高效液相色譜測(cè)定全蝎中多西環(huán)素的含量

　　[摘要]目的：測(cè)定不同產(chǎn)地全蝎中多西環(huán)素的含量，研究該動(dòng)物藥材養(yǎng)殖過(guò)程中抗生素的使用情況。方法：使用高效液相色譜法，色譜柱為AgilentC18(柱長(zhǎng)250mm，柱內(nèi)直徑4.6mm,填料顆粒直徑5μm);流動(dòng)相為醋酸銨溶液[0.15mol/L醋酸銨溶液0.01mol/L乙二胺四醋酸二鈉溶液-三乙胺(100:10:1)，用醋酸調(diào)節(jié)pH值至8.5]-乙腈(83:17);流速1.0ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm;柱溫40℃;進(jìn)樣量10μl;共測(cè)定6個(gè)產(chǎn)地10批樣品。結(jié)果：10批樣品中，來(lái)自產(chǎn)地A的4批多西環(huán)素含量最高，為2.111-2.364mg/g;其次為產(chǎn)地D的1批，含量0.873mg/g，其余B、C、E、F等地的5批無(wú)明顯差異，含量在0.003-0.013mg/g之間。結(jié)論：本研究所用方法快速、準(zhǔn)確、高效，為研究全蝎飼養(yǎng)中的抗生素添加提供了技術(shù)支持。

　　[關(guān)鍵詞]全蝎;高效液相色譜;多西環(huán)素

　　全蝎為《中國(guó)藥典》收載的動(dòng)物來(lái)源名貴藥材，由于飼養(yǎng)環(huán)境特殊，為避免發(fā)生大規(guī)模病害、感染導(dǎo)致嚴(yán)重?fù)p失，部分養(yǎng)殖戶可能在飼料中添加抗生素[1-4]。動(dòng)物食用含抗生素的飼料后，體內(nèi)殘留的藥物難以通過(guò)自然或人工方法清除，進(jìn)而造成服用(包括外用)含全蝎類中藥方劑的患者體內(nèi)抗生素累積，影響患者身體健康。因此，目前對(duì)動(dòng)物類藥物、食品的質(zhì)量控制研究中，常加入抗生素限量檢查[5]。

　　四環(huán)素類為廣譜強(qiáng)效抗生素，文獻(xiàn)報(bào)道顯示，多種動(dòng)物來(lái)源的藥材、食品中，曾檢出過(guò)上述藥物。多西環(huán)素在四環(huán)素類抗生素中抗菌能力強(qiáng)，抗菌譜廣，且較少報(bào)道過(guò)檢出，因此具備一定的添加風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。本研究擬收集多個(gè)產(chǎn)地多批全蝎樣本，測(cè)定其中多西環(huán)素的含量，以研究該藥物在動(dòng)物來(lái)源藥材飼養(yǎng)過(guò)程中的使用情況[8]。

　　1儀器和試藥

　　1.1儀器Agilent1200高效液相色譜儀，配備DAD檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，四元高壓泵和柱溫箱(美國(guó)Agilent公司);Mettler-Toledo電子天平(瑞士MettlerToledo公司);ZW-800D全封閉智能勻漿儀(溫州維 科生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);VM-D旋渦混合器(上海舍巖儀器有限公司);Eppendorf5506低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)。

　　1.2試劑、試藥和材料多西環(huán)素對(duì)照品(批號(hào)：130485-201703)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;樣品處理用乙醇為分析純，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠;色譜分析用乙腈、乙酸銨、三乙胺等為色譜純，購(gòu)自Sig‐ma-Alderich;實(shí)驗(yàn)用水為Watsons純凈水;全蝎藥材購(gòu)自各地中藥店，采取匿名隨機(jī)編碼，產(chǎn)地編為A、B、C、D、E、F，每個(gè)產(chǎn)地所取批次分別編為001、002，以此類推。

　　2方法和結(jié)果

　　2.1對(duì)照品配制取多西環(huán)素對(duì)照品，精密稱取約5mg，置于5ml量瓶中，用50%乙醇溶液溶解后，繼續(xù)加50%乙醇定容至刻度，即得每ml含多西環(huán)素1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

　　2.2供試品溶液制備取全蝎樣本2g，精密稱定，加0.01mol/L乙二胺四醋酸二鈉溶液勻漿后，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，再加入該溶液定容至10ml;吸取上述溶液1ml，置于另一10ml量瓶中，加50%乙醇稀釋并定容至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

　　2.3含量測(cè)定方法色譜柱為AgilentC18(柱長(zhǎng)250mm，柱內(nèi)直徑4.6mm,填料顆粒直徑5μm);流動(dòng)相為醋酸銨溶液[0.15mol/L醋酸銨溶液-0.01mol/L乙二胺四醋酸二鈉溶液-三乙胺(100:10:1),用醋酸調(diào)節(jié)pH值至8.5]-乙腈(83:17);流速1.0ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm;柱溫40℃;進(jìn)樣量10μl。

　　2.4方法學(xué)考察

　　2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性

　　取多西環(huán)素對(duì)照品溶液，精密吸取適量，置于多個(gè)5ml量瓶中，分別配制成濃度為1、5、10、20、50、100、200μg/ml的對(duì)照品溶液。吸取上述溶液，使用“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄多西環(huán)素峰面積，進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程為y=11.995x+3.7306(x為多西環(huán)素濃度，y為峰面積，r=0.99990)。結(jié)果表明方法所測(cè)結(jié)果在1-200μg/ml的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，能夠準(zhǔn)確測(cè)定供試品中多西環(huán)素的含量。

　　2.4.2精密度實(shí)驗(yàn)

　　取供試品溶液，連續(xù)按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定6次，記錄多西環(huán)素峰面積，計(jì)算峰面積的RSD，結(jié)果顯示，多西環(huán)素峰面積的RSD為0.69%，參考現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，符合相關(guān)規(guī)定，表明方法精密度良好。

　　2.4.3重復(fù)性考察

　　取全蝎樣品(均來(lái)自產(chǎn)地A)，按“2.2”項(xiàng)下方法平行配制6份供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄多西環(huán)素峰面積，計(jì)算含量和含量的RSD，結(jié)果顯示，多西環(huán)素含量的RSD為1.10%，參考現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，符合相關(guān)規(guī)定，表明方法重復(fù)性良好。

　　2.4.4穩(wěn)定性考察

　　取供試品溶液，置于自動(dòng)進(jìn)樣器中，分別在放置后0、2、4、6、8、12小時(shí)按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄多西環(huán)素峰面積，計(jì)算含量和含量的RSD，結(jié)果顯示，多西環(huán)素含量的RSD為1.00%，參考現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，符合相關(guān)規(guī)定，表明方法所制備樣品在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

　　2.4.5回收率試驗(yàn)

　　取全蝎樣品(產(chǎn)地A)1g，精密加入多西環(huán)素對(duì)照品溶液適量，平行配制6份溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄多西環(huán)素峰面積，計(jì)算含量、回收率和回收率的RSD，結(jié)果顯示，多西環(huán)素平均回收率為97.67%，RSD為1.76%，參考現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，符合相關(guān)規(guī)定，表明方法準(zhǔn)確度良好。

　　2.5不同產(chǎn)地全蝎多西環(huán)素含量測(cè)定

　　取全蝎樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄多西環(huán)素峰面積，計(jì)算含量。10批樣品中，來(lái)自產(chǎn)地A的4批多西環(huán)素含量最高，為2.111-2.364mg/g;其次為產(chǎn)地D的1批，含量0.873mg/g，其余B、C、E、F等地的5批無(wú)明顯差異，含量在0.003-0.013mg/g之間。

　　3討論

　　由不同產(chǎn)地多批次樣品測(cè)定結(jié)果可知，全蝎在飼養(yǎng)過(guò)程中，不同程度存在抗生素添加。本研究所用方法雖然能夠準(zhǔn)確測(cè)定全蝎中添加的多西環(huán)素，但由于抗生素類藥物種類繁多，很難在預(yù)先不了解藥物添加種類的情況下，有針對(duì)性地進(jìn)行相關(guān)檢查和研究。為避免上述問(wèn)題的出現(xiàn)，除繼續(xù)加強(qiáng)信息收集和用藥情況反饋外，可以使用更為精密和高靈敏度的儀器，如飛行時(shí)間質(zhì)譜，通過(guò)將測(cè)定結(jié)果與化合物數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行比對(duì)和篩選，提高檢測(cè)和限度檢查的準(zhǔn)確性。

　　參考文獻(xiàn)：

　　[1]楊志欣,汲麗麗,劉慧,卞士嘉,許貴軍,呂邵娃.全蝎化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展[J].中南藥學(xué),2020,18(09):1523-1529.

　　[2]陳麗媛,王燕,王恬.飼料中添加不同成分抗生素替代品對(duì)肉雞生產(chǎn)性能和腸道健康的影響[J].飼料博覽,2020(02):1-5+9.

　　[3]余寧爾.漁業(yè)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素和汞的絡(luò)合對(duì)汞形態(tài)變化的影響研究[D].浙江農(nóng)林大學(xué),2019.

　　[4]郭宏山.抗生素飼料添加劑在畜牧業(yè)生產(chǎn)中過(guò)度使用的危害及對(duì)策[J].南方農(nóng)機(jī),2019,50(02):73.

　　[5]周水清.Q-Orbitrap高分辨質(zhì)譜用于檢測(cè)中成藥中非法添加的抗生素類和激素類藥物[D].山東大學(xué),2017.

　　作者：曾鳴

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