木霉菌對(duì)植物寄生線蟲(chóng)防治作用機(jī)制

　　摘要：生物防治不僅作為植物寄生線蟲(chóng)安全有效的防治措施，而且其具有降低化學(xué)農(nóng)藥施用量和減少環(huán)境污染的作用。木霉菌作為一種生防潛力巨大的線蟲(chóng)病防治真菌，已被廣泛研究并應(yīng)用于植物寄生線蟲(chóng)的防治。本文主要從木霉防治線蟲(chóng)病的直接和間接生防機(jī)制的視角，綜述了木霉對(duì)線蟲(chóng)的重寄生作用、毒殺作用以及木霉對(duì)植物的誘導(dǎo)抗性、促生作用等多種協(xié)同防治植物寄生線蟲(chóng)的機(jī)制，展望了今后需要繼續(xù)擴(kuò)大對(duì)殺線木霉資源種類的調(diào)查和挖掘、木霉菌對(duì)植物寄生線蟲(chóng)的作用機(jī)理以及從分子水平上加深對(duì)木霉防治線蟲(chóng)病機(jī)制的研究，旨在為科學(xué)利用木霉菌防治植物線蟲(chóng)病提供參考。

　　關(guān)鍵詞：木霉;線蟲(chóng);生物防治;互作機(jī)制;直接機(jī)制;間接機(jī)制

　　植物寄生線蟲(chóng)(Plantparasiticnematodes，PPNs)是引起植物病害的一類重要經(jīng)濟(jì)類有害生物[1,2]。據(jù)估計(jì)，因其危害在全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中造成的經(jīng)濟(jì)損失每年高達(dá)1570億美元[3]。植物寄生線蟲(chóng)引起的線蟲(chóng)病已成為我國(guó)主要的農(nóng)業(yè)病害之一，嚴(yán)重阻礙我國(guó)糧食、經(jīng)濟(jì)作物安全生產(chǎn)。

　　長(zhǎng)期以來(lái)，化學(xué)殺線蟲(chóng)劑一直是防治植物線蟲(chóng)病害的主要措施，然而大量使用化學(xué)藥劑不僅會(huì)使線蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性，還會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題并危害人體健康，進(jìn)而導(dǎo)致大多數(shù)高毒類殺線劑已被禁用或限制使用[4]。同時(shí)，隨著人們綠色環(huán)保意識(shí)的提高和無(wú)公害生產(chǎn)的要求，以及生物防治因能有效減少化學(xué)農(nóng)藥的使用并減輕環(huán)境污染已逐漸成為植物寄生線蟲(chóng)安全有效的防治措施。

　　木霉菌Trichodermaspp.是一類廣泛分布于土壤中的有益菌，因在線蟲(chóng)病防治中極具生防潛力而被廣泛研究[1,2,46]。近年來(lái)，木霉對(duì)植物線蟲(chóng)病的防治機(jī)理已成為木霉生防研究中的重要科學(xué)問(wèn)題。本文主要從木霉防治線蟲(chóng)病的直接和間接生防機(jī)制的視角，綜述了木霉對(duì)線蟲(chóng)的重寄生作用、毒殺作用及其對(duì)植物的誘導(dǎo)抗性和促生作用等多種協(xié)同防治植物病原線蟲(chóng)的機(jī)制，以期為進(jìn)一步深入研究生防木霉菌防治植物線蟲(chóng)病提供新思路。

　　1木霉菌防治線蟲(chóng)的直接作用機(jī)制

　　1.1木霉菌重寄生作用

　　木霉菌通過(guò)重寄生作用進(jìn)行識(shí)別、接觸、纏繞和穿透線蟲(chóng)來(lái)抑制或溶解寄主體壁，是木霉最重要、最廣泛的生防機(jī)制之一[7]。研究表明[1,2,79],木霉菌胞外酶在木霉菌重寄生作用過(guò)程扮演著重要的作用，木霉菌在重寄生過(guò)程中分泌幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、葡聚糖酶等一系列水解酶來(lái)消解線蟲(chóng)孢囊、卵、體壁，其中以幾丁質(zhì)酶和蛋白酶尤為重要。

　　目前，已發(fā)現(xiàn)哈茨木霉T.longibrachiatum[10]、康寧木霉T.koningiopsis[11]、綠色木霉T.viride[6]和長(zhǎng)枝木霉T.longibrachiatum[1]等菌株可以有效抑制根結(jié)線蟲(chóng)的繁殖，本課題組前期分離篩選出適宜于西部干旱生態(tài)環(huán)境條件下的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的一株長(zhǎng)枝木霉T6殺線菌株，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)禾谷孢囊線蟲(chóng)Heteroderaavenae孢囊、卵和幼蟲(chóng)均具有較強(qiáng)的寄生和致死作用，利用顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)其寄生后能夠?qū)е骆吣摇⒙押途�蟲(chóng)體壁破裂和溶解[2,4,12]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其能夠通過(guò)提高和分泌大量幾丁質(zhì)酶和蛋白酶導(dǎo)致孢囊體壁和卵殼溶解，以及能夠分泌蛋白酶導(dǎo)致南方根結(jié)線蟲(chóng)Meloidogyneincognita幼蟲(chóng)體壁溶解和線蟲(chóng)死亡[1]。

　　1.1.1木霉菌幾丁質(zhì)酶殺線作用及機(jī)理

　　幾丁質(zhì)酶是木霉菌胞外酶的重要組成成分之一，主要由內(nèi)切幾丁質(zhì)酶(Endochitinase)和外切幾丁質(zhì)酶(Exochitinase)組成，其在重寄生線蟲(chóng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的殺線功能。木霉菌分泌的幾丁質(zhì)酶在線蟲(chóng)寄生和致死作用中已有相關(guān)研究，Sahebani等[10]報(bào)道爪哇根結(jié)線蟲(chóng)M.javanica卵能夠誘導(dǎo)哈茨木霉BI幾丁質(zhì)酶活性的升高，進(jìn)而提高其侵染卵的活力。Baldoni等[11]從51株分離的真菌中篩選出康寧木霉UFSMQ40具有較好的殺線活性，通過(guò)以膠體幾丁質(zhì)作為誘導(dǎo)劑提取的幾丁質(zhì)酶發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)有較高的致死率。

　　Szabo等[13]研究表明，18株木霉菌株中有株木霉菌對(duì)植物寄生線蟲(chóng)具有較強(qiáng)的寄生作用，其中哈茨木霉SZMC1647對(duì)植物寄生線蟲(chóng)卵具有較強(qiáng)的寄生作用，進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析哈茨木霉SZMC1647幾丁質(zhì)酶基因chi185(chit42)和chi1812(chit33)的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，chi18(chit42)和chi1812(chit33)在不同時(shí)間點(diǎn)存在較明顯的表達(dá)量差異，但總體而言，哈茨木霉與線蟲(chóng)互作過(guò)程中幾丁質(zhì)酶基因高表達(dá)，表明哈茨木霉與線蟲(chóng)互作過(guò)程中，線蟲(chóng)卵可能誘導(dǎo)哈茨木霉幾丁質(zhì)酶基因chi18(chit42)和chi1812(chit33)顯著上調(diào)表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控其產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的能力增強(qiáng)從而促進(jìn)線蟲(chóng)卵體壁溶解，然而，有關(guān)chi185chit42)和chi1812(chit33)基因的具體功能還有待后期進(jìn)一步驗(yàn)證。

　　朱玉婷等[14]從煙草南方根結(jié)線蟲(chóng)卵上分離到株可產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的長(zhǎng)枝木霉HBF1，從菌株HBF1中克隆到個(gè)幾丁質(zhì)酶基因，命名為TlChi46，初步預(yù)測(cè)該基因編碼氨基酸的個(gè)數(shù)、理論分子量及等電點(diǎn)分別為423個(gè)、45.9kDa、5.23，通過(guò)構(gòu)建TlChi46與昆蟲(chóng)寄生菌幾丁質(zhì)酶基因的進(jìn)化樹(shù)明確了二者親緣關(guān)系可能相對(duì)較遠(yuǎn)，該基因能否合成幾丁質(zhì)酶并殺死線蟲(chóng)仍待進(jìn)一步驗(yàn)證。

　　1.1.2木霉菌蛋白酶殺線作用及機(jī)理

　　木霉菌胞外蛋白酶是另一類重要的細(xì)胞壁降解酶，對(duì)植物病原線蟲(chóng)的生物防治也有著重要作用，木霉與植物病原線蟲(chóng)互作時(shí)，木霉分泌的蛋白酶能失活鈍化寄主線蟲(chóng)體壁，降解病原線蟲(chóng)體壁中蛋白質(zhì)組分等途徑，與其它細(xì)胞壁降解酶協(xié)同發(fā)揮對(duì)線蟲(chóng)的防治作用[3,15]。

　　Geremia等[16]從哈茨木霉IMI206040中分離到一種堿性絲氨酸蛋白酶Prb1，分子量31kD，等電點(diǎn)9.2。隨著分子生物技術(shù)水平的飛速發(fā)展，編碼木霉菌蛋白酶prb1基因已克隆，同時(shí)過(guò)表達(dá)prb1基因的突變體能夠增強(qiáng)木霉菌的生防功能[17]。另有研究表明[18]，哈茨木霉能毒殺南方根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)，并且過(guò)表達(dá)堿性絲氨酸蛋白酶prb1基因的哈茨木霉轉(zhuǎn)化菌株對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)的毒殺作用顯著增強(qiáng)。另外，Suarez等從哈茨木霉CECT2413菌株中發(fā)現(xiàn)種蛋白酶PRA1，其功能與胰蛋白酶類似，該發(fā)酵粗提蛋白液顯著降低了線蟲(chóng)卵的孵化率。Stleger等[20]研究表明，微生物胞外蛋白酶是大部分蟲(chóng)生真菌侵染初期產(chǎn)生的唯一胞外酶，而幾丁質(zhì)酶則是侵染后期產(chǎn)生的最主要胞外酶。

　　Chen等[21]從擬康寧木霉T.pseudokoningiiSMF2中分離到種線蟲(chóng)體壁降解酶絲氨酸蛋白酶(Cuticledegradingserineprotease)Spr，該酶對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵的孵化率表現(xiàn)為顯著降低，并且對(duì)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒殺作用。另外，天冬氨酸蛋白酶在木霉菌重寄生和植物共生作用中也發(fā)揮著重要作用[22]。Szabó通過(guò)測(cè)定哈茨木霉與線蟲(chóng)卵互作中的13個(gè)肽酶編碼基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)酸性絲氨酸蛋白酶pra1、天冬氨酸蛋白酶p6281和p9438、金屬內(nèi)肽酶p7455和絲氨酸蛋白酶p5216均高表達(dá)，這預(yù)示著哈茨木霉蛋白酶基因pra1、p6281、p9438、p7455和p5216可能在與卵互作過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵殺線作用[23]。

　　1.2木霉菌毒殺作用

　　毒殺作用是木霉防治線蟲(chóng)的另一種重要的直接生防機(jī)制，在木霉菌生長(zhǎng)過(guò)程中，產(chǎn)生多種具有毒殺活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些毒殺性的代謝產(chǎn)物能夠殺死線蟲(chóng)[24]，達(dá)到防治植物病原線蟲(chóng)病的目的。目前已報(bào)道的具有殺線活性的木霉菌主要有長(zhǎng)枝木霉、綠色木霉、哈茨木霉、鉤狀木霉T.hamatum、深綠木霉T.atroviride及康寧木霉[2431]。Zhang等[32]采用響應(yīng)面法來(lái)優(yōu)化長(zhǎng)枝木霉T6的殺線發(fā)酵液的條件。

　　結(jié)果表明，T6培養(yǎng)濾液在初始pH為6.06、接種量為1.62mL、培養(yǎng)時(shí)間為7.15d的發(fā)酵條件下殺線蟲(chóng)活性最高，達(dá)92.42%，溫室試驗(yàn)中T6培養(yǎng)濾液在小麥播種后70d的生防效果為83.88%。Yang等[33]對(duì)所分離的329株木霉菌株進(jìn)行了毒殺全齒復(fù)合線蟲(chóng)測(cè)定，結(jié)果表明其中15株木霉菌對(duì)全齒復(fù)合線蟲(chóng)具有較強(qiáng)的毒殺活性。目前已發(fā)現(xiàn)木霉所產(chǎn)生的毒殺物質(zhì)分為兩類，一類是小分子和易揮發(fā)性物質(zhì)，包括芳香族化合物、聚酮化合物、丁烯酸內(nèi)酯類及萜烯類等[34,35]。另一類是大分子代謝產(chǎn)物，包括肽Peptailbols、酶類等[36]。

　　已有報(bào)道表明目前從木霉菌中提取的殺線物質(zhì)主要有木霉菌素[32]、乙酸[24]、膠酶毒素[37]和肽環(huán)孢菌素[38]等成分;同時(shí)，梁志懷等[39]利用GCMS檢測(cè)和分析了木霉菌TUV13菌株殺線活性成分，共獲得40多種化學(xué)成分，其中主要以烷烴類成分的種類最多，另外還包含有機(jī)酸類、酯類、酮類和類固醇類等有機(jī)化合物。綜上，木霉菌發(fā)揮生物防治的功能主要為重寄生作用和毒殺作用，其主要機(jī)制為木霉菌在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的胞外酶和次級(jí)代謝產(chǎn)物來(lái)協(xié)同發(fā)揮生物防治的功能[40,41]。

　　2木霉菌防治線蟲(chóng)的間接作用機(jī)制

　　早期對(duì)木霉生防機(jī)制的研究主要集中在木霉與寄生線蟲(chóng)之間的直接作用，而對(duì)于木霉與寄主植物相互作用增強(qiáng)植物抗病性的研究較少。近年來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)木霉菌可以通過(guò)誘導(dǎo)植物防御系統(tǒng)與植物建立共生關(guān)系，增強(qiáng)植物對(duì)線蟲(chóng)病的抗性，該機(jī)制稱為木霉誘導(dǎo)的植物系統(tǒng)抗性[4244];另外，木霉菌與植物相互作用、相互共存和互利共生，木霉菌能夠加速植物吸收土壤中的養(yǎng)分，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物抵抗逆境脅迫的能力，這便是木霉菌防治線蟲(chóng)病的間接作用機(jī)制。

　　3木霉防治線蟲(chóng)病存在的問(wèn)題及展望

　　3.1加大對(duì)殺線木霉種類調(diào)查和挖掘近年來(lái)，科研工作者發(fā)現(xiàn)了許多具有殺線蟲(chóng)作用的木霉菌，雖在前人研究的基礎(chǔ)上開(kāi)展了很多探索性的工作，但對(duì)有殺線潛力的木霉種類挖掘還不夠，這就要求科研工作者利用大自然廣泛的微生物資源，充分調(diào)查和挖掘具有殺線蟲(chóng)作用的木霉種類的認(rèn)識(shí)，將更多的真菌資源有效地應(yīng)用于線蟲(chóng)防治，以開(kāi)拓我國(guó)線蟲(chóng)生物防治的新領(lǐng)域。

　　3.2明確殺線木霉對(duì)植物寄生線蟲(chóng)的毒殺機(jī)制迄今為止，已發(fā)現(xiàn)木霉次級(jí)代謝代謝產(chǎn)物能有效殺死線蟲(chóng)，然而，已發(fā)現(xiàn)具有殺線蟲(chóng)作用的木霉次級(jí)代謝產(chǎn)物種類較少。另外，關(guān)于木霉次級(jí)代謝產(chǎn)物中有效的殺線活性物質(zhì)如何殺死線蟲(chóng)，其作用機(jī)理尚不明晰。因而，國(guó)內(nèi)外科研工作者有待于更深入、更系統(tǒng)地探明木霉代謝產(chǎn)物防治線蟲(chóng)的機(jī)制，以期更好地發(fā)揮生防木霉的殺線作用。

　　3.3揭示木霉防治線蟲(chóng)的分子作用機(jī)制

　　木霉防治植物線蟲(chóng)病的機(jī)制包括重寄生、毒殺的直接防治作用及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)的間接防治作用在內(nèi)的多種機(jī)制，田間防治中木霉往往以多種機(jī)制協(xié)同發(fā)揮防效作用。因而，明確木霉防治線蟲(chóng)病的機(jī)制是科學(xué)應(yīng)用木霉生物防治線蟲(chóng)病的關(guān)鍵。近年來(lái)，眾多科研工作者對(duì)木霉防治線蟲(chóng)已從木霉菌種、胞外酶、次級(jí)代謝物質(zhì)的分離鑒定等方面開(kāi)展了研究，然而，在木霉胞外酶、次級(jí)代謝產(chǎn)物的種類以及調(diào)控其合成的基因、木霉誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性的機(jī)制還需要更深入的研究。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，后基因組時(shí)代已然到來(lái)，基于基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)于挖掘木霉胞外酶、次級(jí)代謝產(chǎn)物的種類以及調(diào)控其合成的基因、以及開(kāi)展木霉誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性機(jī)制的研究工作，可為木霉的田間應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

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　　作者：王秀娟，張樹(shù)武，徐秉良

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