本文摘要：摘要：目的基于成分反映活性，活性指向功效的中藥質(zhì)量控制研究思路，建立用于柴胡Bupleurumchinense等級評價的二分類Logistic模型，并開發(fā)出一種柴胡等級評價計算器。方法采用二分類Logistic算法將柴胡的柴胡皂苷a、d含量、環(huán)氧化酶2(COX2)生物效價、ABTS+清除率、DPPH
摘要：目的基于“成分反映活性，活性指向功效”的中藥質(zhì)量控制研究思路，建立用于柴胡Bupleurumchinense等級評價的二分類Logistic模型，并開發(fā)出一種柴胡等級評價計算器。方法采用二分類Logistic算法將柴胡的柴胡皂苷a、d含量、環(huán)氧化酶2(COX2)生物效價、ABTS+清除率、DPPH∙清除率和羥自由基清除能力等指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，建立用于柴胡的等級預(yù)測模型，并進(jìn)行驗證。采用多元回歸分析方法、二分類Logistic回歸模型結(jié)合柴胡成分藥效相關(guān)數(shù)據(jù)，建立等級評價方程。采用JavaScript和CSS3技術(shù)，將等級評價方程嵌入HTML進(jìn)行計算器插件的開發(fā)。結(jié)果Logistic預(yù)測模型概率公式初步將15個產(chǎn)地來源柴胡最終分為優(yōu)、良、中、差4級，各批次所對應(yīng)的預(yù)測歸屬等級明確，擬合概率P值均大于90%。開發(fā)了一種無需將數(shù)據(jù)傳給服務(wù)器端，通過動態(tài)地輸入測定的數(shù)據(jù)，可直接輸出柴胡等級評價結(jié)果的計算器。結(jié)論首次將柴胡功效成分相結(jié)合，建立評價柴胡質(zhì)量等級的方法，可為柴胡質(zhì)量評價提供重要依據(jù);并開發(fā)出一種基于“藥效成分”相關(guān)聯(lián)的柴胡質(zhì)量等級快速評價的計算器插件。
關(guān)鍵詞：柴胡;藥效論質(zhì);等級評價;中藥;質(zhì)量控制;主成分分析;Logistic算法;計算器;柴胡皂苷;環(huán)氧化酶2;生物效價;ABTS+;DPPH∙;羥自由基;多元回歸分析
柴胡BupleuriRadix(BR)為傘形科柴胡屬植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根[1]，按性狀不同，分別習(xí)稱“北柴胡”和“南柴胡”。柴胡具有解熱、保肝、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗抑郁等多種藥理活性[2]。藥用植物資源豐富、分布廣，臨床應(yīng)用常以北柴胡為主，且長期以來在民間傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中用作消炎藥、解熱藥和鎮(zhèn)痛藥[3]。主要分布于我國東北、華北、西北、華東和華中各地。目前，柴胡質(zhì)量控制主要參考《中國藥典》2020年版，以單一成分柴胡皂苷a、d含量作為主要質(zhì)控指標(biāo)。其混淆品小葉黑柴胡的柴胡皂苷a、d含量也符合《中國藥典》2020年版[4]。
因此，單一成分并不能全面地反映藥材內(nèi)在質(zhì)量，且中藥的化學(xué)物質(zhì)實體與生命體分子網(wǎng)絡(luò)的交互作用具有模糊性、難以定量等特點[5]。故需要根據(jù)成分與藥效間多維度、多層次的相互作用對柴胡質(zhì)量進(jìn)行全方位評價。 目前，柴胡只有選貨和統(tǒng)貨的區(qū)別，隨著野生資源的減少，藥材市場上以栽培品為主，造成品種混亂，質(zhì)量參差不齊，無明確區(qū)分柴胡質(zhì)量等級的方法，若以柴胡皂苷a、d含量高低對市場上的柴胡進(jìn)行分類可能具有一定的片面性，故將柴胡主要活性成分及藥效作為評價指標(biāo)，其中柴胡皂苷a、d質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，具有良好的抗炎活性[68]。
已有研究表明[9]環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)是柴胡抗炎作用機(jī)制之一，它是花生四烯酸代謝和多種炎癥介質(zhì)(前列腺素和血栓素A2)生物合成過程中重要的限速酶之一，具有2種亞型即COX1和COX2。COX1是機(jī)體固有的酶，在正常情況下存在于胃腸道、腎臟和血小板等組織細(xì)胞，不能被誘導(dǎo)增加，通過促進(jìn)前列腺素及血栓烷A2的合成，發(fā)揮保護(hù)胃黏膜、維持腎血流量、調(diào)節(jié)血小板聚集、外周血管張力等內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。
而大多數(shù)細(xì)胞中不出現(xiàn)COX2，可在生長因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞毒素、致炎物質(zhì)等刺激下表達(dá)，產(chǎn)生的底物前列腺素可引起炎癥、疼痛、發(fā)熱反應(yīng)，這與柴胡傳統(tǒng)應(yīng)用于抗炎解熱的作用相符合[10]。因此，通過測定對COX2的抑制作用，可用于評價柴胡抗炎活性。除此之外，柴胡在抗氧化方面具有較強(qiáng)的藥理作用[1112]。研究表明，氧化應(yīng)激和炎癥被認(rèn)為是各種疾病病理的核心機(jī)制，持續(xù)活躍的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致活性氧的過度產(chǎn)生，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，使細(xì)胞受到氧化損傷，同時產(chǎn)生炎癥。
因此，將氧化應(yīng)激和炎癥與柴胡成分結(jié)合用于綜合評價柴胡質(zhì)量，具有高度的代表性。故本研究對不同批次柴胡中的柴胡皂苷a、d含量及COX2的生物效價和抗氧化效果進(jìn)行測定[13]，通過Logistic算法建立模型并進(jìn)行驗證。本課題組前期對相關(guān)藥材等級評價[1415]積累了豐富經(jīng)驗，建立了以“成分體外效價等級品質(zhì)”網(wǎng)絡(luò)為反映體系的分級體制[1718]，可對不同產(chǎn)地來源的柴胡進(jìn)行等級分類，為柴胡質(zhì)量評價研究提供依據(jù);并開發(fā)出一種柴胡質(zhì)量等級快速評價的計算器插件，為拓寬中藥質(zhì)量等級快速評價方法提供參考。
1儀器與試藥
1.1儀器Agilent1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司;FW400AD型高速萬能粉碎機(jī)，天津鑫博得儀器有限公司;KQ300DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;MultskanGo酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾公司;SartoriusCPA225D十萬分之一電子天平，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。
1.2材料對照品柴胡皂苷a(批號110777201912，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、柴胡皂苷d(批號110778201912，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)，購自中國食品藥品檢定研究院;總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS法)、羥自由基(OH·)測試試劑盒、DPPH自由基(DPPH·)清除能力試劑盒，購自南京建成生物工程研究所;環(huán)氧化酶2(COX2)抑制劑篩選試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。柴胡主要收集于陜西省，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)白吉慶副教授鑒定為傘形科植物柴胡B.chinenseDC.的干燥根。
2方法與結(jié)果
2.1溶液的制備
2.1.1供試品溶液的制備[1]將藥材粉碎，過四號篩，精密稱定0.50g藥粉，加入含有5%濃氨水的甲醇溶液25mL，超聲30min，濾過，濾液用25mL甲醇洗滌藥渣2次，合并濾液，蒸干，殘渣用甲醇溶解，定容至5mL量瓶中，即得。
2.1.2對照品溶液的制備精密稱定柴胡皂苷a或d適量，加甲醇溶解，分別制成含1.03mg/mL柴胡皂苷a及1.08mg/mL柴胡皂苷d的溶液，即得。
2.2色譜條件色譜柱為Agilent5TCC18柱(250mm×4.6mm，5μm);流動相為水乙腈，梯度洗脫：0～50 min，25%～90%乙腈;50～55min，90%乙腈;55～57min，90%～25%乙腈;進(jìn)樣體積10μL;體積流量1mL/min;柱溫30℃;檢測波長210nm。
2.3方法學(xué)考察
2.3.1線性關(guān)系考察
分別精密移取“2.1.2”項下柴胡皂苷a、d的對照品溶液，稀釋成2、4、8、16、32倍，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸分析。所得柴胡皂苷a回歸方程為Y=2702X+105.2，r=0.9999，表明線性關(guān)系良好，線性范圍0.032～1.030mg/mL;柴胡皂苷d回歸方程為Y=3020X+63.75，r=0.9998，表明線性關(guān)系良好，線性范圍0.033～1.080mg/mL。
2.3.2精密度考察
吸取“2.1.2”項下對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)測定6次，結(jié)果顯示柴胡皂苷a、d峰面積RSD分別為0.22%、0.63%，表明該儀器精密度良好。
2.3.3穩(wěn)定性考察
按“2.1.”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、4、8、12、16、24h時，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，結(jié)果顯示間隔進(jìn)樣所測得柴胡皂苷a、d峰面積的RSD分別為2.00%、2.94%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好2.3.4重復(fù)性考察按“2.1.”項下方法制備份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示柴胡皂苷a、d峰面積的RSD分別為1.46%、2.31%，表明方法重復(fù)性良好。
2.3.5加樣回收率考察
取柴胡皂苷a、d含有量已知的同一批樣品(S2)約1g，稱取6份，精密稱定，分別加入與樣品中柴胡皂苷a、d含量相等的對照品，再按照“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計算加樣回收率。測得柴胡皂苷a、d的平均加樣回收率分別為98.90%、100.17%，RSD分別為2.35%、2.27%，表明回收率良好。
2.4含量測定
各批次柴胡，按“2.1.1”項下制樣方法平行制備3份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣，計算柴胡皂苷a、d的含量。各批次柴胡中柴胡皂苷a、d的含量。除S15批次柴胡外，其他所有批次柴胡皂苷a、d含量均符合《中國藥典》2020年版的規(guī)定。
2.5柴胡抑制COX2活性評價
2.5.1對照品溶液的制備
精密移取COX2試劑盒中塞來昔布適量，加COX2試劑盒中緩沖液溶解，用緩沖液將陽性對照品塞來昔布稀釋成6.25、12.5、25、50、100nmol/L的溶液作為對照品溶液。
3小結(jié)
3.1柴胡等級劃分與性狀指標(biāo)的關(guān)系
柴胡作為臨床常用中藥材，具有較高的藥用價值，但目前記載的柴胡道地產(chǎn)區(qū)過多、沒有科學(xué)指導(dǎo)下培育的移栽品、次品與偽品充之都將造成柴胡藥材市場上品種混亂，導(dǎo)致質(zhì)量參差不齊，在性狀上難以分辨真?zhèn)�。傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別方法是藥材鑒別的精髓，方法雖好，但需要專業(yè)型人才，而且藥材品種繁多，形態(tài)各異，尤其藥材經(jīng)炮制加工后改變其形狀、性味，使藥材更加難以鑒別。
因此單純的依靠傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒定藥材真?zhèn)�、確定優(yōu)劣顯然是不夠可靠。故本實驗利用PCA對復(fù)雜信息中的多變量進(jìn)行快速提取、重新組合、數(shù)學(xué)降維，生成新的綜合變量即主成分，經(jīng)投影處理后，樣本最終落在主成分組成平面上的位置，即可表征不同樣本的總體信息。通過Logistic進(jìn)行分析，尋找規(guī)律建立數(shù)學(xué)模型，進(jìn)而綜合評價藥材質(zhì)量。多變量大數(shù)據(jù)集無疑會為研究和應(yīng)用提供豐富的信息，把現(xiàn)代科學(xué)和實踐經(jīng)驗加以結(jié)合，一定能更好地判斷藥材的優(yōu)劣，彌補(bǔ)傳統(tǒng)經(jīng)驗之不足，保證臨床用藥安全有效。
3.2柴胡等級劃分與生物活性的關(guān)系
質(zhì)量直接影響中醫(yī)臨床療效，故應(yīng)以“因效而異”為原則對柴胡質(zhì)量進(jìn)行評價。但對于柴胡活性成分藥效差異的研究相對較少[2325]。目前，藥物主要成分與活性相結(jié)合的研究已成為評價藥物品質(zhì)的方法之一，故本實驗將柴胡成分藥效相關(guān)聯(lián)。用于柴胡等級評價。
通過柴胡對COX2的生物效價研究結(jié)果顯示，各批次柴胡樣品間抗環(huán)氧化酶活性差異較大，柴胡質(zhì)量濃度在3.125～25mg/mL對COX2抑制作用具有明顯的量效關(guān)系，建議增加柴胡抗環(huán)氧化酶活性作為柴胡質(zhì)量的區(qū)別要點。Logistic模型回歸對所得預(yù)測模型準(zhǔn)確性進(jìn)行了考察，等級歸屬和各個等級間參數(shù)范圍明確，結(jié)果表明預(yù)測能力良好。本研究首次將柴胡中相關(guān)有效成分含量與體外效價相關(guān)聯(lián)，建立柴胡等級分類體系，具有一定應(yīng)用價值。同時也存在一定局限性：樣本量少，柴胡樣本量僅限于柴胡道地產(chǎn)區(qū)陜西境內(nèi);為進(jìn)一步完善柴胡等級研究，后續(xù)將擴(kuò)大樣本來源。
3.3藥材等級計算器開發(fā)
本計算器基于JavaScript的web交互跨平臺技術(shù)，該應(yīng)用需求也越來越多，JavaScript編輯的交互web頁面改變了傳統(tǒng)的www訪問模式，它把JAVA嵌入在HTML中，無需通用網(wǎng)關(guān)接口(commongatewayinterface，CGI)即可實現(xiàn)動態(tài)交互，既能滿足用戶對靈活性和方便性的要求，又能對用戶提出的要求進(jìn)行快速響應(yīng)。
因此，本計算器針對中藥等級評價和“成分功效”關(guān)聯(lián)計算困難的問題，設(shè)計了一種基于HTML5的用于中藥等級計算的可視化交互系統(tǒng)，能夠快速、高效地進(jìn)行中藥等級計算并輸出簡明的評價結(jié)果。該計算器可獨(dú)立使用，也可作為網(wǎng)絡(luò)插件嵌入大型運(yùn)算平臺使用。其特點是將多個中藥的生物活性數(shù)據(jù)和質(zhì)控成分含量數(shù)據(jù)作為等級評價依據(jù)，采用多元回歸分析方法聯(lián)用Logistic回歸模型，通過大量數(shù)據(jù)擬合出特定藥材的等級評價方程。通過動態(tài)地輸入測定的數(shù)據(jù)，可直接經(jīng)過后臺計算最終輸出藥材的等級評價結(jié)果，這樣既減少了參數(shù)選擇的嘗試過程，又為準(zhǔn)確性提供了保證。
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作者：常百金1,2，唐志書1,2,3*，邱智東1*，劉妍如2，宋忠興2，賈艾玲1
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