混合菌群調(diào)節(jié)果蠅產(chǎn)卵偏嗜性

　　摘要：【目的】利用果蠅產(chǎn)卵偏嗜性作為評價指標，研究影響混合菌群平衡的因素及競爭機制，并揭示混合菌對果蠅后代存活率的影響�！痉椒ā繉⒅参锶闂U菌(Lactobacillusplantarum)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和二者混合菌發(fā)酵處理酪蛋白瓊脂食物;利用雙向選擇產(chǎn)卵器檢測成年雌性果蠅的產(chǎn)卵偏嗜性;平板計數(shù)法檢測細菌數(shù)量;通過蛹存活率探究兩菌互作對果蠅存活率的影響。【結(jié)果】在37℃發(fā)酵果蠅食物，果蠅喜歡在植物乳桿菌底物上產(chǎn)卵，而厭惡在大腸桿菌底物上產(chǎn)卵，同時對等比例混合菌具有顯著的產(chǎn)卵避性，產(chǎn)卵指數(shù)為-0.46，說明果蠅產(chǎn)卵偏嗜性可作為一個研究混合菌群平衡的模型。增加混合菌中植物乳桿菌比例可降低果蠅產(chǎn)卵避性，甚至逆轉(zhuǎn)，說明接種比例影響著菌群平衡。涂板計數(shù)證實，大腸桿菌數(shù)量在培養(yǎng)基中占據(jù)優(yōu)勢，是植物乳桿菌的4.43倍，所以引起果蠅產(chǎn)卵避性。當植物乳桿菌與大腸桿菌等比例混合后改變培養(yǎng)溫度，25℃對應(yīng)的產(chǎn)卵指數(shù)為0.41，30℃對應(yīng)的產(chǎn)卵指數(shù)為-0.06，35℃對應(yīng)的產(chǎn)卵指數(shù)為-0.45，說明溫度影響著菌群平衡。植物乳桿菌代謝物，特別是乳酸可抑制大腸桿菌生長，從而間接地調(diào)控果蠅產(chǎn)卵偏嗜性。大腸桿菌占據(jù)著優(yōu)勢時，蛹存活率僅為14%，而植物乳桿菌占據(jù)著優(yōu)勢時，蛹存活率為91%，說明混合菌生長平衡影響果蠅存活率�！窘Y(jié)論】接種比例與溫度是影響菌群平衡的關(guān)鍵因素，果蠅根據(jù)菌群平衡而調(diào)整其產(chǎn)卵行為，以提高后代的存活率。

　　關(guān)鍵詞:植物乳桿菌，大腸桿菌，接種比例，溫度，產(chǎn)卵偏嗜性，存活率

　　大多數(shù)自然環(huán)境都存在著大量的微生物。最近，分子生物學(xué)方法，如宏基因組測序和深度微生物標記測序，已經(jīng)揭示了微生物的多樣性和復(fù)雜性。在菌群中細菌個體間不斷發(fā)生著相互交流，產(chǎn)生社會行為，這些信息可塑造微生物群落的結(jié)構(gòu)平衡。

　　在這些社會行為中，最為顯著的關(guān)系便是競爭，細菌之間相互爭奪有限的空間和資源，可以抑制甚至殺死其他微生物[1]。通常認為，數(shù)量上占優(yōu)勢的微生物種群源自一個高度多樣化、低豐度的起始種群。某些稀有成員在適宜的條件下快速增殖，可以實現(xiàn)種群爆發(fā)，打破原有平衡，成為優(yōu)勢種群[2]。因此，揭示影響群落成員的因素對理解和調(diào)控菌群平衡具有重要研究和應(yīng)用價值。

　　然而，自然群落復(fù)雜而又多變，直接研究它會困難重重，亟需某些模式菌種構(gòu)建研究模型。果蠅的共生菌種類較為繁多[3]，多達20多種，廣義上既包括益生菌，如植物乳桿菌和腸球菌等，又包括有害細菌，如條件致病菌大腸桿菌和真菌等[4]。研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌在果蠅腸道內(nèi)能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，特別是乳酸，能維持果蠅腸道內(nèi)低pH環(huán)境，抑制大腸桿菌的生長與繁殖[5]。同時，植物乳桿菌具有提高機體免疫力、維持腸道內(nèi)菌群平衡和促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收等多種作用[6]。大腸桿菌是腸桿菌科革蘭陰性菌，主要棲生于人和動物大腸內(nèi)。

　　其既能在宿主體內(nèi)生存,也能吸附在環(huán)境中固體介質(zhì)表面，形成生物膜而得以存活和傳播[7]。大腸桿菌是果蠅體內(nèi)的條件致病菌，當大腸桿菌過度繁殖時，會阻礙果蠅卵的生長和發(fā)育，甚至導(dǎo)致其死亡[8]。這兩種細菌常存在于果蠅體內(nèi)和周圍，但目前仍然不清楚哪些因素可以影響二者之間競爭平衡。盡管高通量測序可以解析菌落物種結(jié)構(gòu)和平衡，然而迄今為止尚缺乏一種簡單易行的檢測微生物競爭結(jié)果的指示方法，正成為后基因組時代的一大挑戰(zhàn)。由于果蠅產(chǎn)卵需要消耗母體大量的能量和營養(yǎng)，并且幼蟲運動能力弱，容易遭受天敵攻擊。

　　因此，為促進后代的生長和發(fā)育，雌性果蠅在產(chǎn)卵之前，必須利用多種感覺系統(tǒng)[9]，并且綜合多種因素，最終才會選擇在適宜的地方產(chǎn)卵[10-11]。果蠅產(chǎn)卵的選擇是果蠅一個非常重要的行為，該行為易于觀察和量化，對刺激敏感，并且抗外界干擾因素強，可為我們提供一個生物指示劑以研究菌群平衡[11]。因此，本研究嘗試將果蠅作為指示生物，通過其產(chǎn)卵選擇性判斷菌群平衡，并進一步探討影響混合菌群平衡的因素及競爭機制。

　　1材料和方法

　　1.1果蠅品系與培養(yǎng)方法

　　本研究選用野生型黑腹果蠅品系OregonR(OR)和CantonS(CS)作為實驗材料。如無特別說明，所有果蠅均培養(yǎng)在溫度25℃、相對濕度60%的恒溫箱中，培養(yǎng)光周期為12L：12D[12]。在通常情況下，果蠅使用玉米-酵母培養(yǎng)基飼養(yǎng)，由于酵母粉中成分復(fù)雜，為避免酵母對果蠅產(chǎn)卵行為的影響，行為學(xué)分析中使用的果蠅食物為水解酪蛋白-蔗糖-瓊脂培養(yǎng)基。

　　1.2試劑與儀器

　　試劑：Walch消毒液(廣州威萊);次氯酸(Sigma);酵母(安琪);MRS瓊脂培養(yǎng)基;麥康凱瓊脂培養(yǎng)基。儀器：25℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱(恒豐,WS-01Y);天平(DenverInstrument,XE-310);顯微鏡(OlympusSZX7;NikonSMZ745T);低溫高轉(zhuǎn)速離心機(上海力申，Neofuge13R);分光光度計(島津，UV-1800)。

　　1.3菌落培養(yǎng)

　　1.3.1菌株來源：植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和大腸桿菌(Escherichiacoli)均為本實驗室前期分離和鑒定的菌株，對應(yīng)的NCBI編號為KY038178[13]和ATCC25922[8]。

　　1.3.2不同溫度下培養(yǎng)：控制兩菌接種量一致，分別從OD值為1的培養(yǎng)瓶中各取兩菌原菌液1mL，離心后棄上清液加入PBS磷酸鹽溶液震蕩洗滌，再離心，重復(fù)兩次;加入100mLPBS，超凈臺中將兩菌株混合，涂布固體平板酪蛋白食物表面后裝入盛有沾水紗布的密封袋中，分別放入25℃、30℃、35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h;培養(yǎng)完成后在-80℃下速凍24h，解凍準備實驗。

　　1.3.3不同接種比例培養(yǎng)：控制培養(yǎng)溫度一致，取OD值均為1的兩菌原菌液1mL，按上述步驟離心洗滌兩次后，加入100mPBS，通過倍比稀釋，將原菌液稀釋至適合濃度后接種。

　　1.3.4乳酸平板食物培養(yǎng)：制作空白酪蛋白食物時，食物滅菌后超凈臺中加入乳酸，振蕩搖勻，乳酸食物濃度分別為25、50、75、100mmol/L，制作平板食物，培養(yǎng)步驟同空白組相同。

　　1.4混合菌落計數(shù)

　　檢測平板食物表面發(fā)酵后兩菌數(shù)量，超凈臺中取發(fā)酵后的平板食物1/4，放入盛有10mLPBS緩沖液中震蕩搖勻，取100m，倍比稀釋后注入選擇性固體培養(yǎng)基MRS和麥康凱，涂布均勻后培養(yǎng)計數(shù)植物乳桿菌和大腸桿菌數(shù)目。

　　1.5果蠅產(chǎn)卵行為檢測

　　實驗選用中空透明圓柱體為雙向產(chǎn)卵裝置，高80mm、直徑60mm，底部放入用于產(chǎn)卵的培養(yǎng)皿[14]。果蠅食物經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，稍許冷卻倒入平板。將100m無菌水或混合菌群涂布食物表面，密封袋中規(guī)定溫度下培養(yǎng)48h。用刀片沿中線切為兩半，無差別拼裝成雙選擇果蠅產(chǎn)卵培養(yǎng)基。每個產(chǎn)卵器中放入黑腹果蠅雌性20只雄性10只，使用酵母平板育肥2-3d;無傷害放入產(chǎn)卵器產(chǎn)卵12h，產(chǎn)卵結(jié)束取下食物平板，顯微鏡下計數(shù)果蠅胚胎數(shù)量。產(chǎn)卵指數(shù)(OI)=(實驗組卵數(shù)-對照組卵數(shù))/(實驗組卵數(shù)+對照組卵數(shù))[12]。

　　1.6存活率實驗

　　使用酵母膏育肥果蠅后將其轉(zhuǎn)移至產(chǎn)卵裝置中，用葡萄汁瓊脂板(700mLH2O，300mL葡萄汁，30g瓊脂，30g蔗糖)收集8h新產(chǎn)的卵，分別轉(zhuǎn)移40粒卵對照組和實驗組食物上，在培養(yǎng)箱中規(guī)定條件下孵育，每天記錄胚胎成蛹數(shù)量及成蛹后羽化數(shù)量。存活率=蛹或成蟲數(shù)目/總卵數(shù)目×100%。實驗重復(fù)3次。

　　1.7數(shù)據(jù)分析與作圖

　　使用Excel軟件整理分析數(shù)據(jù)，每組數(shù)據(jù)得平均值(mean)和標準誤(SE)，用SPSS24.0軟件對各處理組間的差異進行t檢驗分析(Studentt-test)。用GraphPad和AdobeIllustrator軟件完成相關(guān)圖的制作。

　　2結(jié)果和分析

　　2.1混合菌影響果蠅產(chǎn)卵偏嗜性

　　分別將植物乳桿菌、大腸桿菌和二者1：1混合涂布到果蠅食物上，37℃培養(yǎng)48h，處理后食物與對照組食物拼接成雙選擇產(chǎn)卵地點，分別檢測上述三種處理對果蠅產(chǎn)卵偏嗜性的影響。實驗結(jié)果顯示，雌性野生型果蠅OregonR(OR)將88.5%卵產(chǎn)在植物乳桿菌培養(yǎng)的食物一側(cè)，產(chǎn)卵指數(shù)(ovipositionindex，OI)為0.77，說明植物乳桿菌可吸引果蠅產(chǎn)卵。相反，果蠅將90%卵產(chǎn)在大腸桿菌培養(yǎng)的食物一側(cè)，OI為-0.80，說明大腸桿菌排斥果蠅產(chǎn)卵。

　　以上結(jié)果說明不同種細菌可以引起果蠅截然相反的產(chǎn)卵偏好性。另一個野生品系CantonS(CS)對植物乳桿菌、大腸桿菌處理后食物的OI分別為0.81和-0.84，與上述OR果蠅產(chǎn)卵偏嗜性一致，可排除果蠅遺傳背景的影響，也與包括我們在內(nèi)的前人報道相一致[8,13]，說明這種產(chǎn)卵偏嗜性為果蠅特有的行為。這兩種細菌可分別作為吸引和排斥果蠅產(chǎn)卵的代表性菌株，為研究混合菌群影響果蠅產(chǎn)卵偏嗜性提供了很好的素材。首先等比例混合植物乳桿菌和大腸桿菌，然后將混合菌接種到果蠅食物，檢測果蠅產(chǎn)卵偏嗜性。

　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當植物乳桿菌與大腸桿菌等比例時，果蠅的OI為-0.46，介于兩者單純培養(yǎng)的OI之間，仍然具有強烈的產(chǎn)卵避性，說明大腸桿菌排斥產(chǎn)卵效應(yīng)占據(jù)優(yōu)勢，大于植物乳桿菌吸引產(chǎn)卵效應(yīng)，最終表現(xiàn)出果蠅產(chǎn)卵避性。同樣，植物乳桿菌與大腸桿菌等比例混合引起CS果蠅產(chǎn)卵避性，果蠅的OI介于兩者單純培養(yǎng)的OI之間。以上結(jié)果說明，純菌株和混合菌可作為重要因子而影響果蠅產(chǎn)卵偏嗜性。

　　3討論

　　自然界或生物體內(nèi)都存在著大量的微生物，它們復(fù)雜且多樣，在空間上和時間上都是動態(tài)變化的。在菌群中細菌個體間在不斷發(fā)生著信息交流，影響微生物群落的平衡。在菌群中不僅有群落內(nèi)部的交流，細菌也會和外界進行信息交流，對外界不斷變化的環(huán)境條件做出反應(yīng)，協(xié)調(diào)各自基因的表達，實現(xiàn)動態(tài)平衡[15]。

　　揭示影響菌群平衡的因素對理解和調(diào)控菌群平衡具有重要的研究價值。以益生菌植物乳桿菌與條件致病菌大腸桿菌構(gòu)建研究模型，研究影響菌群平衡的因素以及對果蠅的產(chǎn)卵行為的影響。首先，在37℃，黑腹果蠅對植物乳桿菌和大腸桿菌具有產(chǎn)卵趨向性和產(chǎn)卵避性，將植物乳桿菌與大腸桿菌等比例混合時，OI為-0.46，介于兩者單獨培養(yǎng)的OI之間，仍具有產(chǎn)卵避性。改變細菌的初始接種比例可以改變甚至逆轉(zhuǎn)果蠅的產(chǎn)卵偏嗜性。

　　在初始接種數(shù)量增加到一定程度時，即使在相同條件下生長情況處于劣勢，也會逆轉(zhuǎn)劣勢成為優(yōu)勢菌。菌群中細菌占據(jù)數(shù)量優(yōu)勢成為優(yōu)勢菌之后，對果蠅的產(chǎn)卵效應(yīng)也占據(jù)優(yōu)勢�；旌暇�中植物乳桿菌和大腸桿菌的最適生長溫度不同，因此我們推測溫度也是影響菌群平衡的重要因素。25℃，植物乳桿菌與大腸桿菌等比例混合時，果蠅OI為0.41，表現(xiàn)出吸引效應(yīng)，與35℃時恰好相反。此時菌落數(shù)量也顯示植物乳桿菌數(shù)量占據(jù)優(yōu)勢，說明溫度影響植物乳桿菌與大腸桿菌的相互競爭，低溫能賦予植物乳桿菌以競爭優(yōu)勢。并且接種比例與溫度能互作而影響果蠅產(chǎn)卵偏嗜性，低溫和接種數(shù)量優(yōu)勢下OI要高于兩者單獨情況下的OI。

　　在有限的空間和資源下，菌群中不同細菌會形成不同的社會關(guān)系，其中最為顯著的便是共生與競爭，在共生中細菌間既有求同也有存異[16]，而在競爭中細菌之間為爭奪有限的空間和資源，可以抑制甚至殺死其他微生物[17]。混合菌中益生菌植物乳桿菌和條件致病菌大腸桿菌呈相互競爭狀態(tài)，植物乳桿菌可抑制大腸桿菌的生長。在30℃，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌的代謝產(chǎn)物，特別是乳酸可以抑制大腸桿菌的生長，而植物乳桿菌滅活細胞則不具備這種作用。植物乳桿菌的代謝產(chǎn)物能影響混合菌的生長平衡，繼而調(diào)控果蠅產(chǎn)卵的偏好性。微生物能提高果蠅后代的存活率[18]，混合菌中植物乳桿菌占據(jù)優(yōu)勢時，蛹存活率顯著提高，而大腸桿菌占據(jù)優(yōu)勢時蛹存活率極低，混合菌群的平衡能影響果蠅后代的存活率。

　　我們的研究結(jié)果表明，接種比例和溫度是影響菌群平衡的重要因素，而菌群平衡能調(diào)控果蠅的產(chǎn)卵行為，影響其后代的存活率。本研究闡述了影響菌群平衡的重要因素以及混合菌群互作的機制，為混合菌群方面的研究做了很好的鋪墊，具有重要的理論意義。通過改變一些外部條件來調(diào)節(jié)菌群的生長平衡，使菌群朝著有利于宿主的方向生長是一個很好的利用菌群的思路。

　　參考文獻

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　　作者：王子光1#，門捷2#，張津1，黃永存3*，劉威2,4*

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