本文摘要：摘要：為探究水產(chǎn)養(yǎng)殖中養(yǎng)殖不同物種對(duì)水體和沉積物中細(xì)菌群落的影響，本文以養(yǎng)殖克氏原螯蝦(Procambarusclarkii，PC)和中華鱉(Pelodiscussinensis，PS)的水體和沉積物樣品為研究對(duì)象，利用基于16SrRNA基因的高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)細(xì)菌群落多樣性和群落組成進(jìn)行分析，并結(jié)
摘要：為探究水產(chǎn)養(yǎng)殖中養(yǎng)殖不同物種對(duì)水體和沉積物中細(xì)菌群落的影響，本文以養(yǎng)殖克氏原螯蝦(Procambarusclarkii，PC)和中華鱉(Pelodiscussinensis，PS)的水體和沉積物樣品為研究對(duì)象，利用基于16SrRNA基因的高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)細(xì)菌群落多樣性和群落組成進(jìn)行分析，并結(jié)合環(huán)境因子，探究水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)細(xì)菌群落的影響。結(jié)果顯示，水體和沉積物中細(xì)菌群落的α多樣性均呈現(xiàn)PS>PC的顯著差異(P<0.05)。非度量多維尺度分析的結(jié)果顯示，PC和PS區(qū)的水體和沉積物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均呈現(xiàn)明顯差異。冗余分析(RDA)的結(jié)果表明，水體氨氮(NH+4⁃N)和硝酸鹽氮(NO-3⁃N)是影響水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的最主要環(huán)境因子，沉積物總氮(TN)、總磷(TP)和有機(jī)碳(OC)均對(duì)沉積物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響(P<0.05)。PC和PS區(qū)中的細(xì)菌隸屬于34門(mén)、114綱、258目、504科和955屬，水體中共篩選出了11個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)(相對(duì)豐度>0.5%)，沉積物中篩選出了13個(gè)。2個(gè)養(yǎng)殖區(qū)域的水體樣品中共篩選出了15個(gè)優(yōu)勢(shì)(相對(duì)豐度>1%)操作分類(lèi)單元(OperationalTaxonomicUnit，OTU)，其中有9個(gè)具有脫氮除磷或去除有機(jī)質(zhì)的作用，它們分別屬于叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)、腐螺旋菌科(Saprospiraceae)、嗜甲基菌屬(Methylophilus)、放線菌目(Actinomycetales)和沉積桿菌屬(Sediminibacterium)。整體上，這9個(gè)優(yōu)勢(shì)OTUs在PC區(qū)中的相對(duì)豐度更高，并且與氨氮(NH+4⁃N)和硝酸鹽氮(NO-3⁃N)的相關(guān)性較強(qiáng)。同時(shí)，在沉積物樣品中篩選出了7個(gè)優(yōu)勢(shì)OTUs，其中有3個(gè)主要參與氮循環(huán)，它們分別屬于Dechloromonas屬、Prolixibacteraceae科和厭氧繩菌科(Anaerolineaceae)。此外，在水體樣品中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)優(yōu)勢(shì)OTUs為致病菌，分別屬于黃桿菌屬(Flavobacterium)和多核桿菌屬(Polynucleobacter)。綜合以上分析，養(yǎng)殖不同物種會(huì)對(duì)水體和沉積物中細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同影響。
關(guān)鍵詞：水產(chǎn)養(yǎng)殖;細(xì)菌;高通量測(cè)序技術(shù);群落多樣性;群落組成
水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是農(nóng)業(yè)的重要組成部分，也是全球最大的食品產(chǎn)業(yè)之一[1]。近年來(lái)，克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)、中華鱉(Pelodiscussinensis)等重要淡水物種的人工養(yǎng)殖發(fā)展迅速[2]。
克氏原螯蝦隸屬于十足目(Decapoda)、螯蝦科(Astacidae)[3]，是我國(guó)養(yǎng)殖最廣的淡水螯蝦品種[4]。中華鱉屬龜鱉目(Testudinata)、鱉科(Trionychidae)[5]，在我國(guó)分布廣泛，藥用價(jià)值極高，是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖物種之一[6]。細(xì)菌是生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分[7]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，細(xì)菌既能作為分解者降解養(yǎng)殖動(dòng)物無(wú)法利用的有機(jī)質(zhì)，又可以作為養(yǎng)殖動(dòng)物的直接或間接餌料[8]。此外，細(xì)菌群落對(duì)環(huán)境的變化十分敏感，其與周?chē)沫h(huán)境因子相互作用、往復(fù)調(diào)控[9]。
在水產(chǎn)養(yǎng)殖的水體中，細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)、多樣性等均隨水環(huán)境的變化而改變，水體細(xì)菌群落的變化又會(huì)對(duì)水環(huán)境造成影響[10]，因此，對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境中的水體細(xì)菌群落進(jìn)行深入研究具有重要意義[11]。除養(yǎng)殖水體外，沉積物也是細(xì)菌附著的主要介質(zhì)[12]。大量的細(xì)菌富集于沉積物中，通過(guò)同化、異化等代謝過(guò)程來(lái)影響沉積物中營(yíng)養(yǎng)鹽的分布、轉(zhuǎn)化和利用等[13]。因此，沉積物中的細(xì)菌群落可以作為水環(huán)境變化和演替的重要標(biāo)志[14]，探究水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)沉積物中細(xì)菌群落的影響也具有重要意義。近年來(lái)，快速發(fā)展的高通量測(cè)序技術(shù)由于其具有通量大、測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)成為準(zhǔn)確、便捷和全面地研究養(yǎng)殖系統(tǒng)中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成的研究手段之一[15]。
胡常巨等人[16]利用高通量測(cè)序技術(shù)探究網(wǎng)箱養(yǎng)殖對(duì)水環(huán)境細(xì)菌群落的影響，表明養(yǎng)殖活動(dòng)顯著改變了養(yǎng)殖水環(huán)境中浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。陶玲[11]利用高通量測(cè)序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，稻田—池塘復(fù)合循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)與常規(guī)池塘養(yǎng)殖系統(tǒng)中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。但目前的研究大多是對(duì)比水產(chǎn)養(yǎng)殖(或某種特殊的養(yǎng)殖系統(tǒng)，如循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng))和天然水體細(xì)菌群落的差異[17—18]，鮮有研究利用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)養(yǎng)殖不同物種的水環(huán)境細(xì)菌群落進(jìn)行深入探究。而水產(chǎn)養(yǎng)殖不同物種對(duì)水環(huán)境中的細(xì)菌群落可能產(chǎn)生完全不同的影響[19]。不同物種的生活習(xí)性和管理方式等可能會(huì)對(duì)細(xì)菌群落產(chǎn)生不同的影響，而不同的細(xì)菌群落又可能會(huì)對(duì)養(yǎng)殖水環(huán)境或作物產(chǎn)生不同的影響[20]。
因此，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)養(yǎng)殖不同物種的水體和沉積物中細(xì)菌群落進(jìn)行深入研究，對(duì)探究水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)水環(huán)境中細(xì)菌群落的影響有著重要意義�？耸显r和中華鱉是兩種在生理特性、生活習(xí)性及管理方式等方面具有明顯差異的淡水養(yǎng)殖物種�？耸显r是雜食性動(dòng)物，生長(zhǎng)發(fā)育較快，挖洞能力強(qiáng)，抗逆力很強(qiáng)，能生活在一些輕度污廢水中[21]。
中華鱉以肉食為主，生長(zhǎng)發(fā)育相對(duì)緩慢，繁殖力低，具有上岸曬背的習(xí)性[5，22]。因此，我們預(yù)期養(yǎng)殖這兩種作物會(huì)對(duì)水體和沉積物產(chǎn)生不同的影響。綜上，本研究以養(yǎng)殖不同物種(克氏原螯蝦和中華鱉)的水體和沉積物細(xì)菌群落為研究對(duì)象，以基于16SrRNA基因的高通量測(cè)序技術(shù)為研究方法，揭示了養(yǎng)殖不同物種的水體和沉積物間細(xì)菌群落α多樣性、群落組成和優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的異同，以期為養(yǎng)殖環(huán)境的維護(hù)和改善提供參考。
1材料與方法
1.1樣品采集
本次研究的水體和沉積物樣品均采集于江蘇省省級(jí)精品漁業(yè)園(119°01′48″E，32°13′51″N)的多年輪作稻田(Oryzasativa：亞洲栽培稻)濕地。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，利用不銹鋼板將該濕地劃分為兩個(gè)區(qū)域，分別投放克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)和中華鱉(Pelodiscussinensis)，并根據(jù)養(yǎng)殖物種分別命名為PC和PS區(qū)。該濕地首次嘗試稻-蝦/鱉共作的模式。
PC和PS區(qū)均于2019年5月上旬進(jìn)行水稻播種;6月底水稻插秧;7月上旬水稻進(jìn)入返青分蘗期，此時(shí)投放幼蝦(20—30kg/hm2)和幼鱉(1500只/hm2);11月底收割水稻(共產(chǎn)出水稻360kg);12月底—2020年1月初打撈克氏原螯蝦和中華鱉。
為保證PC和PS區(qū)中的本底微生物多樣性和結(jié)構(gòu)相似，兩塊稻田濕地的面積(5328m2)、種植密度(46%)、管理方式和灌溉用水等均保持一致。為探究養(yǎng)殖不同作物對(duì)水體和沉積物細(xì)菌群落的影響，于養(yǎng)殖周期結(jié)束后(2020年1月)在上述2個(gè)區(qū)域中，各選擇6個(gè)采樣點(diǎn)，分別利用不銹鋼采水器(HAD-WB-SS)和抓斗式采泥器(CN⁃100)采集水體(水面以下30—50cm)和表層沉積物(0—3cm)樣品。
為避免水稻根系微生物對(duì)沉積物樣品的影響，在采集沉積物樣品時(shí)，我們盡量避開(kāi)水稻生長(zhǎng)的地方，并確保所采集的樣品中無(wú)水稻根系。收集到樣品后，利用保溫箱(4℃)冷藏，快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。利用YSI6600(YSI6600，YellowSprings，美國(guó))對(duì)水體的溫度(T)、pH和溶解氧濃度(DO)分別進(jìn)行原位測(cè)定。
1.2樣品預(yù)處理
樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，利用真空冷凍干燥機(jī)(LABCONCO，美國(guó))凍干沉積物樣品，并在樣品凍干后進(jìn)行研磨和過(guò)篩(35目土壤篩)。取部分水體樣品，用0.22μm的硅膠微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，分別冷凍保存濾膜和濾液于超低溫冰箱中(-70℃)。
1.3樣品理化指標(biāo)測(cè)定
水體的總氮(TN)和總磷(TP)濃度使用原水樣采用堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法(HJ636—2012)進(jìn)行測(cè)定[23]。水體的氨氮(NH+4⁃N)和硝酸鹽氮(NO-3⁃N)濃度使用過(guò)濾后的水樣通過(guò)流動(dòng)注射儀(San++，SKALAR，荷蘭)測(cè)定[24]。水體化學(xué)需氧量(COD)使用原水樣利用重鉻酸鉀法(HJ828—2017)[25]進(jìn)行測(cè)定。沉積物的總氮(TN)和總磷(TP)濃度也采用堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法(HJ636—2012)進(jìn)行測(cè)定[23]。使用重鉻酸鉀氧化-分光光度法(HJ615—2011)[26]測(cè)定沉積物的有機(jī)碳濃度(OC)。
1.4DNA提取及高通量測(cè)序
水體濾膜和沉積物樣品分別采用E.Z.N.A.
采用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證所提取的DNA樣品。使用引物對(duì)515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG⁃3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT⁃3′)對(duì)16SrRNA基因的高可變區(qū)V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增[29]。PCR擴(kuò)增體系為20μL(0.8μL上下游引物、10ngDNA模板、2μLdNTP、0.4μLFastPfu酶，及無(wú)菌蒸餾水)，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5°C預(yù)變性2min，25次的擴(kuò)增循環(huán)(95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s)，并最終在72°C下延伸5min[30]。
PCR產(chǎn)物合并后通過(guò)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化和定量后，由諾禾致源生物科技有限公司(北京)利用IlluminaMiseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)定。本研究所獲得的所有細(xì)菌基因序列均已上傳到NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中，序列登記號(hào)為PRJNA698288。
測(cè)序結(jié)果使用QIIME(v1.9.1)進(jìn)行處理[31]，使用“trim”功能篩選出截?cái)嘧x數(shù)超過(guò)10bp且配對(duì)成功的序列[32]。然后使用FLASH(v1.0.0)拼接序列[33]，再使用QIIME(v1.9.1)中的“vsearch”功能查找并去除嵌合體[34]，使用“pick_de_novo_otus.py”命令，根據(jù)3%的差異原則劃分操作分類(lèi)單元(OperationalTaxonomicUnits，OTU)[35]。
對(duì)照SILVA16SrRNA基因數(shù)據(jù)庫(kù)(SILVA123_QIIME_release，2016)[36]，匹配分類(lèi)學(xué)信息。使用“filter_taxa_from_otu_table.py”命令去除非細(xì)菌序列和序列數(shù)不高于總序列數(shù)0.0005%的稀有OTU[37]，使用“parallel_align_seqs_pynast.py”命令計(jì)算進(jìn)化樹(shù)，最后使用“multiple_rarefactions_even_depth.py”命令對(duì)最終完善的文件進(jìn)行重采樣，并導(dǎo)出最終的OTU表。
基于OTU表，在QIIME(v1.9.1)中使用“alpha_diversity.py”計(jì)算ObservedOTUs和Shannon指數(shù)來(lái)反映細(xì)菌群落的α多樣性。再利用QIIME(v1.9.1)中的“beta_diversity.py”計(jì)算WeightedUnifrac距離矩陣來(lái)反應(yīng)細(xì)菌群落的β多樣性。
1.5多元統(tǒng)計(jì)分析
本研究利用軟件GraphPadPrism(v8)繪制箱型圖來(lái)反映細(xì)菌群落α多樣性的高低�；贠TU表，利用R(v3.5.3)中的程序包“Vennerable”進(jìn)行Venn圖的繪制。根據(jù)β多樣性矩陣，使用R(v3.5.3)中的“vegan”程序包進(jìn)行非度量多維尺度分析(Nonmetricmultidimensionalscaling，NMDS)，來(lái)可視化不同樣品間群落結(jié)構(gòu)的差異和相似性。為探究細(xì)菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性關(guān)系，利用R(v3.5.3)中的“vegan”程序包進(jìn)行冗余分析(redundancyanalysis，RDA)。
將平均相對(duì)豐度大于0.5%的細(xì)菌門(mén)作為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，并利用軟件GraphPadPrism(v8)繪制堆疊圖。篩選平均相對(duì)豐度大于1%的OTUs作為優(yōu)勢(shì)OTUs，使用軟件IBMSPSSStatistics(v22.0)分析優(yōu)勢(shì)OTUs與環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系(Pearson相關(guān))，并利用R(v3.5.3)中的“Heatmap”程序包分別繪制熱圖。采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)對(duì)水體樣品和沉積物樣品指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。
2結(jié)果與分析
2.12個(gè)養(yǎng)殖區(qū)域的水體和沉積物環(huán)境變量
2個(gè)養(yǎng)殖區(qū)域的水體和沉積物環(huán)境變量均存在一些差異。其中，PC區(qū)的水體NH+4⁃N和NO-3⁃N濃度均顯著高于PS區(qū)(P<0.05)。水體TN、TP和COD濃度均呈現(xiàn)PC>PS的趨勢(shì)。對(duì)于沉積物，PC區(qū)的TN、TP和OC濃度均顯著高于PS區(qū)(P<0.05)。
2.2水產(chǎn)養(yǎng)殖不同物種的水體和沉積物中細(xì)菌群落的α多樣性特征2個(gè)區(qū)域細(xì)菌群落的α多樣性，對(duì)于水體和沉積物樣品，PS區(qū)的ObservedOTUs和Shannon指數(shù)均顯著(P<0.05)高于PC區(qū)。即PS區(qū)中水體和沉積物細(xì)菌群落的α多樣性均顯著高于PC區(qū)。對(duì)于養(yǎng)殖水體，2個(gè)區(qū)域共有2639個(gè)相同的OTUs，PS區(qū)的特有OTU數(shù)為2588遠(yuǎn)大于PC區(qū)的195。
對(duì)于沉積物，PC和PS區(qū)的OTU數(shù)基本一致，絕大多數(shù)OTUs為兩區(qū)域共有，但PS區(qū)的特有OTU數(shù)(408)仍明顯高于PC區(qū)(143)。由此可見(jiàn)，沉積物中的共有OTU數(shù)占總OTU數(shù)的比重大于水體。并且，PS區(qū)中水體和沉積物的特有OTU數(shù)均高于PC區(qū)。
對(duì)于水體，PC區(qū)的特有OTUs共分類(lèi)為15個(gè)細(xì)菌門(mén)，PS區(qū)的特有OTUs共分類(lèi)為16個(gè)細(xì)菌門(mén)。兩個(gè)區(qū)域的特有OTUs均是屬于擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)的最多(PC：33個(gè)，PS：280個(gè))，并且SR1僅在PS區(qū)中觀測(cè)到。對(duì)于沉積物，PC區(qū)的特有OTUs共分類(lèi)為13個(gè)細(xì)菌門(mén)，其中屬于擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和β⁃變形菌綱(Betaproteobacteria)的特有OTUs均為19個(gè)明顯高于其他門(mén)。PS區(qū)的特有OTUs共分類(lèi)為14個(gè)細(xì)菌門(mén)，其中屬于擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)的特有OTUs最多(70個(gè))。
2.3水產(chǎn)養(yǎng)殖不同物種的水體和沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)
PC和PS區(qū)的細(xì)菌群落分別聚集，且2個(gè)區(qū)域無(wú)重疊，表明PC和PS區(qū)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異。冗余分析(RDA)的結(jié)果顯示，對(duì)于水體，第一主軸的解釋率為91.4%，遠(yuǎn)大于第二主軸，NO-3⁃N在第一主軸上的投影長(zhǎng)度最長(zhǎng)，NH+4⁃N次之。對(duì)于沉積物，RDA的第一和第二主軸共有高達(dá)99.73%的解釋率，并且OC、TN和TP均對(duì)沉積物的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著(P<0.05)影響。
2.4水產(chǎn)養(yǎng)殖不同物種的水體和沉積物中細(xì)菌群落組成
本研究共獲得1487129條序列、7247個(gè)OTUs，它們屬于細(xì)菌的34門(mén)、114綱、258目、504科和955屬。2個(gè)區(qū)域的優(yōu)勢(shì)(相對(duì)豐度>0.5%)細(xì)菌門(mén)/亞門(mén)。水體樣品中共有11個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，這11個(gè)門(mén)的相對(duì)豐度和占到所有細(xì)菌的91.46%—98.54%。沉積物樣品中共有13個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其相對(duì)豐度和占到總細(xì)菌的77.52%—84.98%。將相對(duì)豐度>1%作為篩選優(yōu)勢(shì)OTUs的閾值，水體細(xì)菌群落中共篩選出15個(gè)優(yōu)勢(shì)OTUs，而沉積物細(xì)菌群落中僅篩選出7個(gè)優(yōu)勢(shì)OTUs。
水體細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)OTUs中，6個(gè)屬于β⁃變形菌綱(Betaproteobacteria)、5個(gè)屬于擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、3個(gè)屬于放線菌門(mén)(Actinobacteria)和1個(gè)屬于α⁃變形菌綱(Alphaproteobacteria)。
PS區(qū)中OTU3394(叢毛單胞菌科，Comamonadaceae)、OTU12347(腐螺旋菌科，Saprospiraceae)、OTU12385(叢毛單胞菌科，Comamonadaceae)、OTU15668(嗜甲基菌屬，Methylophilus)、OTU16336(叢毛單胞菌科，Comamonadaceae)、OTU20544(叢毛單胞菌科，Comamonadaceae)、OTU38268(黃桿菌屬，F(xiàn)lavobacterium)、OTU41298(放線菌目，Actinomycetales)、OTU42336(沉積桿菌屬，Sediminibacterium)、OTU52126(多核桿菌屬，Polynucleobacter)和OTU61118(黃桿菌屬，F(xiàn)lavobacterium)的相對(duì)豐度顯著低于PC區(qū)(P<0.01)，OTU94966(腐螺旋菌科，Saprospiraceae)的相對(duì)豐度顯著高于PC區(qū)(P<0.001)。沉積物優(yōu)勢(shì)OTUs中，5個(gè)屬于擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、1個(gè)屬于β⁃變形菌綱(Betaproteobacteria)、1個(gè)屬于綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)。這7個(gè)優(yōu)勢(shì)OTUs的相對(duì)豐度在兩個(gè)區(qū)域之間均存在顯著差異(P<0.001)。
PS區(qū)中OTU11213(Dechloromonas屬)和OTU59770(Prolixibacteraceae科)的相對(duì)豐度均顯著高于PC區(qū)(P<0.001)。而OTU1482(擬桿菌門(mén)，Bacteroidetes)、OTU89828(擬桿菌門(mén)，Bacteroidetes)、OTU97626(擬桿菌門(mén)，Bacteroidetes)、OTU103576(擬桿菌門(mén)，Bacteroidetes)和OTU103578(厭氧繩菌科，Anaerolineaceae)的相對(duì)豐度則是PC區(qū)顯著更高(P<0.001)。
2個(gè)養(yǎng)殖區(qū)域的優(yōu)勢(shì)OTUs與環(huán)境因子的相關(guān)性(Pearson相關(guān))�？傮w來(lái)看，水體NH+4⁃N和NO-3⁃N與水體優(yōu)勢(shì)OTUs相關(guān)性較強(qiáng)。其中OTU3394、12347、12385、15668、16336、20544、38268、41298、42336、52126和611181均與NH+4⁃N和NO-3⁃N顯著正相關(guān)(P<0.01)。而OTU94966與NH+4⁃N和NO-3⁃N顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。
對(duì)于沉積物，TN、TP和OC濃度均與優(yōu)勢(shì)OTUs有較強(qiáng)的相關(guān)性。整體上，TP與優(yōu)勢(shì)OTUs的相關(guān)性較TN和OC弱。OTU11213和OTU59770與TN和OC均顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，OTU1482、OTU89828、OTU97626、OTU103576和OTU103578與TN和OC均顯著正相關(guān)(P<0.01)。
3討論
3.1水產(chǎn)養(yǎng)殖不同物種對(duì)水體和沉積物中細(xì)菌群落多樣性及結(jié)構(gòu)的影響
本研究中，PS區(qū)的水體和沉積物細(xì)菌群落α多樣性均顯著高于PC區(qū)(P<0.05)。細(xì)菌群落多樣性受宿主影響較大[38]，如張瓊瓊等人研究發(fā)現(xiàn)，微生物多樣性與宿主呈現(xiàn)專(zhuān)一性，即宿主會(huì)在周?chē)h(huán)境中形成獨(dú)特的微環(huán)境并對(duì)細(xì)菌具有趨化和富集的作用，進(jìn)而使得不同宿主對(duì)應(yīng)了不同大小的細(xì)菌群落多樣性[39]。因此，養(yǎng)殖克氏原螯蝦(PC)和中華鱉(PS)的水體和沉積物中極有可能分別形成了獨(dú)特的微環(huán)境，如2種不同物種的排泄物、皮膚分泌物等對(duì)細(xì)菌分別具有獨(dú)特的趨化和富集作用。
導(dǎo)致PC和PS區(qū)的水體和沉積物間細(xì)菌群落種類(lèi)和數(shù)量發(fā)生變化，進(jìn)而使細(xì)菌群落多樣性與宿主呈現(xiàn)專(zhuān)一性，最終導(dǎo)致了PC和PS區(qū)細(xì)菌群落的α多樣性呈現(xiàn)顯著差異。Venn圖的結(jié)果顯示，細(xì)菌群落α多樣性更高的PS區(qū)中擁有更多的特有OTUs，這些OTUs可能就是在養(yǎng)殖中華鱉形成的特定微環(huán)境下定植并富集的。中華鱉還具有上岸曬背的習(xí)性，這一習(xí)性也可能將陸地中的細(xì)菌帶入到養(yǎng)殖水環(huán)境中，使特有OTUs數(shù)量增加，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌群落多樣性升高[5，22]。
本研究統(tǒng)計(jì)了PC和PS區(qū)中特有OTUs的分類(lèi)學(xué)信息，但由于目前認(rèn)知所限，這些特有OTUs大多只能獲得較為粗糙的分類(lèi)學(xué)信息，因此這些OTUs的特性大部分還不清楚，需要在后續(xù)的研究中進(jìn)一步探究，以探明養(yǎng)殖作物的哪些生理特征或生活習(xí)性會(huì)導(dǎo)致哪些特有OTUs的定殖和富集。此外，環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)濃度對(duì)細(xì)菌群落多樣性也有著較大影響[40]。研究表明，在營(yíng)養(yǎng)濃度較高的養(yǎng)殖環(huán)境中，更低的營(yíng)養(yǎng)負(fù)荷反而可能會(huì)造成更高的多樣性[41]。而本研究中細(xì)菌群落α多樣性更高的PS區(qū)中，水體TN、TP和COD均略低于PC區(qū)，沉積物TN、TP和OC均顯著低于PC區(qū)(P<0.05)。
這可能是克氏原螯蝦和中華鱉的生理特征、生活習(xí)性及管理方式的不同造成的。由于克氏原螯蝦的雜食性，在養(yǎng)殖過(guò)程中存在餌料的過(guò)量投放和產(chǎn)生大量排泄物等問(wèn)題[42]。另一方面，中華鱉生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，餌料投放較少，并且其代謝緩慢[43]�？耸显r挖洞刨沙的習(xí)性會(huì)導(dǎo)致沉積物中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更容易釋放到水體中[21]。因此，養(yǎng)殖中華鱉的水環(huán)境更容易保持較低的營(yíng)養(yǎng)負(fù)荷，使細(xì)菌群落α多樣性更高。綜上，由于PC和PS區(qū)宿主不同分別形成了獨(dú)特的微環(huán)境(排泄物、皮膚分泌物等對(duì)細(xì)菌獨(dú)特的趨化和富集作用)，及生理特征、生活習(xí)性和管理方式不同導(dǎo)致的水環(huán)境營(yíng)養(yǎng)鹽負(fù)荷的差異，二者共同作用導(dǎo)致了PS區(qū)的細(xì)菌群落α多樣性顯著高于PC區(qū)。
4結(jié)論
(1)由于宿主的不同和營(yíng)養(yǎng)濃度的差異，使得PC和PS區(qū)的水體和沉積物中細(xì)菌群落的α多樣性呈現(xiàn)顯著(P<0.05)差異。并且在水體和沉積物中，細(xì)菌群落α多樣性均為PS區(qū)顯著高于的PC區(qū)。
(2)養(yǎng)殖克氏原螯蝦(PC)和中華鱉(PS)造成的水體和沉積物理化指標(biāo)差異，引起了養(yǎng)殖區(qū)域間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異。水體中的NH+4⁃N和NO-3⁃N是造成水體細(xì)菌群落組成差異的最主要環(huán)境因子，沉積物中的TN、TP和OC均對(duì)沉積物細(xì)菌群落組成有顯著影響(P<0.05)。
(3)PC和PS區(qū)的養(yǎng)殖水體中均檢測(cè)出了致病菌(黃桿菌屬和多核桿菌屬)，并且檢測(cè)出的致病菌均與NH+4⁃N和NO-3⁃N濃度顯著(P<0.01)正相關(guān)。
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作者：張弘杰1，3，徐慧敏1，3，過(guò)梓栩1，何斐2，∗，曾巾3，趙大勇1
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