本文摘要：摘要：本研究旨在篩選出能產(chǎn)生促進(jìn)植物生長(zhǎng)的揮發(fā)性有機(jī)化合物(volatileorganiccompounds，VOCs)的潛在植物根際促生菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria，PGPR)，考察其VOCs對(duì)植物的促生作用及其它促生功能，為研發(fā)微生物肥料提供新的思路及可靠的材料。以
摘要：本研究旨在篩選出能產(chǎn)生促進(jìn)植物生長(zhǎng)的揮發(fā)性有機(jī)化合物(volatileorganiccompounds，VOCs)的潛在植物根際促生菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria，PGPR)，考察其VOCs對(duì)植物的促生作用及其它促生功能，為研發(fā)微生物肥料提供新的思路及可靠的材料。以本實(shí)驗(yàn)室從海洋樣品中分離保存的48株功能菌為供試菌株，通過(guò)二分隔平板實(shí)驗(yàn)、VOCs盆栽實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，結(jié)合菌株的16SrRNA進(jìn)行鑒定，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法(GasChromatography-Mass，GC-MS)對(duì)菌株所產(chǎn)VOCs成分進(jìn)行分析。通過(guò)平板活性實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)菌的固氮，溶磷及產(chǎn)IAA進(jìn)行活性檢測(cè)。研究結(jié)果顯示：篩選得到1株潛在PGPR-GX14001，其所產(chǎn)生的VOCs對(duì)本氏煙草(Nicotianabenthamiana)和上海青(BrassicachinensisL.)均表現(xiàn)出明顯的促生作用，菌株經(jīng)16SrRNA鑒定為橙色微桿菌(Microbacteriumaurantiacum)。經(jīng)GC-MS對(duì)其VOCs成分分析，共得到7種特異性化合物。經(jīng)平板活性檢測(cè)，GX14001具有較強(qiáng)的溶有機(jī)/無(wú)機(jī)磷活性和一般固氮活性，而其產(chǎn)IAA能力較弱，為1.737μg/mL。PGPR可通過(guò)不同的促生機(jī)制對(duì)植物表現(xiàn)出促生作用，研究結(jié)果表明GX14001所產(chǎn)VOCs對(duì)植物有明顯促生作用，其他方面的促生活性并不高，兩者之間不存在較高的正相關(guān)性，說(shuō)明其最主要的促生作用是通過(guò)所產(chǎn)生的VOCs獲得的。
關(guān)鍵詞：植物促生菌;揮發(fā)性有機(jī)物;橙色微桿菌;溶磷
化肥和農(nóng)藥在我國(guó)農(nóng)業(yè)歷史上發(fā)揮了巨大的增產(chǎn)作用，但長(zhǎng)期使用化肥會(huì)造成土壤板結(jié)，肥力下降，農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)降低，污染環(huán)境等一系列問(wèn)題[1]。隨著現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，應(yīng)用微生物代替化肥和農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)方面有廣泛的應(yīng)用前景。微生物肥料因其生產(chǎn)成本低、效果好、不污染環(huán)境以及有助于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。由于微生物肥料的快速穩(wěn)定發(fā)展，對(duì)PGPR的研究與開(kāi)發(fā)也成為研究熱點(diǎn)[2]。
PGPR是一類能夠在植物根際定殖，通過(guò)固氮、溶磷、抗病、增加植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收、調(diào)整植物激素濃度以及產(chǎn)生揮發(fā)性有機(jī)物等多種機(jī)制促進(jìn)植物生長(zhǎng)的有益微生物的總稱。微生物產(chǎn)生揮發(fā)性有機(jī)物是促進(jìn)植物生長(zhǎng)的一個(gè)重要促生機(jī)制，已有研究報(bào)道，枯草芽孢桿菌[3-7]，解淀粉芽孢桿菌[3，7]、產(chǎn)堿假單胞菌[8]、放線菌[9]、木霉真菌[10]、枝孢樣枝孢霉[11]等多種微生物產(chǎn)生的VOCs能夠通過(guò)調(diào)節(jié)植物激素[12]，誘導(dǎo)系統(tǒng)耐受性[13]及系統(tǒng)抗性[14]等多方面促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。
本實(shí)驗(yàn)從實(shí)驗(yàn)室已保存的48株菌株中通過(guò)二分格平板實(shí)驗(yàn)篩選得到一株所產(chǎn)VOCs對(duì)植物有明顯促生作用的潛在PGPR菌株GX14001，經(jīng)16SrRNA鑒定后進(jìn)行了VOCs盆栽實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步驗(yàn)證其所產(chǎn)VOCs對(duì)植物的促生作用。通過(guò)GC-MS對(duì)GX14001所釋放的VOCs進(jìn)行了成分檢測(cè)，之后對(duì)其固氮、溶磷、產(chǎn)IAA活性進(jìn)行了研究。本研究為微生物菌肥資源的開(kāi)發(fā)與利用提供新的選擇。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1供試菌株
供試菌株為從海洋分離得到的48株可培養(yǎng)的功能菌株，保藏于廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。
1.1.2植物材料本氏煙草(Nicotianabenthamiana)，上海青(BrassicachinensisL.)。
1.1.3培養(yǎng)基TSA培養(yǎng)基，TSB培養(yǎng)基及MS培養(yǎng)基均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司，蒙金娜有機(jī)培養(yǎng)基[15]，PKO無(wú)機(jī)培養(yǎng)基[16]，Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基[17]，埃利希氏反應(yīng)顯色試劑。
1.1.4主要試劑和儀器細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒及所用引物合成：天根生化科技有限公司;PCR擴(kuò)增反應(yīng)相關(guān)試劑及限制酶等：北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司;PCR擴(kuò)增儀：BioRadT100;智能人工氣候箱：浙江托普RTOP-1000B;搖床：上海旻泉MQD-B1R;固相微萃取探針，購(gòu)自青島貞正分析儀器有限公司;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫5975C-7890A。
1.2方法
1.2.1細(xì)菌發(fā)酵液的制備將供試細(xì)菌接入TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：30℃，200r/min，24h。之后將菌液用無(wú)菌水稀釋至1×108CFU/mL備用。
1.2.2細(xì)菌與煙草共培養(yǎng)
1.2.2.1煙草預(yù)處理用75%(V/V)醫(yī)用酒精對(duì)煙草種子上下輕緩顛倒消毒2-3min后，再用1%的次氯酸鈉溶液(V/V)消毒2-3min，之后用無(wú)菌水將煙草種子沖洗4-5遍，清洗種子表面的消毒劑，防止殘留消毒劑影響種子萌發(fā)。將消毒后的煙草種子點(diǎn)種在MS培養(yǎng)基上，用封口膜將平板封好后，放在25℃智能人工氣候箱培育至發(fā)芽出苗。智能人工氣候箱的條件為白天16h，黑夜8h，溫度25℃。
1.2.2.2共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)采用9cm二分格培養(yǎng)皿進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，一側(cè)培養(yǎng)煙草，另一側(cè)培養(yǎng)細(xì)菌，由于物理界限，細(xì)菌的分泌及代謝物不能和煙草進(jìn)行接觸和交流，但細(xì)菌釋放的揮發(fā)性有機(jī)物可通過(guò)培養(yǎng)皿上空與煙草進(jìn)行交流和作用。將培養(yǎng)5d生長(zhǎng)狀況一致的煙草苗移栽到二分格培養(yǎng)皿的MS培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)皿移栽5棵，保持每棵煙草間距一致，在另一側(cè)TSA培養(yǎng)基接種10μL菌液，菌含量約為1×108CFU/mL，每個(gè)菌株做3個(gè)平行，以接種10μL滅菌水作為對(duì)照。將平板用封口膜封好后，放入智能人工氣候箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與之前一致，培養(yǎng)14d之后對(duì)煙草的生物量進(jìn)行測(cè)量與統(tǒng)計(jì)。
1.2.3菌株鑒定采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取供試菌株的總DNA。用細(xì)菌通用引物27-F：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'，1492-R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'進(jìn)行16SrRNA基因的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：模板1μL，正反向引物各1μL，2×TaqPCRStarMIXwithLoadingDye25μL，用ddH2O補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min;95℃1min，55℃1min，72℃2min為一個(gè)循環(huán)，進(jìn)行32個(gè)循環(huán);72℃延伸10min;最后4℃10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測(cè)序，所得序列通過(guò)Ezbiocloud進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析。
1.2.4盆栽實(shí)驗(yàn)將上海青種子進(jìn)行消毒處理后，播種于已高壓濕熱滅菌的土壤中。每個(gè)盆栽3株幼苗，待長(zhǎng)出兩葉一心時(shí)，對(duì)其作處理。將菌株在TSA培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落至裝有TSB液體培養(yǎng)基的瓶子中，30℃，200r/min培養(yǎng)24h后放置盆栽下方，用封口膜將盆栽裝置接口處封好，防止細(xì)菌產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物滲出，確保其能與植物的根部處于同一密閉空間。培養(yǎng)21d后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)量與記錄。
1.2.5頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法(headspacesolidphasemicroextraction/GC-MS，HS-SPME/GC-MS)分析菌株產(chǎn)生的VOCs成分1.2.5.1細(xì)菌樣品預(yù)處理將供試細(xì)菌GX14001在裝有TSB液體培養(yǎng)基的固相微萃取瓶中進(jìn)行活化培養(yǎng)，30℃，200r/min培養(yǎng)24h備用。
1.2.5.2萃取探針的預(yù)處理本實(shí)驗(yàn)選擇活性炭/聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯(ACAR/PDMS/DVB)復(fù)合涂層的固相微萃取探針，適合較寬范圍揮發(fā)性有機(jī)物的萃取。萃取探針使用前進(jìn)行老化，老化條件為260℃，60min。1.2.5.3GC-MS條件實(shí)驗(yàn)條件：載氣為He;不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣口溫度為230℃;爐溫起始為40℃，保持3min，以3℃/min升溫至140℃，保持2min;再以20℃/min升溫至230℃，保持2min;離子源為EI源;采用Nist08譜庫(kù)進(jìn)行檢索。
2結(jié)果
2.1菌株產(chǎn)生的VOCs對(duì)煙草的促生作用
對(duì)48株菌株進(jìn)行VOCs二分隔平板實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)14d后對(duì)煙草的生物量進(jìn)行測(cè)量與統(tǒng)計(jì)。研究發(fā)現(xiàn)，GX13594、GX13747、GX14001、GX14016、GX14066、GX14070、GX14201這7個(gè)菌株處理組的鮮重，根長(zhǎng)，側(cè)根數(shù)，葉片長(zhǎng)及葉片寬均顯著高于CK對(duì)照組(P<0.01)，結(jié)果表明這7個(gè)菌株所產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)煙草都具有明顯的促生作用。
3討論
微生物大致可通過(guò)直接和間接兩個(gè)促生機(jī)制來(lái)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[18]。其中直接促生機(jī)制主要是通過(guò)調(diào)整植物激素濃度，增加植物對(duì)養(yǎng)分的吸收以及釋放揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)來(lái)促進(jìn)植物的生長(zhǎng);間接促生機(jī)制是通過(guò)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性和抑制病原菌的入侵來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)[19]。與其他促生機(jī)制不同，微生物釋放的VOCs可以在不與植物進(jìn)行物理接觸的情況下，通過(guò)提高植物生物量、抗病(蟲(chóng))性和非生物脅迫耐性來(lái)發(fā)揮對(duì)植物的促生作用，這是其優(yōu)勢(shì)所在[20]。
本文主要研究了從海洋分離得到的橙色微桿菌GX14001的VOCs對(duì)植物生長(zhǎng)的促生作用，對(duì)其產(chǎn)生的VOCs成分及菌株的其他促生特性進(jìn)行了分析檢測(cè)。迄今為止，關(guān)于PGPR所釋放的VOCs對(duì)植物促生作用的研究大多以假單胞菌屬和芽孢桿菌屬為主，微桿菌屬的報(bào)道較少。
Cordovez等[21]研究表明微桿菌菌株EC8-VOCs通過(guò)調(diào)節(jié)植物根部硫和氮的代謝從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)，并且發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)植物生長(zhǎng)促進(jìn)具有組織特異性的。本文研究發(fā)現(xiàn)橙色微桿菌GX14001-VOCs能夠誘導(dǎo)植物葉片和鮮重增加，在模式植物本氏煙草和經(jīng)濟(jì)作物上海青中均有體現(xiàn)。對(duì)微生物產(chǎn)生的VOCs的收集和成分分析一般采用頂空固相微萃法[22]和氣相色譜-質(zhì)譜法。目前已報(bào)道的PGPR釋放的能促進(jìn)擬南芥生長(zhǎng)的VOCs主要有以下幾種：2，3-丁二醇以及合成2，3-丁二 醇的前體乙偶姻(3-羥基-2-丁酮)[3]，低濃度的1-己醇以及高濃度的正十五烷[23]，1-癸烯[10]等。
Velázquez-Becerra等[24]研究表明運(yùn)動(dòng)節(jié)桿菌UMCV2產(chǎn)生的二甲基正十六胺能促進(jìn)紫花苜蓿的生長(zhǎng)發(fā)育。Yamagiwa等[25]發(fā)現(xiàn)促進(jìn)植物生長(zhǎng)的真菌Talaromycessp.產(chǎn)生的β-石竹烯能夠有效促進(jìn)甘藍(lán)型油菜幼苗的生長(zhǎng)。Paul等[11]研究發(fā)現(xiàn)根際促生真菌CladosporiumcladosporioidesCL-1產(chǎn)生的VOCs， α-蒎烯、(-)反式-石竹烯、2，2，5，5-四甲基四氫呋喃、脫氫香橙烯以及(+)-苜蓿烯對(duì)煙草幼苗具有促進(jìn)能力。本實(shí)驗(yàn)篩選得到的GX14001所產(chǎn)生的VOCs經(jīng)GC-MS分析表明，與對(duì)照相比有7種特異性化合物，可分為苯基類和烷類化合物。其中烷類化合物有4-甲基-癸烷、十二烷、二十五烷和9-辛基-十七烷四類。
烷類化合物是目前已報(bào)道的具有活性的揮發(fā)性物質(zhì)，該GC-MS分析得到的十二烷和二十五烷曾在2017年被Jishma等報(bào)道是能促進(jìn)植物生長(zhǎng)的VOCs成分[26]。苯基類化合物有鄰乙基甲苯，1，2，3-三甲苯和1，2，4-三甲苯。苯基類化合物大都能在細(xì)菌/真菌的揮發(fā)性物質(zhì)中被檢測(cè)到，乙苯曾在生物測(cè)定實(shí)驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)具有殺蟲(chóng)作用[27]，最終結(jié)果表明十二烷，1，2，3-三甲苯，鄰乙基甲苯及二十五烷的含量相對(duì)較高，結(jié)合前人研究推測(cè)GX14001釋放的VOCs起主要促生作用的成分可能為十二烷及二十五烷，關(guān)于其他成分的具體作用還需進(jìn)一步分析研究。
微生物評(píng)職知識(shí)： 微生物處理污水論文發(fā)表期刊
4結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)二分隔平板實(shí)驗(yàn)及VOCs盆栽實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GX14001釋放的VOCs對(duì)煙草和上海青的根部及葉片的生長(zhǎng)都有顯著的促進(jìn)作用，該菌株經(jīng)16SrRNA分子生物學(xué)鑒定為橙色微桿菌。GC-MS結(jié)果顯示GX14001釋放的VOCs成分中起主要促生作用的成分為烷類。平板活性檢測(cè)結(jié)果顯示，GX14001菌株具有一定的溶磷和固氮作用，而產(chǎn)IAA能力較低。研究結(jié)果表明，該菌株促進(jìn)植物生長(zhǎng)主要是通過(guò)產(chǎn)生揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，通過(guò)對(duì)菌株其他活性的檢測(cè)表明橙色微桿菌是促進(jìn)植物生長(zhǎng)的多功能有效菌株。本項(xiàng)工作為微生物肥料的研制與開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。
參考文獻(xiàn)
[1]AdesemoyeAO,KloepperJW.Plant-microbesinteractionsinenhancedfertilizer-useefficiency[J].ApplMicrobiolBiotechnol,2009,85(1)：1-12.
[2]李俊,姜昕,馬鳴超,等.我國(guó)微生物肥料產(chǎn)業(yè)需求與技術(shù)創(chuàng)新[J].中國(guó)土壤與肥料,2019(2)：1-5.LiJ,JiangX,MaMC,etal.Developmentdemandandtechnicalinnovationforbio-fertilizerindustryinChina[J].SoilFertilSciChina,2019(2)：1-5.
[3]RyuCM,FaragMA,HuCH,etal.BacterialvolatilespromotegrowthinArabidopsis[J].PNAS,2003,100(8)：4927-4932.
[4]ZhangH,KimMS,KrishnamachariV,etal.RhizobacterialvolatileemissionsregulateauxinhomeostasisandcellexpansioninArabidopsis[J].Planta,2007,226(4)：839-851.
[5]RudrappaT,BiedrzyckiML,KunjetiSG,etal.TherhizobacterialelicitoracetoininducessystemicresistanceinArabidopsisthaliana[J].CommunIntegrBiol,2010,3(2)：130-138.[6]ZhangH,SunY,XieX,etal.Asoilbacteriumregulatesplantacquisitionofironviadeficiency-induciblemechanisms[J].PlantJ,2009,58(4)：568-577.
作者：高亞慧 姜明國(guó) 豐景 周桂
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