馬鈴薯野生種冷馴化能力的蛋白組學(xué)分析

　　摘要為研究馬鈴薯冷馴化機理，通過同位素相對標(biāo)記與絕對定量技術(shù)(isobarictagsforrelativeandabsolutequantification,iTRAQ)分析了冷馴化過程中(0,4和12d)馬鈴薯野生種Solaumacaule(W3,具備冷馴化能力)和S.cardiophyllum(Cph12,無冷馴化能力)的蛋白質(zhì)組變化。結(jié)果表明：在W3和Cph12中篩選的可信蛋白質(zhì)數(shù)量分別為2126和1044;在冷馴化早期分別篩選到103與56個差異表達蛋白，后期分別篩選到330和155個;富集到與耐寒性或冷馴化直接相關(guān)的途徑27條，例如膜脂質(zhì)成分的調(diào)節(jié)，滲透保護劑的合成，抗氧化代謝，能量代謝和光合作用等。本研究結(jié)果為深入研究馬鈴薯冷馴化的分子機制提供理論指導(dǎo)，也可為馬鈴薯抗寒基因挖掘及分子育種提供參考。

　　關(guān)鍵詞馬鈴薯;冷馴化;蛋白組學(xué);差異表達蛋白

　　低溫是植物生長過程中面臨的主要非生物脅迫之一，植物的生長發(fā)育與生理代謝直接受到低溫的影響。而馬鈴薯普通栽培種(SolanumtuberosumL.)對霜凍敏感。馬鈴薯植株在氣溫低于7℃時停止生長，-0.8℃受冷害，-1.5℃受凍害(許娟等,2016)，后兩者經(jīng)常造成馬鈴薯大幅度減產(chǎn)(李飛等,2014)。植物經(jīng)過非致死溫度的低溫處理可以獲得更強的抗寒能力，這種現(xiàn)象被稱為冷馴化(Thomashow,1999)。

　　植物應(yīng)答低溫脅迫時通過冷馴化做出的自我保護響應(yīng)，可提高作物的低溫適應(yīng)性在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中對具有重要作用，然而冷馴化是一個復(fù)雜的過程，涉及若干生化和生理變化(Johnetal,2016)。因此研究馬鈴薯冷馴化作用機制具有極為重要的現(xiàn)實意義。近年來國內(nèi)外學(xué)者對作物冷馴化機制進行了大量研究。John等(2016)研究發(fā)現(xiàn)生物膜脂質(zhì)不飽和度和磷脂含量的增加以及細胞內(nèi)滲透保護劑的積累在通過冷馴化提高植物抗凍性中發(fā)揮重要作用。

　　如Shahandashti等(2013)研究表明，冷馴化后不飽和脂肪酸比例增加，是鷹嘴豆耐寒性提高的標(biāo)志;謝冬微等(2013)對冬小麥的研究表明，亞麻酸和棕櫚酸與抗寒性密切相關(guān)，同時不飽和脂肪酸增加導(dǎo)致抗寒性增強;滲透保護劑脯氨酸在包括玉米ZeamaysL.(DuncanandWidholm,1987)。此外植物冷馴化和抗凍性還涉及到其他代謝途徑，例如，植物的抗氧化能力可能是植物抗寒機理的重要組成部分(朱政等,2011);光合作用為冷馴化過程提供了碳骨架和能量(Normanetal.,2013);多胺通過減少氧化應(yīng)激來保護膜(KrasenskyandJonak,2012)。不同植物的冷馴化能力差異是由基因決定的(Kurepinetal.,2013)。

　　組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展在作物非生物脅迫中得到廣泛應(yīng)用，為抗逆基因的挖掘研究及代謝途徑提供重要思路。目前，有關(guān)馬鈴薯冷馴化的蛋白質(zhì)組研究少有報道，本研究通過iTRAQ技術(shù)對馬鈴薯野生種S.acaule(W3,抗凍具冷馴化能力)和S.cardiophyllum(Cph12,霜凍敏感不具冷馴化能力)在冷馴化期間蛋白質(zhì)組的變化進行分析，研究結(jié)果有助于揭示馬鈴薯野生材料冷馴化能力涉及的生理機制，為馬鈴薯抗寒機制的深入研究和分子育種提供參考。

　　1結(jié)果與分析

　　1.1iTRAQ分析

　　從冷馴化前(0d)、冷馴化中(4d)與冷馴化后(12d)的野生材料W3與Cph12中分別取樣進行iTRAQ分析(其中0d取2個生物樣,4d與12d各取3個生物樣)。各樣品總蛋白抽提后，進行SDS-PAGE檢測;確認(rèn)蛋白樣品合格后，將胰蛋白酶酶解、標(biāo)記，接著取等量的各標(biāo)記樣品混合后再進行色譜分離。經(jīng)過串聯(lián)質(zhì)譜檢測，分別鑒定出9642與6200個肽段。主成分分析結(jié)果顯示，樣品的重復(fù)性符合要求。最終，鑒定出可信蛋白質(zhì)為W3中2126個，Cph12中1044個。

　　1.2差異表達蛋白篩選

　　按照4/0d和12/4d的比較組設(shè)定，冷馴化前期(4/0d)，馬鈴薯野生材料W3中共篩選到差異表達蛋白103個(上調(diào)表達58個,下調(diào)表達45個)，Cph12中篩選到差異表達蛋白56個(上調(diào)表達30個,下調(diào)表達26個);冷馴化后期(12d/4d)，馬鈴薯野生材料W3中共篩選到差異表達蛋白330個(上調(diào)表達183個,下調(diào)表達147個)，Cph12中篩選到差異表達蛋白155個(上調(diào)表達95個,下調(diào)表達60個)。通過歸并重復(fù)項，馬鈴薯野生材料W3中共獲得的動態(tài)變化蛋白數(shù)為404個，Cph12中為248個，這部分動態(tài)變化蛋白可以很好的詮釋在不同差異比較組中蛋白的表達模式。

　　1.3GO注釋

　　對各比較組中的DEPs進行GO注釋，并分3個類別生物過程(Biologicalprocess)、細胞組分(Cellularcomponent)與分子功能(Molecularfunction)進行富集分析。與DEPs篩選結(jié)果類似，在冷馴化后期(12d/4d),W3與Cph12中富集到的GO項大幅度增加,W3中增加幅度大于Cph12。按P-value值大小排序，在生物過程分析中，對比組C4/C0富集到的前10個GO項中有5個與光合作用相關(guān)的，其中光合作用、光反應(yīng)、暗反應(yīng)在對比組C12/C4、W4/W0與W12/W0中也被富集到，但是排名較為靠后。

　　與此相反，小分子代謝過程、草酸代謝過程、有機酸代謝過程等GO項在對比組C12/C4、W4/W0與W12/W0中排名前10，而在對比組C4/C0排名較為靠后。在細胞組分分析中，各對比組前8位均相同，包括細胞(Cell)、細胞部分(Cellpart)、細胞內(nèi)(Intracellular)、細胞內(nèi)部分(Intracellularpart)、細胞質(zhì)(Cytoplasm)、細胞內(nèi)的細胞器(Intracellularorganelle)、細胞器(Organelle)及胞質(zhì)部分(Cytoplasmic。

　　1.4KEGGPathway分析

　　通過OmicsBean組學(xué)數(shù)據(jù)的整合分析云平臺，利用KEGGPathway對差異表達蛋白分析(P-value<0.05)，W3中富集到85個Pathway，Cph12中富集到68個Pathway。在富集到的Pathway中，包括了膜脂組分調(diào)節(jié)、滲透保護劑合成、抗氧化相關(guān)代謝、能量代謝、光合作用、次生代謝物(如苯丙醇和二羧酸)等與植物抗寒性或者冷馴化能力直接相關(guān)的Pathway。

　　W3中富集到上述類型Pathway27個，涉及差異表達蛋白84個，這些差異表達蛋白中有62個的豐度變化表現(xiàn)為先升高后降低，占73.8%;Cph12中富集到23個通路，涉及差異表達蛋白43個，其中有29個差異表達蛋白豐度變化規(guī)律為先降低后升高，或者持續(xù)升高，占69.05%。

　　2討論

　　2.1差異表達蛋白數(shù)量與抗寒性積累的關(guān)系

　　冷馴化前期(4/0d)，馬鈴薯野生材料W3中共篩選到差異表達蛋白103個，Cph12中篩選到差異表達蛋白56個;冷馴化后期(12/4d)，馬鈴薯野生材料W3中共篩選到差異表達蛋白330個，Cph12中篩選到差異表達蛋白155個，因此冷馴化后期(12/4d)，在W3和Cph12中篩選的DEP是早期(4/0d)的3倍。

　　與DEP篩選結(jié)果相似，在后期冷適應(yīng)期(12/4d)富集的GO項數(shù)量顯著增加，并且W3的增加大于Cph12。DEPs和GO項的數(shù)量變化與Wu等(2019)前期研究中馬鈴薯抗凍性變化一致。在富集到的代謝過程中，有許多途徑與植物的抗寒性直接相關(guān)，包括膜脂質(zhì)成分，滲透保護劑，抗氧化劑以及能量和碳骨架。同時，W3和Cph12中的富集到的代謝途徑基本相同。然而，在每個途徑中，W3中的差異表達蛋白數(shù)量大于Cph12，這表明W3中與寒冷適應(yīng)相關(guān)的代謝網(wǎng)絡(luò)的“動員度”更高，從而增強了植物的抗寒性。

　　2.2生物膜組分變化與冷馴化能力的關(guān)系

　　Yadav(2010)研究表明，低溫下冰的形成導(dǎo)致植物組織脫水，在細胞壁和質(zhì)膜上造成機械損傷，造成細胞破裂和細胞器完整性的喪失，是低溫下植物損傷的真正原因。不飽和脂肪酸(包括亞油酸,亞麻酸,棕櫚酸等)熔點較低，可以降低生物膜的相變溫度(Haraetal.,2003)，高不飽和脂質(zhì)水平有助于維持葉綠體在低溫下的膜功能(Zhangetal.,2009)。脂肪酸不飽和度和磷脂含量的增加與對冷凍應(yīng)激的耐受性有關(guān)(Moelleringetal.,2010)。Vega等(2004)研究發(fā)現(xiàn)，野生馬鈴薯種S.commersonii冷馴化過程中膜甘氨酸亞油酸在葉片中積累，在其他馬鈴薯中未發(fā)現(xiàn)這種特性。

　　本研究中，α-亞麻酸代謝、亞麻酸代謝、甘油磷脂代謝、甘油脂代謝、脂肪酸降解與脂肪酸生物合成等與膜脂組分代謝相關(guān)的通路在W3冷馴化過程中被富集到，其中前5條通路在Cph12中也被富集到，但是W3中涉及差異表達蛋白數(shù)量(13個)高于Cph12(6個)。

　　項目組前期(Wuetal.,2019)研究表明：冷凍處理后，未經(jīng)冷馴化的W3葉肉細胞中液泡解體，葉綠體被膜受到一定破壞;隨著冷馴化時間的延長，細胞器在冷凍處理中受到的損傷逐漸減少;冷馴化12d后，各細胞器無明顯損傷;同時，植株葉片在冷凍處理中的受損程度與其相對電導(dǎo)率成顯著相關(guān)。未經(jīng)冷馴化的Cph12冷凍處理后的表現(xiàn)與W3類似;冷馴化后，各細胞器在冷凍處理中受到的損傷僅有輕微減輕。由此推測，冷馴化可以通過調(diào)節(jié)脂肪酸的生物合成途徑來改變W3的細胞膜成分，從而減少在低溫條件下對其膜結(jié)構(gòu)的破壞。

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　　3材料與方法

　　3.1試驗材料

　　馬鈴薯野生材料W3和Cph12引自國際馬鈴薯中心。試管苗種植于貴州省農(nóng)科院學(xué)院溫室大棚(106˚39’59’’E,26˚30’20’’N)。在苗期(植株有5~7片完全展開的復(fù)葉)取長勢一致的植株，在人工氣候箱(AHRP-2000D,常州)內(nèi)培養(yǎng)2d(溫度20℃±0.5℃、相對濕度70%±5%、14h/10h光暗培養(yǎng)、光照強度100μmol•m-2g-1);隨后開始進行冷馴化，馴化條件為：白天4℃/14h，光照強度100μmol•m-2g-1;夜間2℃10h，黑暗。在冷馴化第0天、第4天和第12天，分別取W3和Cph12植株葉片(從頂端往下第3,4片展開復(fù)葉)用于蛋白組學(xué)及生物信息學(xué)分析。

　　3.2iTRAQ分析

　　取W3和Cph12冷馴化0d(2個生物重復(fù))、4d(3個生物重復(fù))與12d(3個生物重復(fù))的葉片(從頂部往下第3片展葉)用于iTRAQ分析。提取樣品葉片的總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，并用12%SDS-PAGE電泳進行檢測。通過對胰蛋白酶溶液進行測序來消化蛋白質(zhì)樣品，并用iTRAQ試劑進行標(biāo)記。

　　參考文獻：

　　ChenL.J.,XiangH.Z.,MiaoY.,ZhangL.,GuoZ.F.,ZhaoX.H.,LinJ.W.,andLiT.L.,2014,Anoverviewofcoldresistanceinplants,JournalofAgronomyandCropScience,200(4):237-245.

　　DuncanD.R.,andWidholmJ.M.,1987,Prolineaccumulationanditsimplicationincoldtoleranceofregenerablemaizecallus,PlantPhysiology,83(3):703-708.

　　GrimaudF.,RenautJ.,DumontE.,SergeantK.,LucauDanilaA.,BlervacqA.S.,SellierH.,BahrmanN.,LejeuneHénautI.,DelbreilB.,andGoulasE.,2013。

　　Exploringchloroplasticchangesrelatedtochillingandfreezingtoleranceduringcoldacclimationofpea(PisumsativumL.),JournalofProteomics,80(27):145-159.

　　作者：何天久李飛吳巧玉*

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