本文摘要：摘要：抗菌肽是飼料添加劑中最有潛力的替抗產(chǎn)品之一。利用基因工程菌生產(chǎn)抗菌肽產(chǎn)量高、成本低、耗時短，是實現(xiàn)抗菌肽大規(guī)模生產(chǎn)的最佳方案。文章綜述幾種能夠生產(chǎn)抗菌肽的表達(dá)系統(tǒng)以及抗菌肽在動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用，旨在為抗菌肽發(fā)展的方向提供參考。 關(guān)鍵詞：
摘要：抗菌肽是飼料添加劑中最有潛力的替抗產(chǎn)品之一。利用基因工程菌生產(chǎn)抗菌肽產(chǎn)量高、成本低、耗時短，是實現(xiàn)抗菌肽大規(guī)模生產(chǎn)的最佳方案。文章綜述幾種能夠生產(chǎn)抗菌肽的表達(dá)系統(tǒng)以及抗菌肽在動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用，旨在為抗菌肽發(fā)展的方向提供參考。
關(guān)鍵詞：抗菌肽;基因工程;飼料添加劑
抗菌肽是由生物體產(chǎn)生的能夠快速抵抗致病性微生物的天然抗生素，在宿主防御中起著重要作用[1]�？咕目梢詮牟煌纳矬w中被分離出來，包括動物、植物、細(xì)菌和真菌[2-4]�？咕臄�(shù)據(jù)庫(APD)已經(jīng)收錄3000多種天然抗菌肽[5]�？咕耐ㄟ^改變膜的通透性[6]、抑制代謝[7-8]以及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[9]等途徑到達(dá)抑菌效果，且不易產(chǎn)生耐藥性。
在替抗的大環(huán)境下，抗菌肽以其獨特的優(yōu)勢成為當(dāng)今最有潛力的飼料添加劑之一�？咕牡纳a(chǎn)方式可以分為3種：從生物體上分離提純[10-11]、化學(xué)合成[12]和生物合成[13]。上述3種方式均可以獲得抗菌肽，但存在著產(chǎn)量低、耗時長、成本高等問題。如果需要進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，利用基因工程進(jìn)行生物合成是較好的選擇。一些細(xì)菌和真菌均可以作為生產(chǎn)抗菌肽的宿主菌，文章對幾種能夠生產(chǎn)抗菌肽的表達(dá)系統(tǒng)以及抗菌肽在動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。
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1原核表達(dá)系統(tǒng)
1.1大腸桿菌表達(dá)抗菌肽大腸桿菌是常見的原核表達(dá)系統(tǒng)，其遺傳背景清晰、繁殖迅速，能夠高效穩(wěn)定地表達(dá)外源基因，產(chǎn)生有生物活性的蛋白產(chǎn)物。目前，有很多抗菌肽在大腸桿菌中成功表達(dá)的研究[14]�？咕牡姆肿恿啃�，不易分離和提純，可將同一種抗菌肽基因串聯(lián)表達(dá)，增加分子量;或者將抗菌肽與其他蛋白串聯(lián)起來[15-16]。但是，利用大腸桿菌表達(dá)抗菌肽也存在一定的弊端�？咕膶Υ竽c桿菌存在一定的傷害，可能會導(dǎo)致細(xì)胞死亡;大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的酶會降解抗菌肽;在抗菌肽的分泌過程中可能會有包涵體的產(chǎn)生等。
1.2枯草芽孢桿菌表達(dá)抗菌肽枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌，是一種用于大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白的替代表達(dá)系統(tǒng)�？莶菅挎邨U菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢為該菌耐熱、不產(chǎn)內(nèi)毒素和外毒素、有很好的發(fā)酵基礎(chǔ)[17]�？莶菅挎邨U菌是一種綠色的飼料添加劑，具有改善腸道功能，提高動物免疫力的優(yōu)點[18]。Li等[19]成功將一種從蜂蜜中提取出的抗菌肽abaecin在枯草桿菌中表達(dá)，并且達(dá)到抑菌效果，說明枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)可以作為生產(chǎn)抗菌肽的一種強(qiáng)有力的工具。但與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比，枯草芽孢桿菌的表達(dá)載體、質(zhì)粒以及產(chǎn)物表達(dá)過程均存在著不穩(wěn)定性，這些問題還需亟待解決[17]。
1.3地衣芽孢桿菌表達(dá)抗菌肽地衣芽孢桿菌能夠促進(jìn)腸道有益菌的生長，多用在水產(chǎn)養(yǎng)殖，對弧菌的抑制作用較佳[20]。通過基因工程改造地衣芽孢桿菌在產(chǎn)酶上已經(jīng)得到一些成果，但是通過表達(dá)外源基因生產(chǎn)抗菌肽的相關(guān)報道較少。2009年，有研究人員提出將細(xì)菌素基因轉(zhuǎn)入地衣芽孢桿菌中表達(dá)[21]。2014年，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)成功構(gòu)建出一株高產(chǎn)地衣素的地衣芽孢桿菌，優(yōu)化培養(yǎng)基后最高產(chǎn)量達(dá)2149mg/L(比親本菌種提高16.8倍)[22]。雖然本身存在著一定優(yōu)勢，但是地衣芽孢桿菌并未成為生產(chǎn)抗菌肽的一種基因工程菌，利用地衣芽孢桿菌還存在一定難度。
1.4乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)
乳酸菌可以調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，提高生產(chǎn)性能。乳酸菌的產(chǎn)酸能力強(qiáng)，可以充當(dāng)飼料中的酸化劑[23]。乳酸菌自身可以分泌出各種抗菌肽來抑制病原菌的生長，最多見的是細(xì)菌素。細(xì)菌素可以作為防腐劑和抗菌劑在市場上應(yīng)用，但是不具有廣譜抑菌性[24]。開發(fā)具有廣譜活性的新型細(xì)菌素成為關(guān)注的重點。研究人員從乳酸菌中分離出幾種新型細(xì)菌素和非核糖體抗菌肽，以上幾種抗菌肽對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有抑制作用[25]。乳酸菌的研究熱點集中在如何從中分離出新型抗菌肽[26-27]，而不是讓其表達(dá)外源基因。這一點可能是由于相較于其他的表達(dá)系統(tǒng)，乳酸菌的遺傳背景和生物學(xué)信息不夠清晰，在分子操作上存在一定的難點。
2真核表達(dá)系統(tǒng)
2.1畢赤酵母表達(dá)抗菌肽與原核生物表達(dá)系統(tǒng)不同，真核系統(tǒng)對蛋白質(zhì)有一定的修飾作用，可以避免產(chǎn)生無生物活性的產(chǎn)物。畢赤酵母是優(yōu)選的真核表達(dá)系統(tǒng)，能夠使用甲醇作為其唯一的碳源，基因中含有由甲醇誘導(dǎo)的AOX1啟動子可以實現(xiàn)基因的高水平表達(dá)[28]。與其他的真核表達(dá)系統(tǒng)相比，利用畢赤酵母表達(dá)外源基因，生產(chǎn)蛋白類物質(zhì)更容易分泌到細(xì)胞外。例如，利用畢赤酵母表達(dá)抗菌肽NZX，在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行120h的誘導(dǎo)，產(chǎn)物收率可達(dá)965mg/L，純度為92.6%[29]。利用畢赤酵母實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的局限性在于畢赤酵母的強(qiáng)啟動子AOX1需要利用甲醇誘導(dǎo)，甲醇使得生產(chǎn)安全性大大降低。目前，大多使用不需要進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)的組成型啟動子。
2.2釀酒酵母表達(dá)抗菌肽在飼料中添加釀酒酵母培養(yǎng)物能夠起到增加飼料適口性、增大采食量、提高動物的抵抗力的作用。利用釀酒酵母表達(dá)抗菌肽的優(yōu)勢在于安全性。目前，通過釀酒酵母表達(dá)抗菌肽，并實現(xiàn)大量生產(chǎn)的實例較少，因為釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)存在糖基化嚴(yán)重的問題，會導(dǎo)致大量蛋白失活。但是，也有一些研究展現(xiàn)出釀酒酵母表達(dá)抗菌肽的潛力，如菌絲霉素[30]、牛乳鐵蛋白肽[31]以及一些報道較少的抗菌肽[32]均實現(xiàn)了在釀酒酵母中的成功表達(dá)。
3抗菌肽在動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用
3.1抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用邱繼新等[33]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加100mg/kg蠅蛆抗菌肽，飼喂56d后，鳙魚餌料系數(shù)降低16.56%，成活率提高10%，表明添加蠅蛆抗菌肽可以有效促進(jìn)鳙魚生長，降低養(yǎng)殖成本。董曉慶等[34]研究發(fā)現(xiàn)，添加200mg/kg抗菌肽時，鯉魚生長狀態(tài)良好，有利于蛋白質(zhì)、鈣、磷的積累。使用抗菌肽浸泡虹鱒苗種，通過對相關(guān)免疫酶以及體表細(xì)菌的觀察，發(fā)現(xiàn)抗菌肽浸泡能夠提高虹鱒苗種的免疫力，減少體表細(xì)菌滋生，大大提高幼魚成活率[35]。
3.2抗菌肽在反芻動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用抗菌肽可以作為幼齡山羊的飼料添加劑，添加抗菌肽可以提高瘤胃木聚糖酶、果膠酶和脂肪酶的活性;也可以提高乙酸、丙酸和總揮發(fā)性脂肪酸的濃度，有助于山羊的生長[36-37]。楊顏銥[38]研究表明，復(fù)合抗菌肽“態(tài)康利保”可以增強(qiáng)川中黑山羊細(xì)胞、體液免疫應(yīng)答。陳蕓等[39]研究表明，添加復(fù)合抗菌肽可以降低山羊瘤胃變形菌門和螺旋菌門的相對含量，提高部分降解纖維菌屬的含量，并且瘤胃菌群結(jié)構(gòu)多樣性不受復(fù)合抗菌肽的影響。柳涵等[40]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽可以明顯提高奶牛產(chǎn)奶量，對奶牛隱性乳房炎也有一定的防治效果[41]。
3.3抗菌肽在家禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用張磊[42]研究表明，抗菌肽能夠提高海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋后期的產(chǎn)蛋率，改善雞蛋的營養(yǎng)成分。益生菌與抗菌肽的復(fù)合優(yōu)于單獨使用[43]。王建[44]研究發(fā)現(xiàn)，將抗菌肽Api-PR19添加到肉雞日糧中，肉雞腸絨毛組織結(jié)構(gòu)得到改善，腸道有害菌的數(shù)量減少，肉雞的生長性能得到改善。張江等[45]研究發(fā)現(xiàn)，添加微生態(tài)制劑和抗菌肽復(fù)合物可以提高櫻桃谷鴨的成活率。
3.4抗菌肽在豬養(yǎng)殖中的應(yīng)用梁秀麗等[46]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽B-13可以改善初生仔豬小腸形態(tài)，提升盲腸微生物菌群多樣性和豐富度。劉又銘等[47]研究表明，抗菌肽對由脂多糖引起的仔豬消化性能降低有明顯的改善作用。袁威等[48]研究表明，抗菌肽在提高斷奶仔豬生長性能和其免疫力等方面具有良好的效果。黃榮春[49]研究表明，抗菌肽可以顯著增加仔豬出生重、平均產(chǎn)活仔數(shù)、平均產(chǎn)健仔數(shù)和健仔率。
4展望
利用原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)抗菌肽的優(yōu)勢在于繁殖快、培養(yǎng)周期短、表達(dá)抗菌肽易于分離純化;與真核表達(dá)系統(tǒng)相比的劣勢在于無法進(jìn)行蛋白質(zhì)的進(jìn)一步修飾以及難以抵抗抗菌肽對自身的傷害。較為常用表達(dá)系統(tǒng)，如大腸桿菌和畢赤酵母，兩者均已經(jīng)具備成熟的操作手段，并且均已經(jīng)取得了不錯的成果�？莶菅挎邨U菌、乳酸菌以及釀酒酵母由于其本身的安全性，同樣具有發(fā)展?jié)摿��？咕淖鳛轱暳咸砑觿诟纳苿游锬c道菌群、維持腸道健康、提升動物免疫力等方面有積極作用。但單一的抗菌肽產(chǎn)品并不能完全代替抗生素，還需要和其他的替抗產(chǎn)品復(fù)配。對于不同的動物來說，抗菌肽的添加量需要通過進(jìn)一步的試驗來確定。
參考文獻(xiàn)
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作者：張雨陳鵬
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