牛至精油對常見致病菌的抗菌活性及作用機(jī)制研究進(jìn)展

　　摘要：牛至精油是從牛至全草中提取得到的揮發(fā)性物質(zhì)，含有香芹酚、百里香酚、丁香酚、D-檸檬烯、松油烯-4-醇等多種抗菌活性成分，通過作用于細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)、DNA、生物被膜等，在體內(nèi)外起到有效抑殺金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、弧菌等養(yǎng)殖動物常見致病菌，廣泛應(yīng)用于畜禽、水產(chǎn)動物養(yǎng)殖業(yè)中。文章對牛至精油的抗菌活性成分組成、體內(nèi)外抗菌作用及抗菌作用機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為牛至精油作為飼料添加劑在養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用及抗菌劑研發(fā)方面提供參考。

　　關(guān)鍵詞：牛至精油;抗菌成分;抗菌活性;作用機(jī)制

　　在動物養(yǎng)殖的過程中，細(xì)菌、病毒、寄生蟲等感染性病害頻繁發(fā)生，但是抗生素的濫用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性日益嚴(yán)重。因此，需要尋找高效、綠色、安全的新抗菌藥。牛至(OriganumvulgareL.)為唇形科牛至屬多年生的芳香草本植物，資源豐富，在我國常以其解表、理氣、化濕功效用于防治流感、中暑、嘔吐、腹痛、皮膚瘙癢及水腫等疾病[1]，而在歐美等國多以其抑菌、芳香功能作為食品儲存保鮮劑和食物烹飪調(diào)味劑[2]。

　　牛至精油是通過水蒸氣蒸餾法從牛至全草(包含葉、花、莖等)中提取得到的淡黃色或琥珀色透明液體，含有萜類、烷烴類、醇類、酸類、酯類、酚類、醛類等多種化學(xué)成分，具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用[3]。目前，牛至精油已應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工、動物生產(chǎn)等不同領(lǐng)域，且在養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用較為廣泛。據(jù)歐盟動物飼料添加劑和產(chǎn)品(FEEDAP)研究小組的調(diào)查評估結(jié)果顯示，牛至精油按建議添加使用，畜禽無不良反應(yīng)[4];我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也已批準(zhǔn)牛至精油為飼料中藥添加劑。本文綜述牛至精油對養(yǎng)殖動物常見致病菌的抗菌成分組成、體內(nèi)外抗菌活性及作用機(jī)制，以期為牛至油作為飼料添加劑在養(yǎng)殖業(yè)和抗菌劑的研發(fā)中提供參考。

　　1牛至精油的抗菌活性成分

　　通過氣相色譜法/質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)等測得水蒸氣蒸餾法所得牛至精油能夠穩(wěn)定存在，且含量較高，具有抗菌作用的活性成分[5-7]，主要有香芹酚8.88%~80.0%、百里香酚0.30%~64.0%、丁香酚0.17%~2.04%等;α-蒎烯0.04%~10.78%、D-檸檬烯0.20%~6.91%、石竹烯3.70%~6.09%、β-石竹烯0.39%~7.77%、γ-松油烯0.03%~10.02%等;芳樟醇0.81%、α-松油醇0.32%~0.69%、4-松油醇14.90%等;對-聚傘花素5.36%~29.53%等。

　　許璐等[8]研究發(fā)現(xiàn)，牛至油中的主要成分香芹酚、百里香酚對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等養(yǎng)殖致病菌的抑菌圈直徑為20.2~58.3mm，最小抑菌濃度(MIC)均為0.313~1.250mL/L，最小殺菌濃度(MBC)為0.313~2.500mL/L，表現(xiàn)出顯著的抗菌作用。

　　其他成分如丁香酚對豬源肺炎克雷伯菌[9]、維氏氣單胞菌[10]、鰻弧菌的MIC分別為0.002、0.400、0.400g/L[11];D-檸檬烯對金黃色葡萄球菌、耐藥銅綠假單胞菌的MIC分別為0.256、0.512g/L[12];松油烯-4-醇對無乳鏈球菌[13]、MRSA[14]、大腸桿菌[15]的MIC分別為0.098g/L、0.16%、1.56mL/L;α-松油醇對大腸桿菌的MIC為0.78mL/L[15]，均表現(xiàn)出顯著的抗菌作用。

　　2牛至精油的體外抗菌作用

　　2.1單一牛至精油的抗菌作用

　　牛至精油對革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌、MRSA、乙型溶血性鏈球菌、糞腸球菌等)、革蘭陰性菌(大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、志賀氏菌、沙門氏菌、熒光假單胞菌等)及真菌(黃曲霉菌、尖孢鐮刀菌、念珠菌等)等養(yǎng)殖致病菌具有不同強(qiáng)度的抑殺作用。許璐等[8]測得牛至精油對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、葡萄牙念珠菌的抑菌圈直徑為17.5~52.3mm、MIC與MBC均為0.313~1.250mL/L。牛至精油對產(chǎn)腸毒大腸桿菌、出血性腸炎大腸桿菌、宋氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、乙型溶血性鏈球菌的MIC為0.04%~0.09%[16]，對黃曲霉菌、尖孢鐮刀菌、鏈格孢菌的抑菌圈直徑為44.3~45.0mm、MIC為2.7~3.5μL/L[17]。因此，牛至精油具有抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)。

　　2.2復(fù)合牛至精油的抗菌作用

　　牛至精油與其他精油的聯(lián)用，可發(fā)揮不同的抗菌效果，以分級抑菌濃度(FIC)為評價指標(biāo)，F(xiàn)IC<0.5，協(xié)同;0.5~1.0，相加;1~4，無關(guān);≥4，拮抗。吳克剛等[18]發(fā)現(xiàn)，牛至精油按1∶1聯(lián)用肉桂、馬郁蘭或百里香等精油可對大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、致瀉性大腸桿菌、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌、黃曲霉起到相加抗菌作用(FIC聯(lián)為0.125~0.830)。Gutierrez等[19]研究發(fā)現(xiàn)，牛至精油按1∶1聯(lián)用羅勒、馬郁蘭、迷迭香、檸檬草等精油則僅對蠟樣芽孢桿菌有相加抗菌作用，而對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、李斯特菌則表現(xiàn)出無關(guān)作用。

　　2.3牛至精油聯(lián)合抗生素的抗菌作用

　　目前，畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖致病菌的耐藥菌株日益增多，特別是革蘭陰性埃希氏菌已表現(xiàn)出交叉耐藥和多重耐藥。研究發(fā)現(xiàn)，牛至精油與沙拉沙星、氟苯尼考、多西環(huán)素能夠協(xié)同抗產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌(MIC聯(lián)為0.125mL/L、FIC聯(lián)為0.375)，與左氟沙星、乙酰甲喹、頭孢噻呋、頭孢曲松、黏菌素、林可霉素、阿莫西林起到相加作用(MIC聯(lián)為0.125~0.250mL/L、FIC聯(lián)為0.50~0.75)[20-21]。

　　3牛至精油在動物體內(nèi)的抗菌作用

　　牛至精油是一種天然的高活性植物抑菌劑，在畜禽[22]及水產(chǎn)養(yǎng)殖[23]動物的不同生長階段應(yīng)用，具有抗菌譜廣、驅(qū)蟲、促生長、毒副作用小、無殘留、無耐藥性、無三致危害等優(yōu)點。

　　3.1牛至精油在豬體內(nèi)的抑菌作用

　　豬病原性腹瀉病的致病原有病毒、細(xì)菌、寄生蟲、霉菌毒素和真菌性等，以細(xì)菌性腹瀉(大腸桿菌、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、奇異變形桿菌等)最為常見[24]。陳會良等[25]按150mg/kg添加10%牛至油預(yù)混劑至仔豬日糧中，連喂30d發(fā)現(xiàn)，空腸、盲腸、結(jié)腸的大腸桿菌數(shù)量顯著降低7.01%、6.04%、8.60%，說明牛至油能夠明顯改善腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)。

　　黃國清等[26]研究發(fā)現(xiàn)，使用300mg/kg牛至精油可有效降低仔豬腹瀉率(5.0%)，仔豬腹瀉率僅為金霉素組的50%、“金霉素+黃霉素”組的40%;仔豬死淘率(3.33%)僅為金霉素組和“金霉素+黃霉素”組的33.4%。張勇等[27]也發(fā)現(xiàn)，按1000mg/kg添加5%牛至油預(yù)混劑，可極顯著降低仔豬腹瀉率(4.08%)、糞中大腸桿菌數(shù)量。

　　3.2牛至精油在反芻家畜體內(nèi)的抑菌作用

　　反芻家畜瘤胃及腸道中含有細(xì)菌、原生動物、古細(xì)菌和噬菌體等微生物多達(dá)7000余種[28]。牛、羊養(yǎng)殖過程中常見的細(xì)菌性致病原有肉毒梭菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、梭狀芽孢桿菌等[29]。陳昊等[30]發(fā)現(xiàn)，在荷斯坦奶牛全混合日糧(TMR)中按0.28g/頭添加牛至精油，連喂110d，可以有效降低奶牛的乳房炎發(fā)病率(2.0%)和腹瀉率(10.0%)，表明牛至油可以抑制奶牛體內(nèi)病原微生物的繁殖。

　　楊昭等[31]按0.02%添加牛至精油至TMR中，通過平板菌落計數(shù)法、國標(biāo)乳糖膽鹽發(fā)酵法檢測發(fā)現(xiàn)，TMR中霉菌、細(xì)菌、大腸菌群數(shù)均顯著減少。周瑞等[32]按日用量每頭7g/d添加牛至精油拌料，連喂82d后發(fā)現(xiàn)瘤胃、盲腸及直腸的物種豐度顯著提高，明顯抑制瘤胃中厚壁菌門、變形菌門、迷蹤菌門和綠彎菌門，同時有效降低瘤胃中原蟲數(shù)(11.88%)，改善瘤胃菌群結(jié)構(gòu)。

　　3.3牛至精油在禽類體內(nèi)的抑菌作用

　　細(xì)菌性疾病是雞養(yǎng)殖業(yè)的常見病和高發(fā)病，常見致病菌包括沙門氏菌、大腸桿菌、巴氏桿菌等[33]。Jia等[34]在蛋雞飼喂基礎(chǔ)日糧中添加100、200、400mg/kg的牛至精油，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同添加量的牛至精油能夠顯著增加伯克霍爾德菌、放線菌、雙歧桿菌、腸球菌科和桿菌科的豐度，而回腸中志賀菌的豐度降低。黃國清等[35]在日糧中按75mg/kg添加10%牛至油預(yù)混劑，連喂35d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛至油可降低空腸和盲腸中大腸桿菌數(shù)量，提高乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量。除會良等[36]在日糧中按100mg/kg添加牛至精油連喂肉雞30d后發(fā)現(xiàn)，肉雞盲腸中大腸桿菌數(shù)量顯著下降，同時空腸中乳酸桿菌數(shù)量、盲腸中雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量均顯著增加。

　　3.4牛至精油在魚類體內(nèi)的抑菌作用

　　魚類養(yǎng)殖常見的細(xì)菌性疾病有腸炎病(腸型點狀氣單胞菌)、暴發(fā)性出血病(嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌)、赤皮病(熒光假單胞菌)、羅非魚潰爛病(嗜水氣單胞菌)、爛鰓病(柱狀屈撓桿菌)等[37]。Oliveira等[38]按0.5%添加牛至精油拌料連喂尼羅羅非魚4w后，以嗜水氣單胞菌攻毒魚體，15d后發(fā)現(xiàn)羅非魚存活率為53.37%，且存活魚腎臟未檢測出致病菌，表明牛至精油可在體內(nèi)抑制有害菌的生長。曹升洪等[39]連續(xù)3w對羅非魚投喂添加150、300mg/kg牛至精油的餌料，在攻毒感染嗜水氣單胞菌72h內(nèi)，魚體的白細(xì)胞、NBT陽性細(xì)胞數(shù)量及溶菌酶活性可恢復(fù)至正常水平，有效降低致病菌對魚體的感染損傷。在吉富羅非魚的餌料中添加150mg/kg牛至油，可使運動性氣單胞菌、假單胞菌病、鏈球菌感染發(fā)病率減少81.5%[40]。

　　3.5牛至精油在蝦類體內(nèi)的抑菌作用

　　南美白對蝦常見的細(xì)菌性疾病有爛鰓病(弧菌、假單胞菌、氣單胞菌)、紅腿病(副溶血弧菌、鰻弧菌、溶藻弧菌、氣單胞菌、假單胞菌)、爛眼病(非01群霍亂弧菌)等[41]，其中弧菌感染性疾病最為常見、嚴(yán)重[42]。Gracia等[43]在基礎(chǔ)飼料中按5μL/kg添加不同有效成分組成的牛至精油(百里香酚∶香芹酚=48%∶23%、25%∶40%)，連喂4d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛至精油能夠顯著降低機(jī)體內(nèi)的創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌數(shù)量，有效抑制弧菌生長。當(dāng)在南美白對蝦餌料中添加100mg/kg牛至精油，可使對蝦弧菌感染所致“紅腿病”發(fā)生率減少90.5%~93.6%[40]。

　　4牛至精油的抗菌作用機(jī)制

　　4.1牛至精油對細(xì)胞壁通透性的影響

　　細(xì)胞壁能夠有效保護(hù)菌體形態(tài)，控制細(xì)胞生長;同時也是化學(xué)信號(激素、生長調(diào)節(jié)劑等)、物理信號(電波、壓力等)傳遞的介質(zhì)與通路，可進(jìn)行物質(zhì)運輸與信息傳遞介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用侵入宿主。石超峰[15]通過透射電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，α-松油醇在0.78mL/L濃度下可使大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)變小，形狀不規(guī)則，結(jié)構(gòu)層次混亂，細(xì)胞壁粗糙。吳克剛等[44]將大腸桿菌經(jīng)過芳樟醇處理后，利用1-苯胺基-8-萘磺酸熒光探針可發(fā)現(xiàn)菌體表面疏水性增強(qiáng)，掃描/透射電子顯微鏡均觀察到微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化(菌體外形萎縮)，結(jié)果均表明細(xì)胞壁完整性被破壞，使胞內(nèi)物質(zhì)泄漏、胞漿分布不均勻。

　　4.2牛至精油對細(xì)胞膜通透性的影響

　　細(xì)胞膜是包圍著細(xì)胞質(zhì)的半滲透薄膜，為細(xì)胞生長提供穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，也起到屏障保護(hù)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、能量傳遞、生物功能等作用。Haiying等[45]研究發(fā)現(xiàn)，牛至精油可對MRSA細(xì)胞膜可造成不可逆的損傷，引起細(xì)胞內(nèi)生物大分子物質(zhì)的泄漏，抑制三羧酸循環(huán)途徑及其關(guān)鍵酶，影響代謝產(chǎn)物。Siroli等[46]測定不同濃度的牛至精油(30、40、50mg/L)、百里香酚(40、70、100mg/L)、香芹酚(20、35、50mg/L)作用于李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌后細(xì)胞膜脂肪酸組成和揮發(fā)性分子譜的變化，結(jié)果顯示，以上藥物均對生長過程中膜脂肪酸譜和產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物有明顯的影響，誘導(dǎo)了細(xì)胞膜相關(guān)脂肪酸(C15∶0、C16∶0等)的顯著增加，特別是不飽和脂肪酸、反式異構(gòu)體和特異性釋放的游離脂肪酸，表明牛至精油、百里香酚、香芹酚能夠影響或破壞受試菌株的細(xì)胞膜。

　　4.3牛至精油對蛋白質(zhì)和DNA合成與代謝的影響

　　DNA是遺傳信息的載體，蛋白質(zhì)的胞內(nèi)生物合成是要在DNA指導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄、翻譯而成，二者共同參與控制細(xì)菌細(xì)胞生命活動。程峰等[14]通過RNA-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)，被松油烯-4-醇處理后，MRSA有145個基因表達(dá)上調(diào)、159個基因表達(dá)下調(diào)，主要是支鏈氨基酸的生物合成與氮代謝、ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族等基因差異。石超峰等[47]通過核酸合成抑制試驗、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳試驗研究α-松油醇對大腸桿菌的抑菌機(jī)理，結(jié)果顯示，α-松油醇可使大腸桿菌DNA熒光強(qiáng)度明顯減弱、可溶性蛋白譜帶變淺，表明其作用機(jī)制可能是抑制細(xì)菌核酸的合成和可溶性蛋白的表達(dá)。

　　4.4牛至精油對生物膜的影響

　　生物被膜是細(xì)菌的結(jié)構(gòu)化群落，細(xì)菌粘附在被膜表面并嵌入細(xì)胞外聚合物質(zhì)的自身基質(zhì)中，對抗菌劑具有很高的抵抗力，因此，細(xì)菌為適應(yīng)生存環(huán)境形成的生物被膜危害更大、抗性更強(qiáng)、抑制或消滅也更困難。Hacioglu等[48]研究顯示，牛至油能夠抑制白色念珠菌的生物膜黏附和形成，而且作用在成熟生物膜表面后可顯著減少其形成(抑制率50%)，同時也對不同濃度的白色念珠菌+金黃色葡萄球菌混合菌液的雙重生物膜有效，表明牛至精油對白色念珠菌起有效的抗生物膜作用。靳盼盼[49]分析發(fā)現(xiàn)，香芹酚和百里香酚均能抑制陰溝腸桿菌、糞腸球菌生物膜的形成，主要表現(xiàn)為細(xì)菌菌體變長、生物膜聚集過程變慢、厚度降低且膜內(nèi)菌落總數(shù)減少、胞外多糖含量降低。

　　4.5牛至精油對群體感應(yīng)的影響

　　群體感應(yīng)是一種細(xì)胞間交流機(jī)制，能夠調(diào)控生物被膜、腐敗酶和毒力因子分泌等。細(xì)菌利用群體感應(yīng)來調(diào)節(jié)某些表型表達(dá)，進(jìn)而協(xié)調(diào)機(jī)體行為。王雅瑩[50]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，香芹酚能夠影響與熒光假單胞菌多種生物被膜相關(guān)的基因，包括上調(diào)多糖代謝、pst系統(tǒng)和PhoB/U雙組分系統(tǒng)相關(guān)的基因，從而干擾生物被膜的形成，并顯著下調(diào)菌體鞭毛合成、趨向性蛋白、氨基酸脫羧酶和蛋白酶等與運動和致腐的基因以及編碼群體感應(yīng)LuxR受體蛋白的基因。

　　香芹酚能夠作用于靶蛋白LuxR，干擾群體感應(yīng)通路及其調(diào)控的生物被膜和致腐能力。香芹酚[51]、百里香酚[52]可以通過抑制銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌中LasI的活性，降低群體感應(yīng)基因(如lasR、LuxS、pfs等)、生物膜和群集運動的表達(dá)，干擾細(xì)菌的群體感應(yīng)通路，破壞生物膜使得菌體死亡。

　　5展望

　　雖然牛至精油對細(xì)菌感染性病害的防治效果顯著，但還存在一些問題：

　　(1)有效抗菌活性成分復(fù)雜多樣，但多聚焦高含量成分分析而忽略微量成分，成分-成分間相關(guān)性研究甚少，綜合起效成分組成不明確;同時成分種類及含量易受品種、產(chǎn)地等的影響而動態(tài)變化，缺乏有效可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

　　(2)目前研究多為單一精油或成分的體外抗菌活性，與不同揮發(fā)油、抗生素的聯(lián)用研究甚少，綜合抗菌或聯(lián)合抗菌的作用機(jī)制和作用靶點尚未明確;并且僅針對單一菌株進(jìn)行特定環(huán)境的靜態(tài)反應(yīng)進(jìn)行研究，缺乏不同條件、多種菌株的交叉動態(tài)考察，未能真實模擬實際養(yǎng)殖環(huán)境。

　　(3)牛至油雖然在不同品種動物養(yǎng)殖中應(yīng)用，但缺乏系統(tǒng)的體內(nèi)外抗菌相關(guān)性研究，尚無有效抗菌成分在體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄等過程的變化分析，無法真正指導(dǎo)養(yǎng)殖用藥。因此，牛至精油的整體作用仍待深入研究，且需要建立體內(nèi)外抗菌作用的相關(guān)性，才能有效應(yīng)用和指導(dǎo)日常養(yǎng)殖。

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　　作者：許巧欣1，2柯怡欣3陳詠琪1張萱萱1蔡延渠1*李鐘2*

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