本文摘要：摘要通過生物信息學技術分析比較認知完好的老年人(60~99歲)與中青年人(20~59歲)腦部海馬組織(hippocampaltissue，HC)的基因芯片數(shù)據(jù)，初步篩選出差異表達基因，進而預測治療腦老化的潛在中藥藥物。從基因表達數(shù)據(jù)庫(GeneExpressionOmnibus，GEO)下載GSE11882
摘要通過生物信息學技術分析比較認知完好的老年人(60~99歲)與中青年人(20~59歲)腦部海馬組織(hippocampaltissue，HC)的基因芯片數(shù)據(jù)，初步篩選出差異表達基因，進而預測治療腦老化的潛在中藥藥物。從基因表達數(shù)據(jù)庫(GeneExpressionOmnibus，GEO)下載GSE11882基因芯片，基于R語言軟件篩選差異表達基因(differentiallyexpressedgenes,DEGs)，通過STRING數(shù)據(jù)庫、Cytoscape軟件及其插件分析得到差異表達基因的關鍵基因，對關鍵基因進行基因本體論(geneontology，GO)及京都基因與基因組百科全書(Kyotoencyclopediaofgenesandgnomes，KEGG)分析，通過關鍵基因與醫(yī)學本體信息檢索平臺(CoremineMedical)相互映射，篩選治療腦老化的中藥，并構建“藥物活性成分作用靶點”網絡。篩選出268個差異表達基因，包括246個下調基因和22個上調基因。差異表達基因共得出15個關鍵基因，關鍵基因主要參與白細胞遷移、中性粒細胞活化、細胞趨化運動、小膠質細胞活化、免疫效應過程的調節(jié)等生物過程。KEGG通路分析顯示關鍵基因主要富集于炎癥過程、免疫反應、細胞因子細胞因子受體相互作用、PI3KAkt信號通路、Rap1信號通路、趨化因子信號通路、Toll樣受體信號通路、產生IgA的腸道免疫網絡通路等。篩選得到治療腦老化的潛在中藥為三七、人參、丹參、黃芪等。差異表達基因和關鍵基因的分析促進了對腦老化機制的理解，該研究為腦老化中藥干預的新藥開發(fā)提供了潛在基因靶標與研發(fā)思路。
關鍵詞腦老化;生物信息學;差異表達基因;中藥預測
衰老是隨著年齡增加而緩慢出現(xiàn)、普遍發(fā)生的生物學過程[1]，大腦在衰老過程中主要表現(xiàn)為學習和記憶、注意力、決策速度、感官感知和運動協(xié)調能力的下降[2]。腦老化是大多數(shù)神經退行性疾病的主要危險因素，包括阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease)和帕金森病(Parkinson'sdisease)，其患病率隨著年齡的增長而不斷增加，與衰老相關的神經退行性疾病很少或沒有有效的治療方法，這些疾病往往以不可逆轉的方式進展，已成為日益嚴重的全球公共衛(wèi)生問題，給家庭和社會帶來了巨大的負擔[3]。
腦老化過程涉及多個復雜的分子途徑，機制尚未闡明，單個通路不足以解釋腦老化的發(fā)生、發(fā)展過程，而中醫(yī)藥多成分、多靶點、多途徑的特征，有利于緩解腦老化進程進而起到治療作用。因此，識別腦老化中特定、敏感和可靠的生物標志物和病理基因，挖掘潛在中藥治療，有利于衰老相關的神經退行性疾病的早期診斷與治療。故本研究基于基因表達數(shù)據(jù)庫(GeneExpressionOmnibusdatabase，GEO)數(shù)據(jù)庫中原始芯片數(shù)據(jù)，通過生物信息學的分析方法，初步篩選差異表達基因，進一步發(fā)掘關鍵基因，對關鍵基因的功能和通路進行富集分析，并將關鍵基因與中藥相互映射，得到潛在的治療靶點及藥物，為腦老化分子機制和治療藥物的新發(fā)現(xiàn)提供實驗研究的思路和理論依據(jù)。
1資料與方法
1.1數(shù)據(jù)提取從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載編號為GSE11882的基因片段原始數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)集包括24位認知完好的老年人(6099歲)與18位中青年(2059歲)死后腦部海馬組織(hippocampaltissue，HC)的基因芯片數(shù)據(jù)。該片段平臺為GPL570[HGU133_Plus_2]AffymetrixHumanGenomeU133Plus2.0Array。
1.2數(shù)據(jù)預處理
基于語言Bioconductor庫(http://www.bioconductor.org/)相關包對表達譜芯片進行數(shù)據(jù)預處理，通過“GEOquery”包[4]從GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE11882，去除掉個探針對應多個分子的探針，當遇到對應同一個分子的探針時，僅保留信號值最大的探針，過濾后的數(shù)據(jù)通過箱式圖查看樣本標準化的情況，通過主成分分析(principalcomponentsanalysis，PCA)圖以及統(tǒng)一流形逼近與投影(uniformmanifoldapproximationandprojection，UMAP)圖查看樣本分組間聚類情況。
1.3差異基因
差異表達基因的篩選通過語言“limmar”包[5]對芯片表達譜中每個探針進行檢驗和貝葉斯檢驗，差異表達基因以|log(foldchange)|>和調整的<0.05為篩選標準，來定義差異表達探針，負數(shù)代表下調，正數(shù)代表上調，通過GPL570平臺將探針轉換成基因名稱，利用語言制作差異表達基因的熱圖和火山圖[6]。
1.4關鍵基因及功能注釋
將差異表達基因(differentiallyexpressedgenes,DEGs)導入在線分析工具STRING11.0(https://stringdb.org/)，分別通過Cytoscape3.7.1軟件的CytoHubba插件、MCODE插件進行蛋白質相互作用(proteinproteininteraction，PPI)分析篩選標準：有效結合分數(shù)>0.4)、網絡分析(CytoHubba根據(jù)nodes在網絡中的屬性進行排名，高degree的蛋白更傾向于是關鍵蛋白，因此以degree對節(jié)點進行排名、模塊分析篩選標準：degree=2,nodescore=0.2,core=2,max.Depth=100)等種方式綜合篩選關鍵基因(hubgene)。
接著對關鍵基因進行注釋，包括基因本體論(geneontology，GO)及京都基因與基因組百科全書(Kyotoencyclopediaofgenesandgnomes，KEGG)分析，GO分析劃分為生物學過程(biologicalrocess,BP)、分子功能(molecularfunction,MF)、細胞組件(cellularcomponent,CC)個方面。通過軟件“clusterProfiler”包[7]和“ggplot2”包[8]進行GO和KEGG富集分析和可視化。
1.5關鍵靶點對接及中藥預測
將篩選出的關鍵基因與CoremineMedical(http://www.coremine.com/)相互映射，篩選出關鍵基因相關的中藥，<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。根據(jù)中藥預測結果，從TCMSP(TraditionalChineseMedicineSystemspharmacology)數(shù)據(jù)庫篩選其活性成分(口服生物利用度≥30%，類藥性≥0.18)，并獲得上述活性成分的靶點信息，使用蛋白質數(shù)據(jù)庫UniProt(http://www.uniprot.org/uploadlists/)將其轉換為統(tǒng)一基因名稱。基于CytoHubba進行網絡分析，通過MCC方法篩選排列前20的靶點并通過Cytoscape展示結果。
2結果
2.1數(shù)據(jù)預處理
箱式圖結果顯示各個樣本中位數(shù)基本在一個水平線上，說明樣本間歸一化程度好。PCA圖和UMAP圖樣本聚類情況顯示當各組的樣本分開，分組間差異明顯，說明后續(xù)差異分析有意義的結果可能會比較多。過濾后最終匯總獲取21655個基因表達水平數(shù)據(jù)。
2.2差異基因
基于GSE11882的基因片段原始數(shù)據(jù)，滿足|log(foldchange)|>和調整的<0.05標準的差異基因有268個，其中包括246個下調基因和22個上調基因;下調和上調最顯著的40個基因見2.3關鍵基因及功能注釋對268個差異基因進行關鍵基因的篩選。
首先，在STRING數(shù)據(jù)庫進行PPI分析，設置置信度>0.4，并下載相關TSV格式文件，得到PPI關系對文件;接著，使用Cytoscape軟件的插件CytoHubba對其進一步分析，以發(fā)現(xiàn)復雜網絡的關鍵目標和子網絡;然后使用ytoscape軟件的MCODE插件對其進行模塊分析。結果顯示，差異基因CytoHubba分析后依據(jù)degree定義前15個關鍵基因，MCODE分析后得到所得功能模塊最大者由34個節(jié)點，334條邊組成，score為20.242，該模塊即為PPI網絡中緊密聯(lián)系的區(qū)域。分析差異表達基因后，構建了15個關鍵基因的PPI網絡。
2.4關鍵靶點對接及中藥預測
將關鍵基因映射到CoremineMedical數(shù)據(jù)庫，篩選治療腦老化的潛在中藥(<0.05)，得到人參、三七、黃芪、丹參等多味中藥，其中人參和三七味中藥具有益氣活血之功效，三七是PTPRC、TYROBP、VEGFA等多個關鍵基因映射的中藥。多項研究表明，人參具有抗衰老[913]以及改善認知障礙和保護神經的作用[1419]，兩者可能作為分子治療藥物的潛在來源，故篩選上述味中藥構建“藥物活性成分作用靶點”網絡。
基于CytoHubba插件通過MCC方法篩選排列前20的靶點，并以不同色階進行展示。人參和三七的藥物活性成分參與調控PTGS1、PTGS2、核受體輔激活蛋白(NCOA2)、類視黃醇受體(RXRA)、β腎上腺素能受體(ADRB2)、心臟鈉通道基因(SCN5A)等關鍵基因，可能成為治療腦老化的潛在中藥。
3討論
研究表明，衰老是大多數(shù)神經退行性疾病的主要危險因素，它們與衰老的個生物學特征的關系如下：基因組不穩(wěn)定性、端粒磨損、表觀遺傳改變、蛋白質穩(wěn)定性喪失、線粒體功能障礙、細胞衰老、營養(yǎng)物質傳感失調、細胞凋亡、干細胞衰竭和細胞間通訊的改變[3]。其中基因表達水平的改變在腦老化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，有助于解釋沒有嚴重的組織病理學變化下的輕度認知衰退[20]。
盡管對于阿爾茨海默病等認知深度衰退條件下的基因表達變化開展了許多研究[2123]，但對于認知完好的人類大腦在正常成年壽命中發(fā)生的基因組變化卻知之甚少。相關網絡和差異表達生物信息學分析已應用于許多疾病，揭示了復雜的發(fā)病機制和新的生物標志物的診斷和治療[2425]。通過對芯片的挖掘分析，可以更好地研究腦老化的中心生物學機制，進而發(fā)現(xiàn)治療神經退行性疾病的新靶點和新藥物。
3.1差異表達基因的功能與炎癥免疫的信號通路密切相關
本研究提取芯片GSE11882，通過生物信息學方法分析，篩選差異表達基因268個，其中包括246個下調基因和22個上調基因，然后繼續(xù)篩選出15個關鍵基因。為了明確關鍵基因之間的相互作用關系，MCODE分析后得到功能模塊最大者由34個節(jié)點，334條邊組成，提取PPI網絡中連接最為緊密且位于重要節(jié)點位置的15個基因，分別是PTPRC、ITGAM、TLR2、TYROBP、CD86、ITGB2、CSF1R、C3AR1、VEGFA、CCR1、CCL4、CCL2、FCER1G、LCP2、CXCR4。其中，PTPRC和ITGAM發(fā)揮核心作用，PTPRC(又稱CD45，白細胞共同抗原)是最豐富的跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶，在所有有核造血細胞上均有表達，在調節(jié)免疫應答中發(fā)揮重要作用[26]。
研究表明，PTPRC基因缺失會加速腦淀粉樣變，導致促炎和抗β吞噬的小膠質細胞活化[27]。ITGAM參與單核細胞、巨噬細胞和粒細胞的各種粘附相互作用，以及介導補體包被顆粒和病原體的攝取[28]。在小膠質細胞中需要酪氨酸BP/DAP12來控制小膠質細胞超氧化物離子的產生，這些離子促進腦發(fā)育過程中發(fā)生的神經元凋亡[29]。研究表明，ITGAM作為微膠質基因在神經退化和大腦老化中起著重要作用[30]。GO分析表明關鍵基因參與的主要生物學過程為白細胞遷移、細胞趨化運動、小膠質細胞活化、神經炎癥反應、免疫效應過程的調節(jié)等。在腦老化的發(fā)展和進程中，炎癥老化和免疫衰老，這是生物老化的個特征[31]。
在成長過程中，免疫系統(tǒng)對塑造大腦至關重要，神經系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)都會隨著年齡的增長而變化[32]，而炎癥是機體對任何損傷的基本保護性反應，隨著年齡的增長，炎癥水平逐漸升高，過度的炎癥反應會導致神經元損傷[33]。研究表明，免疫衰老和炎癥可能通過調節(jié)神經膠質細胞向更活躍的促炎癥狀態(tài)發(fā)展，從而促進神經炎癥，導致神經保護功能喪失，導致神經功能障礙和腦組織損傷累積[34]。
因此，調節(jié)免疫衰老和炎癥反應是治療腦老化和神經退行性疾病的重要靶標。通過對關鍵基因的KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，通路主要涉及細胞因子細胞因子受體相互作用、PI3KAkt信號通路、Rap1信號通路、趨化因子信號通路、Toll樣受體信號通路、產生IgA的腸道免疫網絡通路等，進一步表明的腦老化的發(fā)生發(fā)展與免疫過程和炎癥反應關系密切。細胞因子是可溶性細胞外蛋白或糖蛋白，是細胞間重要的調節(jié)因子和動員因子，參與先天性和適應性炎癥宿主防御、細胞生長、分化、細胞死亡、血管生成以及旨在恢復內穩(wěn)態(tài)的發(fā)育和修復過程[35]。
它們可以影響幾乎所有的生理系統(tǒng)，包括神經內分泌相互作用、神經遞質代謝和神經可塑性，從而影響行為和認知功能。當小膠質細胞持續(xù)激活和隨后促炎癥介質的持續(xù)釋放，和氧化應激的增加，活化的小膠質細胞誘導一氧化氮和促炎細胞因子，如ILβ、IL和腫瘤壞死因子(TNF)，導致神經炎癥[36]。以及隨著年齡的增長，功能失調的線粒體產生的活性氧和增加的NFκB信號增強了NLRP3炎癥體，隨后導致腦內ILβ的釋放，導致衰老相關的慢性炎癥反應[37]。
PI3KAkt信號通路涉及細胞增殖、新陳代謝、生長、分化、凋亡和其他生命現(xiàn)象的調節(jié)，可以通過調控細胞能量代謝感受器AMP激活蛋白激酶(AMPK)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和線粒體生物合成調控因子過氧化酶增殖因子活化受體γ共激活因子α(PGCα來調節(jié)大腦的能量代謝[38]。研究表明，激活PI3K/Akt信號通路可以改善老年癡呆癥小鼠的神經炎癥反應和認知障礙[39]。Rap1信號通路在細胞極性的形成、細胞增殖、分化和癌變、細胞黏附和運動等生物功能中起著至關重要的作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)Rap1信號通路的紊亂會促進癌癥的進展，Rap1的定位信號可能是控制癌癥轉移發(fā)展的方法[40]。
而對于神經系統(tǒng)，Rap1信號可調控神經極性建立、神經突生長、突觸可塑性和神經元遷移等，最新研究發(fā)現(xiàn)Rap1是壓力驅動神經元和行為病理學的關鍵調解者，并突出了Rap1對前額皮質功能障礙影響[41]。在產生IgA的腸道免疫網絡通路中，IgA抗體作為對抗微生物的第一道防線，分泌的IgA通過將食物抗原和微生物包埋在粘液中促進免疫排斥，起到中和毒素和病原微生物[42]、調節(jié)腸道微生物群的組成、并在維持腸道微生物群和宿主之間的靜態(tài)關系方面發(fā)揮作用[43]。
近年來“腸腦軸”的相互作用成為了研究熱點，腸道微生物群的年齡相關變化，特別是物種多樣性的減少，以及其它因素如腸道運動受損、腸道血屏障受損和免疫功能抑制，可能與年齡相關的神經退化有關[44]。有研究表明，人類腦膜含有IgA分泌的血漿細胞，腦膜IgA細胞代表一個關鍵的免疫屏障，可以防止病原體蔓延到腦膜影響中樞神經系統(tǒng)[45]。以上這些信號通路和參與調節(jié)的細胞因子可能作為腦老化以及神經退行性疾病預防及治療的潛在靶點，值得進一步研究。
醫(yī)學論文投稿刊物：《國際老年醫(yī)學》創(chuàng)刊于1980年，由吉林大學主辦。本刊為全國性正式期刊，屬于國家醫(yī)學學術類雜志。本刊遵循“洋為中用”以助我國老年醫(yī)學事業(yè)發(fā)展的宗旨，主要報道國外有關老年醫(yī)學的最新實用信息。以從事老年醫(yī)學的臨床、教學、科研工作者為對象。
4結論
通過對腦老化基因芯片的數(shù)據(jù)挖掘及生物信息學分析，篩選出PTPRC、ITGAM、TLR2等15個與腦老化關系密切的基因，發(fā)現(xiàn)炎癥過程、免疫反應、PI3KAkt通路信號、產生IgA的腸道免疫網絡通路等在腦老化過程中起著重要作用，顯示腦老化的發(fā)生發(fā)展是多因素共同作用的結果。而人參、三七、黃芪、丹參等中藥及其活性成分可能成為治療腦老化的新藥物，為后續(xù)腦老化分子機制及其藥物的研究提供潛在靶標，未來仍需進一步的實驗來驗證關鍵基因和中藥活性成分的潛在治療作用�；蛐酒夹g與生物信息學方法為中醫(yī)藥學帶來了新的契機，通過挖掘中藥潛在的治療靶點，為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究提供新思路。
參考文獻
[1]何琪楊，劉光慧，保志軍，等.中國衰老與抗衰老專家共識(2019年)[J].老年醫(yī)學與保健，2019，25()：551.
[2]MATTSONMP,ARUMUGAMTV.Hallmarksofbrainaging:adaptiveandpathologicalmodificationbymetabolicstates[J].CellMetab,2018,27(6):1176.
[3]HOUY,DANX,BABBARM,etal.Ageingasariskfactorforneurodegenerativedisease[J].NatRevNeurol,2019,15(10):565.
[4]DAVISS,MELTZERPS.GEOquery:abridgebetweentheGeneExpressionOmnibus(GEO)andBioConductor[J].Bioinformatics,2007,23(14):1846
[5]SMYTHGK.limma:linearmodelsformicroarraydata[M]NewYork:Springer,2005:397.
[6]GUZ,EILSR,SCHLESNERM.Complexheatmapsrevealpatternsandcorrelationsinmultidimensionalgenomicdata[J].Bioinformatics,2016,32(18):2847.
[7]YUG,WANGL,HANY,etal.clusterProfiler:anRpackageforcomparingbiologicalthemesamonggeneclusters[J].Omics,2012,16(5):284.
作者：吳丹，王雪，楊靜，吳燁，劉逸南，修成奎，王佳麗，劉奕清，雷燕
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