為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究提供新思路。
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作者：吳丹，王雪，楊靜，吳燁，劉逸南，修成奎，王佳麗，劉奕清，雷燕
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