低分子量褐藻多糖的制備及其活性分析

　　摘要：利用抗壞血酸協(xié)同過氧化氫法降解褐藻多糖，以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，通過工藝優(yōu)化得到最佳降解條件，然后用超濾技術(shù)將降解產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)，獲得不同分子量組分，并分析其DPPH自由基清除率、保濕效果，酪氨酸酶抑制率等活性。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳降解條件為VC濃度20mmol/L、降解溫度45℃、降解時(shí)間3h，在此條件下獲得的降解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率達(dá)到61.23%，降解產(chǎn)物得率為73.16%。電泳結(jié)果表明，降解后的褐藻多糖的條帶明顯出現(xiàn)在低分子量區(qū)。利用超濾系統(tǒng)將降解產(chǎn)物分級(jí)為5kDa、10kDa、1030kDa、>30kD四個(gè)不同分子量段的組分，研究發(fā)現(xiàn)各分子量段之間的活性存在顯著差異(<0.05)，尤其5kDa組分(其主要成分為2.140×10Da，占比29.6%)的活性最好，其DPPH自由基清除率為59.27%，60后保濕率為75.75%，酪氨酸酶抑制率為65.28%。與褐藻多糖相比，其糖醛酸含量稍有下降。本研究結(jié)果可為褐藻多糖在功能性食品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

　　關(guān)鍵詞：低分子量褐藻多糖，制備，DPPH自由基清除率，保濕效果，酪氨酸酶抑制率

　　褐藻多糖，又名褐藻多糖硫酸酯、褐藻膠，主要來源于海帶、巨藻、泡葉藻、墨角藻等海藻，集中于褐藻植物細(xì)胞壁中，是一種含有硫酸基團(tuán)的高分子量的雜多糖，具有抗氧化、降尿酸、抗腫瘤、抗病毒、抗炎等生理功能[13]，在功能性食品、果蔬保鮮等方面具有較大應(yīng)用潛力。然而，由于天然褐藻多糖存在著分子量大、黏度高，滲透性差，不利于吸收等問題，其應(yīng)用受到很大限制。

　　研究表明，通過一定方式降解多糖，獲得低分子量多糖，能夠提高多糖的生物活性和生物利用率[4,5]。Zhao等[6]以海帶為原料制備的低分子量巖藻多糖對(duì)超氧自由基、羥自由基等有較強(qiáng)的體外清除作用。Xue等[7]研究表明低分子量的硫酸多糖對(duì)低密度脂蛋白的氧化作用強(qiáng)于粗巖藻糖。任立士等研究發(fā)現(xiàn)通過利用自由基降解法制備的海藻寡糖，具有良好的清除自由基的能力[8]。因此，通過適當(dāng)方法降低褐藻多糖分子量，是發(fā)揮其生理活性的重要途徑。

　　目前，低分子量褐藻多糖的制備方法可分為物理法、化學(xué)法、生物酶解法[7]。生物酶解法條件溫和且分子量較易控制，但酶制劑價(jià)格昂貴且不易獲得[9]。硫酸基團(tuán)對(duì)褐藻多糖活性的發(fā)揮起到很重要的作用，ang、Mohsin等研究發(fā)現(xiàn)，低分子量褐藻多糖自由基清除能力、抗凝血活性與硫酸根含量成正相關(guān)1011。Anastyuk等2]研究發(fā)現(xiàn)，由于硫酸酯基及α，巖藻糖苷鍵的存在，低分子量褐藻糖對(duì)人體惡性黑色素瘤細(xì)胞系SKMEL28表現(xiàn)出了較好的抑制性。Shao等13研究表明，體外抗癌活性與褐藻多糖分子中的硫酸根含量有關(guān)。

　　同時(shí)，硫酸化的褐藻多糖被報(bào)道具有抑制單純形皰疹病毒(HSV)和人類免疫缺陷病毒(HIV)的能力1415，甚至被推斷具有抗新冠病毒(coronavirusdisease2019COVID19)的能力16。因此在選擇方法的時(shí)候應(yīng)著重注重對(duì)硫酸基團(tuán)的保護(hù)，但化學(xué)方法對(duì)硫酸基團(tuán)的破壞較為嚴(yán)重，不適合應(yīng)用。作者前期實(shí)驗(yàn)表明，利用自由基法可有效降解褐藻多糖，同時(shí)不會(huì)過度破壞硫酸基團(tuán)。因此，本實(shí)驗(yàn)利用抗壞血酸輔助過氧化氫法對(duì)褐藻多糖進(jìn)行降解，以DPPH自由基清除率為指標(biāo)進(jìn)行降解條件優(yōu)化。利用超濾系統(tǒng)對(duì)降解的多糖進(jìn)行分級(jí)，對(duì)比不同分子量段降解多糖的DPPH自由基清除率、保濕性以及酪氨酸酶抑制活性，分析其分子量及化學(xué)組成，以期為褐藻多糖在食品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1材料與儀器褐藻多糖：山東潔晶集團(tuán)股份有限公司;瓊脂糖凝膠：青島源葉生物技術(shù)公司;透明質(zhì)酸：廣州高良生物科技有限公司;DPPH：北京索萊寶科技有限公司;過氧化氫、抗壞血酸等均為市售國產(chǎn)分析純。真空冷凍干燥機(jī)：德國CHREIST公司;DU800型紫外可見分光光度計(jì)：美國貝克曼公司;SHAB水浴恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司;高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;DYY6C型電泳儀：北京市六一儀器廠;超濾膜分離系統(tǒng)：美國賽默飛公司;十八角度激光光譜散射儀：美國Wyatt公司;DGU20A5R高效液相色譜儀：日本島津公司。

　　1.2實(shí)驗(yàn)方法

　　1.2.1褐藻多糖的降解

　　配制1%的褐藻多糖溶液，加入一定體積的30%過氧化氫和抗壞血酸，在一定溫度下降解一段時(shí)間后，用0.01mol/L氫氧化鈉(NaOH)調(diào)節(jié)溶液pH至中性，采用200D透析袋，蒸餾水透析，凍干后得降解產(chǎn)物。

　　1.2.2褐藻多糖降解單因素及正交試驗(yàn)

　　以褐藻多糖降解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為指標(biāo)，使用過氧化氫結(jié)合抗壞血酸的方法降解褐藻多糖[17,。配制1%的褐藻多糖溶液，以實(shí)驗(yàn)條件VC濃度15mmol/L(向100mL褐藻多糖溶液中添加153µL30%過氧化氫溶液和0.26gVC)、降解溫度℃、降解時(shí)間為固定因素水平，按照表替換相應(yīng)因素水平進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)因素水平正交試驗(yàn)，以褐藻多糖降解產(chǎn)物DPPH自由基清除率為指標(biāo)確定最佳降解條件。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

　　隨2–VC用量增加，清除率從40.2%升至56.1%，2–VC用量為20mmol/L之后清除率開始下降。這可能是由于含量過高時(shí)，自由基氧化反應(yīng)劇烈，產(chǎn)物脫硫現(xiàn)象和脫羧反應(yīng)較為嚴(yán)重2425，因此，2–VC的最適用量為20mmol/L。一般來說，溫度的升高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速率的增加，更高的溫度意味著更高的分子平均動(dòng)能和單位時(shí)間內(nèi)更多的碰撞26。

　　隨著溫度的升高，清除率快速升高，當(dāng)溫度到45℃時(shí)，清除率達(dá)到最大為54.1%，因此，適當(dāng)提高反應(yīng)溫度有利于活性增強(qiáng)。當(dāng)溫度高于45℃時(shí)，清除率開始下降，原因可能是當(dāng)溫度過高時(shí)，VC活性降低并且部分分解，導(dǎo)致降解多糖的能力降低，導(dǎo)致清除率下降27，因此最適溫度為45℃。如圖所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，DPPH自由基清除率呈現(xiàn)先上升后平緩趨勢，當(dāng)降解時(shí)間為3h時(shí)，清除率達(dá)到最大值為48.9%。原因可能隨著時(shí)間的延長，多糖分子量不再減小或者分子量減小趨勢變緩,29]，使DPPH自由基清除率趨于平緩，因此，最適降解時(shí)間為3h。

　　2.2正交試驗(yàn)結(jié)果分析

　　在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取2VC濃度、降解溫度和降解時(shí)間三個(gè)因素，每個(gè)因素各取三個(gè)水平，各因素對(duì)抗氧化活性的影響程度依次為2VC濃度>降解時(shí)間>降解溫度，2–VC的用量對(duì)褐藻多糖降解后DPPH清除率影響最為大，最佳組合是，即2VC濃度為20mmol/L、降解溫度45℃、降解時(shí)間。隨后進(jìn)行了最佳組合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得降解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為61.23±0.55%，高于正交試驗(yàn)中的最高值，證明正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效，此條件下降解產(chǎn)物得率為73.16%。

　　3結(jié)論

　　本研究以DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立了以2VC自由基法降解褐藻多糖的方法，正交試驗(yàn)優(yōu)化得到最佳降解條件為2VC濃度為20mmol/L、降解溫度45℃以及降解時(shí)間3h，最佳條件下降解產(chǎn)物得率為73.16%，DPPH自由基清除率為61.23%。凝膠電泳結(jié)果表明，降解后的褐藻多糖的條帶明顯出現(xiàn)在低分子量區(qū)，說明該降解法穩(wěn)定并有效。

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　　通過超濾系統(tǒng)將此產(chǎn)物降解分為5kDa、5kDa10kDa、10kDa30kDa、30kDa四段，DPPH自由基清除率、保濕性、以及酪氨酸酶抑制活性研究表明，<5kDa分子量段的組分的活性顯著高于其它組分(<0.5)。進(jìn)一步測定了<5kDa分子量段組分的單糖組成與分子量分布，結(jié)果表明，與多糖相比，該組分的巖藻糖含量略高，葡萄糖醛酸含量相對(duì)減少;經(jīng)測定，該組分主要含有五個(gè)組分，其中2.140×10Da含量最高，達(dá)到29.6%，其次是4.126×10Da組分，占比為24.1%。研究結(jié)果可為低分子量褐藻多糖的在功能性食品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，下一步可以在低分子量褐藻多糖的構(gòu)效關(guān)系方面開展更深入的研究。

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　　作者：闕斐，陶文靖,馮文婕

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