本文摘要：摘要：石油污染改變土壤微生態(tài)環(huán)境，驅(qū)動(dòng)了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的演替與進(jìn)化.為了深入探究油田區(qū)油污土壤中微生物群落分布特征，揭示區(qū)域性的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)成因，采用Miseq平臺(tái)的16SrDNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)分析了遼河油田和大慶油田區(qū)6組共計(jì)18個(gè)土壤樣品的微生物群落
摘要：石油污染改變土壤微生態(tài)環(huán)境，驅(qū)動(dòng)了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的演替與進(jìn)化.為了深入探究油田區(qū)油污土壤中微生物群落分布特征，揭示區(qū)域性的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)成因，采用Miseq平臺(tái)的16SrDNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)分析了遼河油田和大慶油田區(qū)6組共計(jì)18個(gè)土壤樣品的微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)組成，并結(jié)合土壤環(huán)境因子指標(biāo)剖析了群落結(jié)構(gòu)成因，進(jìn)而預(yù)測(cè)了具有石油代謝能力的功能菌屬.結(jié)果表明，石油含量隨著距井口距離增加而減少，石油的空間分布特征是影響微生物群落結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵因子，6組土壤樣品的OTU分屬于49門(mén)、131綱、169目、328科和564屬，微生物種群多樣性隨著污油濃度的增加而減小;兩油田共有5個(gè)相同優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，2種優(yōu)勢(shì)菌屬;遼河油田區(qū)獨(dú)特優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Saccharibacteria門(mén)，優(yōu)勢(shì)菌屬為微枝形桿菌屬(Microvirga)、分支桿菌屬(Mycobacterium)和Defluviicoccus屬;大慶油田獨(dú)特優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)，獨(dú)特優(yōu)勢(shì)菌屬包括鹽單胞菌屬(Halomonas)、食烷菌屬(Alcanivorax)和海桿菌屬(Marinobacter)等.冗余分析(RDA)結(jié)果表明污油組成是微生物群落差異性分布的決定性因素，膠質(zhì)的高含量與強(qiáng)毒性誘導(dǎo)遼河油田區(qū)微生物群落獲得較強(qiáng)的脅迫抗性;同時(shí)區(qū)域生態(tài)環(huán)境背景差異也是影響微生物群落整體脅迫抗性的重要因子.結(jié)合PICRUSt分析預(yù)測(cè)，共發(fā)現(xiàn)2種遼河油田區(qū)和5種大慶油田區(qū)石油功能降解優(yōu)勢(shì)菌屬，為石油降解功能菌劑的種質(zhì)資源的高效開(kāi)發(fā)提供目標(biāo)菌株.
關(guān)鍵詞：油田土壤;微生物群落;環(huán)境因子;污油組成;高通量測(cè)序
1引言(Introduction)
陸上石油開(kāi)采區(qū)土壤普遍存在石油污染，由于微生物的種群特征受底物種類和濃度的影響，導(dǎo)致土壤微生物群落發(fā)生不同程度的變化.石油作為特征污染底物，其侵入土壤中會(huì)封閉土壤孔隙，進(jìn)而影響土壤含氧量，使得好氧微生物活性降低，同時(shí)石油類污染物會(huì)影響土壤酶活性，影響微生物的代謝能力，有些微生物可以利用石油烴作為碳源迅速生長(zhǎng)，而有些微生物由于石油的毒害作用生長(zhǎng)受到抑制，從而影響了土壤微生物群落的豐度和多樣性(王梅等，2010;Khanetal.，2018;張澤霆等，2019;Koshlafetal.2019;徐春燕等，2020).
Gao等(2015)對(duì)黃河三角洲石油污染土壤的研究發(fā)現(xiàn)，土壤中微生物多樣性與石油烴濃度呈正相關(guān)，放線菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和棲熱菌門(mén)是該區(qū)域的優(yōu)勢(shì)菌群.Nakatsu等(2007)研究發(fā)現(xiàn)，土壤中微生物多樣性與多環(huán)芳烴濃度呈負(fù)相關(guān)，石油污染使得油井周邊土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生了改變.甄麗莎等(2015)研究發(fā)現(xiàn)，黃土高原土壤微生物多樣性會(huì)隨著石油含量的增加而降低，其原因在于一定濃度的石油污染可以刺激土壤微生物群落中具有石油污染物降解能力的優(yōu)勢(shì)種群的生長(zhǎng)，而對(duì)其耐受性較差的微生物種群生長(zhǎng)受到抑制被逐漸淘汰.
由此可見(jiàn)，石油對(duì)土壤的污染過(guò)程造就了差異化的土壤微生物群落特征，并提供了潛在的特異性種質(zhì)來(lái)源.針對(duì)土壤微生物群落特征的分析，已有研究多采用磷脂脂肪酸(PLFA)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、醌指紋和高通量擴(kuò)增子測(cè)序等技術(shù)，其中PLFA法通過(guò)分析微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定組分(PLFA)的種類及組成比例來(lái)鑒別土壤微生物結(jié)構(gòu)多樣性，但PLFAs并不能與土壤微生物物種一一對(duì)應(yīng)，且總體種類較少(姚曉東等，2016);DGGE法通過(guò)分析差異化的16SrDNA堿基序列揭示微生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，但由于其分離DNA片段大小限制在100～500bp，故分析序列量非常有限(馬悅欣等，2003);醌指紋法通過(guò)環(huán)境中微生物醌的組成來(lái)反映微生物群體組成，但其不能反映到屬水平(胡洪營(yíng)等，2002).
隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的發(fā)展，第二代測(cè)序(nextgenerationsequencing，NGS)技術(shù)因其具有低成本、高通量、速度快、精度高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于土壤微生物組成特征分析(張春蘭等，2012;郭魏等，2017;施昊坤等，2020).顧磊等(2017)應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)研究了玉北油田油氣富集帶微生物的豐度、分布和群落結(jié)構(gòu)等特征，并鑒定出假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和土壤桿菌屬是該區(qū)域利用烴類兼性生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)微生物.
楊琴等(2015)應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)長(zhǎng)慶油田石油污染土壤的石油降解菌群研究發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域檢測(cè)到包括變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和厚壁菌門(mén)等24個(gè)門(mén)的細(xì)菌，土壤菌群結(jié)構(gòu)由于長(zhǎng)期受石油污染的選擇壓力而發(fā)生了明顯改變.盡管目前對(duì)于特定油田區(qū)土壤微生物群落特征研究已有一定研究基礎(chǔ)，然而針對(duì)于具有地帶性差異的不同油田區(qū)的土壤微生物群落的對(duì)比研究還存在不足，尚未清晰認(rèn)知石油污染背景下的油田區(qū)土壤微生物群落地帶性特征，及其與環(huán)境因子的互作關(guān)系.
遼河油田地處遼寧省盤(pán)錦市，屬暖溫帶半濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫約10℃，年降水量約650mm，大慶油田地處黑龍江省大慶市，屬北溫帶半干旱大陸性季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫約5℃，年降水量約425mm，兩油田所處地理環(huán)境的特征具有較顯著的地帶性差異.
對(duì)此，本研究通過(guò)采集遼河油田和大慶油田的石油污染土壤樣品，借助高通量擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，展開(kāi)以下研究：①了解不同石油污染環(huán)境下土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)特征;②預(yù)測(cè)土壤中具有石油降解功能的功能菌群;③揭示不同油田區(qū)土壤生境條件與石油污染土壤微生物群落特征的互作關(guān)系，為不同油田區(qū)石油污染土壤微生物群落的地帶性分布研究從微生物地理學(xué)角度提供初步的理論基礎(chǔ)和方法學(xué)探索.與此同時(shí)，油田區(qū)特異性的微生物群落構(gòu)成特征也為進(jìn)一步的功能微生物種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)與利用提供理論指導(dǎo)，以便準(zhǔn)確高效的獲取具有底物代謝特異性的石油多組分降解功能菌株，促進(jìn)微生物修復(fù)技術(shù)的深入發(fā)展.
2材料與方法(Materialsandmethods)
2.1土壤樣品采集
供試土樣分別采自開(kāi)采20年以上年限的遼河油田某油井(41°04′39″N，121°43′20″E)和大慶油田某油井(46°31′36″N，124°58′02″E)周邊.樣品于2019年10月采集完成，采集方法為以井口為中心，通過(guò)放射狀布設(shè)采樣點(diǎn)位，分別采集距井口0、10、20m處表層(10～20cm)土壤樣品，樣品編號(hào)：遼河油田樣品記為L(zhǎng)1⁃1、L1⁃2、L1⁃3、L2⁃1、L2⁃2、L2⁃3、L3⁃1、L3⁃2、L3⁃3，大慶油田樣品記為D1⁃1、D1⁃2、D1⁃3、D2⁃1、D2⁃2、D2⁃3、D3⁃1、D3⁃2、D3⁃3，并將樣品按照距井口距離進(jìn)行分組，即劃分為6個(gè)樣品組：L1組(L1⁃1、L1⁃2、L1⁃3)、L2組(L2⁃1、L2⁃2、L2⁃3)、L3組(L3⁃1、L3⁃2、L3⁃3)、D1組(D1⁃1、D1⁃2、D1⁃3)、D2組(D2⁃1、D2⁃2、D2⁃3)和D3組(D3⁃1、D3⁃2、D3⁃3).采樣日前10d內(nèi)無(wú)降水，采樣地?zé)o積水，地表為無(wú)植被覆蓋的油田區(qū)典型原狀土壤，采集的樣品可以反映采樣區(qū)土壤性質(zhì)的常態(tài).樣品采集后分成兩部分，一部分保存在4℃條件下，用于污油含量和土壤理化性質(zhì)等指標(biāo)測(cè)定，另一部分于-20℃條件下保存，用于土壤微生物群落分析。
2.2土壤污油含量及族組分測(cè)定
土壤中污油含量采用重量法測(cè)定(王如剛等，2010).準(zhǔn)確稱取4g過(guò)0.25mm孔徑篩的土壤樣品混入于15mL三氯甲烷中，振蕩處理30min，靜置8h，55℃水浴加熱1h，再于4500r·min-1條件下離心5min，取上清液過(guò)濾至已稱至恒重的干燥燒杯(m0)中，剩余土壤參照上述流程重復(fù)提取2次，收集合并提取液，風(fēng)干后稱重(m1)，土壤樣品含油量(R)計(jì)算公式如下：R=(m1-m0)/4(1)石油族組分采用柱層析法測(cè)定(SY/T5119—1995).
以氧化鋁(70～200目，400℃活化4h)和硅膠(80～100目，140℃活化8h)為吸附劑，分別以正己烷、二氯甲烷與正己烷的混合液(V二氯甲烷∶V正己烷=2∶1)、三氯甲烷為洗脫劑，依次分離原油中瀝青質(zhì)、飽和烴、芳烴和膠質(zhì)，再采用重量法測(cè)定各組分含量.
2.3土壤理化性質(zhì)測(cè)定
參照《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》(魯如坤，1999)，土壤pH測(cè)定時(shí)以土水比1∶2.5(m∶V)混合振蕩30min后用pH計(jì)測(cè)定;土壤含水率采用烘干法(105℃)測(cè)定;總有機(jī)碳(TOC)測(cè)定時(shí)，將過(guò)60目篩的土樣經(jīng)鹽酸酸化去除無(wú)機(jī)碳后，再使用總有機(jī)碳/總氮分析儀(MultiN/C3100)測(cè)定;總氮(TN)采用凱式法測(cè)定;總磷(TP)采用堿熔⁃鉬銻抗比色法測(cè)定.
2.4土壤微生物
DNA提取和高通量測(cè)序使用FastDNASpinKitforSoil試劑盒提取土壤微生物總DNA.對(duì)16SrRNA基因的V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物選擇341F(5′⁃ACTCCTACGGGAGGCAGCAG⁃3′)和806R(5′⁃GGACTACHVGGGTWTCTAAT⁃3′).
PCR反應(yīng)體系(25μL)為：土壤總DNA30ng、引物341F/806R(5μmol·L-1)各1μL、BSA(2ng·μL-1)3μL、2×TaqPlusMasterMix12.5μL、ddH2O調(diào)整PCR總體積至25μL.擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共計(jì)28個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，72℃最終延伸7min.PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).高通量測(cè)序委托北京奧維森基因科技有限公司通過(guò)IlluminaMiseq測(cè)序平臺(tái)完成.測(cè)序結(jié)果已上傳至SRA數(shù)據(jù)庫(kù)(BioProjectID：PRJNA691428).
2.5數(shù)據(jù)處理和分析
在IlluminaMiseq測(cè)序平臺(tái)得到的下機(jī)數(shù)據(jù)(RawPE)，用Trimmomatic0.36、Pear0.9.6和Flash1.20軟件進(jìn)行質(zhì)量控制，過(guò)濾低質(zhì)量的fastq數(shù)據(jù)并拼接后得到rawtags，再通過(guò)Vsearch2.7.1軟件去除嵌合體，得到優(yōu)質(zhì)序列cleantags，采用Uparse方法進(jìn)行OTU(Operationaltaxonomicunits)聚類分析，對(duì)比Silva16SrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，采用RDPClassifier貝葉斯算法對(duì)97%相似度水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)各樣品的群落組成.基于OTU聚類結(jié)果計(jì)算各項(xiàng)Alpha多樣性指數(shù)。
3結(jié)果與分析(Resultsandanalysis)
3.1土壤石油污染特征分析
不同土壤樣品組的石油含量和各組分占比情況.兩個(gè)油田土壤樣品組中L1和D1的石油含量最高，分別達(dá)到14.50g·kg-1和7.23g·kg-1，兩個(gè)油田中土壤石油濃度L1>L2>L3、D1>D2>D3，說(shuō)明遼河油田和大慶油田油井周邊土壤中石油含量隨著距井口距離的增加而減小.族組分分析表明，遼河油田污油組分中膠質(zhì)所占比例最高，膠質(zhì)和瀝青質(zhì)總量平均占比達(dá)54.36%±1.82%，高于大慶油田(42.99%±0.67%)，而烷烴所占比例僅為30.86%±4.52%，顯著低于大慶油田(36.33%±3.34%)(p<0.01).
3.2土壤理化性質(zhì)分析
不同土壤樣品組的土壤理化性質(zhì).遼河油田和大慶油田土壤樣品組中pH和含水量比較均呈L1L2>L3、D1>D2>D3，表明兩個(gè)油田土壤的pH和含水率都隨著距井口距離的增加而增大，TOC含量則隨著距井口距離的增加而減小.兩個(gè)油田土壤的TN和TP含量較高，且在距井口不同距離的位置沒(méi)有明顯差別(p>0.05).
遼河油田土壤中的N、P營(yíng)養(yǎng)元素含量顯著高于大慶油田(p<0.05).土壤樣品的污油屬性和理化性質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果，結(jié)果表明，土壤中石油含量與TOC含量呈顯著正相關(guān)，與pH和含水量分別呈負(fù)相關(guān);TN、TP含量與烷烴和芳烴組分占比分別呈負(fù)相關(guān)，而與膠質(zhì)組分占比呈正相關(guān).
4討論(Discussion)
4.1油田土壤理化特性及石油污染特征
本研究發(fā)現(xiàn)，油田內(nèi)土壤受石油污染程度隨著距井口距離的增加而減小，張海玲等(2014)的研究結(jié)果表明油田土壤中石油含量隨著距油井水平距離的增大而減少.土壤中含水率和pH隨著石油含量的減小而增大，賈建麗等(2009)的研究結(jié)果表明，石油的強(qiáng)疏水性會(huì)導(dǎo)致具有高濃度石油含量土壤的疏水性較高，土壤儲(chǔ)水能力減弱，含水率降低.劉五星等(2007a)對(duì)南京某油井周邊土壤研究發(fā)現(xiàn)石油污染會(huì)引起土壤pH的下降，這與本研究的結(jié)果一致.
土壤中總有機(jī)碳含量在距離油井近處更高，這是因?yàn)橛捎诓捎突顒?dòng)產(chǎn)生的石油污染導(dǎo)致了土壤碳源的增加，而總氮和總磷的含量在同一油田內(nèi)各位置的差異不大，這與劉五星等(2007b)和王傳遠(yuǎn)等(2010)的研究結(jié)果相似.遼河油田污油與大慶油田污油的組分相比，遼河油田污油組分中膠質(zhì)和瀝青質(zhì)的占比更高，這是因?yàn)檫|河油田開(kāi)采的原油主要是稠油，而大慶油田開(kāi)采的原油主要是輕質(zhì)油，并且遼河油田開(kāi)采的主要是環(huán)烷基原油，而大慶油田為石蠟基原油，因此兩油田土壤污油中烷烴組分占比都遠(yuǎn)高于芳烴.
微生物在利用石油烴類碳源(烷烴和芳烴)時(shí)會(huì)消耗土壤中的N、P，因此土壤中烷烴和芳烴含量占比與TN、TP含量呈負(fù)相關(guān)，而膠質(zhì)由于生物可利用性較低，故呈現(xiàn)相反趨勢(shì).遼河油田土壤中的N、P含量高于大慶油田，這為土壤微生物的生長(zhǎng)提供了更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，與此同時(shí)，盤(pán)錦市屬暖溫帶大陸性半濕潤(rùn)季風(fēng)氣候區(qū)，氣候溫度適宜，降水充沛，而大慶市地處北溫帶亞干旱季風(fēng)氣候區(qū)，冬季漫長(zhǎng)，全年降水較少，故遼河油田地區(qū)生態(tài)環(huán)境為微生物提供了更優(yōu)質(zhì)的生存條件，使其微生物群落具有較強(qiáng)的抗脅迫能力.
4.2油田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征6個(gè)樣品組的OTU數(shù)目統(tǒng)計(jì)及多樣性指數(shù)分析結(jié)果表明，油田區(qū)土壤的微生物多樣性隨著距井口距離的減小而降低，究其原因主要為碳源及環(huán)境條件的不同，特定的微生物只能實(shí)現(xiàn)有限的石油烴類污染物的降解(馬思佳等，2017)，井口處土壤微生物在高濃度石油污染脅迫作用下多樣性降低.遼河油田和大慶油田的污油組成具有一定差異，其烴類含量及種類均很復(fù)雜，可誘導(dǎo)產(chǎn)生一定數(shù)目的稀有菌屬，L1和D1土壤樣品組中獨(dú)有的OTU數(shù)量可以對(duì)此有所佐證.
5結(jié)論(Conclusions)
1)油井周邊土壤微生物多樣性具有明顯的空間分布特征.距離井口越近，土壤中石油類污染物含量越高.烷烴、芳烴及膠質(zhì)作為污染土壤中的主要碳源，是決定微生物群落差異性分布的核心因素.遼河油田和大慶油田由于石油組分差異較大，導(dǎo)致兩個(gè)油田各自的微生物群落變異特征也有所不同，因此，土壤中石油的含量及其族組成是影響微生物群落結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵因子.
2)遼河和大慶兩油田區(qū)污染土壤微生物群落存在異同特征.相同的是兩個(gè)油田的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均包括變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)和硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirae)，相同優(yōu)勢(shì)菌屬為Pseudarthrobacter屬和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas).差異是遼河油田獨(dú)特優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Saccharibacteria門(mén)，優(yōu)勢(shì)菌屬為Defluviicoccus屬、微枝形桿菌屬(Microvirga)和分支桿菌屬(Mycobacterium);大慶油田獨(dú)特優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)，優(yōu)勢(shì)菌屬為Salinimicrobium屬、鹽單胞菌屬(Halomonas)、Idiomarina屬、游動(dòng)球菌屬(Planomicrobium)、食烷菌屬(Alcanivorax)和海桿菌屬(Marinobacter).
3)污染物毒性是土壤中微生物結(jié)構(gòu)變化的主要驅(qū)動(dòng)因子，同時(shí)生態(tài)環(huán)境背景狀況也是重要影響因素.遼河油田石油污染物中膠質(zhì)含量高，毒性較大，但該地區(qū)生態(tài)環(huán)境較好，因此井口附近的微生物群落具有較強(qiáng)的抗脅迫能力，而大慶油田則表現(xiàn)出相反的現(xiàn)象，即脆弱生態(tài)環(huán)境下的微生物群落受污染物的影響更大.
4)微生物群落結(jié)構(gòu)的變化反映了微生物的適應(yīng)性.在石油污染的脅迫作用下誘導(dǎo)產(chǎn)生具有底物靶向性的石油降解功能菌群;發(fā)現(xiàn)7種菌屬可能具有降解石油污染物的功能，可作為未來(lái)靶向性功能菌株篩選目標(biāo)，其中2種為遼河油田區(qū)優(yōu)勢(shì)菌屬：分支桿菌屬(Mycobacterium)、Defluviicoccus屬;5種為大慶油田區(qū)優(yōu)勢(shì)菌屬：海桿菌屬(Marinobacter)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、Idiomarina屬、Salinimicrobium屬和食烷菌屬(Alcanivorax).
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作者：荊佳維1，2，3，王卅1，3，郭書(shū)海1，3，∗
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