本文摘要：摘要膽固醇不僅是細胞膜和脂蛋白中重要的脂質(zhì)分子，也是固醇激素、膽汁酸和維生素D的前體，其與人體健康息息相關(guān)。膽固醇除了人體自身合成外，也可從動物源食品中獲
摘要膽固醇不僅是細胞膜和脂蛋白中重要的脂質(zhì)分子，也是固醇激素、膽汁酸和維生素D的前體，其與人體健康息息相關(guān)。膽固醇除了人體自身合成外，也可從動物源食品中獲取。膽固醇是人體生理必需的，但膽固醇攝入過多會提高患膽結(jié)石、冠心病、腦血栓等相關(guān)疾病的風(fēng)險。因此必須準確定量這些食品中的膽固醇，并對部分食品中的膽固醇進行脫除。該文綜述了食品中膽固醇的檢測與脫除技術(shù)，總結(jié)了各種技術(shù)的特點與應(yīng)用，并展望了未來食品中膽固醇的檢測與脫除技術(shù)發(fā)展方向，以期為該領(lǐng)域研究工作提供參考。
關(guān)鍵詞食品;膽固醇;檢測技術(shù);脫除技術(shù)
膽固醇是人體或動物細胞內(nèi)產(chǎn)生的甾醇類脂，屬于環(huán)戊烷多氫菲的衍生物，也是膽汁酸、固醇激素和維生素D產(chǎn)生的重要前體[1-2]。在一定水平上，膽固醇對人體十分有益，但高膽固醇血癥與許多疾病有關(guān)。膽固醇在人體內(nèi)的流動運輸主要是基于與血液中低密度脂蛋白的結(jié)合，過量的膽固醇會沉積在動脈中，促進斑塊的形成，導(dǎo)致動脈粥樣硬化。血液中膽固醇超過200mg/dL，有患心臟病的風(fēng)險[3]。
2015年新版美國膳食指南中取消了成人每天最多攝入300mg的限量，但這并不意味著人們對膽固醇的攝入應(yīng)當(dāng)放開。近年來，隨著人口老齡化的加速，心血管類的疾病已成為威脅人體健康的重要因素，人體攝入過多膽固醇引起疾病的風(fēng)險仍然存在。因此，除了適量減少對高膽固醇食物的攝入，及時有效地對食品中的膽固醇進行檢測與脫除具有重要的意義。
本文綜述了食品中膽固醇的檢測技術(shù)，包括比色法、酶-熒光法、色譜法、近紅外光譜法和電化學(xué)法以及食品中膽固醇脫除的物理(蒸餾法、吸附法和超臨界流體萃取法)、化學(xué)(沉淀法和微膠囊包合法)、生物(微生物法、酶法)技術(shù)，討論了食品中常見的檢測與脫除技術(shù)的特點、原理和應(yīng)用，并對未來食品中膽固醇檢測與脫除技術(shù)的發(fā)展進行了展望。
1食品中膽固醇的檢測技術(shù)
目前食品中膽固醇的檢測與定量分析一直在改進完善中，膽固醇的檢測技術(shù)主要有比色法、酶熒光法、色譜法、近紅外光譜法和電化學(xué)法。
1.1比色法
比色法是以顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過比較或測定有色物質(zhì)濃度來間接確定待定組分含量的方法。樣品中脂肪提取后，經(jīng)乙醇-氫氧化鉀皂化，用正己烷萃取，濃縮后加入乙酸酐，以硫酸鐵銨為顯色劑，采用分光光度計進行膽固醇的定量。張曉儒[4]比較了比色法和氣相色譜法對內(nèi)蒙古家畜肉中膽固醇含量的測定，結(jié)果表明比色法測定樣品中膽固醇的含量較氣相色譜法高4.74%。利用傳統(tǒng)的化學(xué)比色法測食品中膽固醇時，食品中某些脂類也會與顯色劑發(fā)生反應(yīng)造成定量誤差，導(dǎo)致測定結(jié)果偏大。
馬麗娜等[5]建立了一種快速測定禽蛋中膽固醇的酶比色法，膽固醇通過酶水解生成膽甾-4-烯-3-酮和H2O2，H2O2經(jīng)過氧化物酶作用在4-氨基安替比林及苯酚參與下,生成紅色醌亞胺，并在波長505nm處測定樣品吸光度，確定顯色時間為15min，顯色溫度為37℃的最優(yōu)條件下，膽固醇的檢出限為1.0mg/100g。有研究在傳統(tǒng)的化學(xué)比色法基礎(chǔ)上，將納米技術(shù)與比色法相結(jié)合，基于銅納米團簇的過氧化酶活性，膽固醇被催化氧化產(chǎn)生H2O2，以愈創(chuàng)木酚作為顯色底物,利用銅納米團簇的納米探針比色來定量牛奶中的膽固醇，檢出限為5μg/mL[6]。
傳統(tǒng)的化學(xué)比色法方法重現(xiàn)性良好，但操作復(fù)雜，樣品的前處理和脂肪的提取消耗時間長，溶劑消耗量大，有一定的測定誤差;酶比色法無有毒試劑的消耗，操作步驟簡單，但需要對顯色時間和顯色溫度進行優(yōu)化;納米探針比色法簡單快速，抗干擾性強，但納米團簇的合成與表征比較耗時。因此傳統(tǒng)的化學(xué)比色法已經(jīng)不適合食品中膽固醇的精準定量，酶比色法和納米探針比色法很好地實現(xiàn)了對一些食品膽固醇的檢測分析[5-6]。目前這些新型的比色法多應(yīng)用于血清中膽固醇的快速檢測[7]，受限于食品基質(zhì)的復(fù)雜性，在食品中的應(yīng)用并不廣泛。
1.2酶-熒光法
利用膽固醇氧化酶來測定食品中總膽固醇的含量是基于酶偶聯(lián)反應(yīng)。20世紀70年代后，利用膽固醇氧化酶的反應(yīng)去間接定量膽固醇已得到廣泛應(yīng)用[8]。膽固醇被膽固醇氧化酶氧化成膽甾-4-烯-3-酮，副產(chǎn)物過氧化氫可以很容易地用高靈敏的熒光探針檢測。10-乙酰基-3,7-二羥基吩噁嗪能在辣根過氧化酶(horseradishperoxidase，HRP)的催化作用下形成過氧化氫存在下的熒光產(chǎn)物9-羥基-3-異吩噁嗪酮而被用作膽固醇的測定[9]。
此外，酪胺能夠作為氧化物酶的理想供氫熒光底物，很好地應(yīng)用于利用膽固醇氧化酶的反應(yīng)去間接定量膽固醇。王令臣等[10]利用過氧化氫在氯化血紅素催化下氧化酪胺產(chǎn)生熒光，通過計算過氧化氫的量去間接定量膽固醇，確定了膽固醇氧化酶含量為28mU/mL，氯化血紅素濃度為0.1mmol/L，酪胺濃度為0.7mmol/L，反應(yīng)時間為15min的最優(yōu)化條件，檢測限為0.08μmol/L，并用于牛奶中膽固醇的加標(biāo)檢測，相對標(biāo)準偏差小于3.1%，回收率高達98.7%~112.7%。
LARSEN[11]利用酶-熒光法測定出牛乳中的膽固醇含量在80~756μmol/L之間，其原理也是膽固醇氧化分解后產(chǎn)生的過氧化氫在過氧化物酶的影響下與非熒光物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并產(chǎn)生等量的熒光物質(zhì)。然而，酶-熒光法對膽固醇的測定不具有嚴格的選擇性。膽固醇氧化酶也可能與其他固醇發(fā)生反應(yīng)[12]。此外，樣品中存在的一些化學(xué)物質(zhì)(如抗壞血酸和膽紅素)可能消耗過氧化氫，在間接測定膽固醇時發(fā)生定量誤差。
1.3色譜法
1.3.1氣相色譜法
氣相色譜法(gaschromatography，GC)因選擇性高，分離效果好，操作簡單而用于食品中膽固醇的檢測。陳月曉等[13]采用GC測定植物油中的膽固醇，該法可使植物油中的膽固醇與各類甾醇有效分離。以5α-膽甾烷為內(nèi)標(biāo)參照物，測得玉米油中的膽固醇含量為4.54mg/100g，檢出限和定量限低，分別為0.3mg/100g和1.0mg/100g。GC測定食品中的膽固醇時，為提高分析的精準度，消除實驗引起的誤差，常采用內(nèi)標(biāo)法，5α-膽甾烷為常用的內(nèi)標(biāo)參照物。衍生化的處理方式也會提高GC測定的準確度，通過氣相色譜結(jié)合火焰離子化檢測器分析衍生化物-三甲基甲硅烷基醚來定量膽固醇。
該法已被用于母乳中膽固醇的檢測分析，旨在評價不同階段母乳的營養(yǎng)指標(biāo)，與傳統(tǒng)采用氫氧化鉀與甲醇混合液進行皂化相比，運用脂肪酶對樣品酶解，采用碳酸鉀-乙醇皂化法效果更好，所耗時間更少[14]。GC的選擇性與分離性也是相對的，當(dāng)樣品中含有的雜質(zhì)較多，分離效果變差時，檢測結(jié)果的誤差也難以有效控制。
1.3.2氣相色譜-質(zhì)譜法
質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)成為食品科學(xué)分離學(xué)科中最受歡迎的檢測技術(shù)之一。目前通過氣相色譜技術(shù)和質(zhì)譜相結(jié)合的氣相色譜-質(zhì)譜法(Gaschromatography-massspectrometry，GC-MS)，相較于GC，GC-MS更能準確的分離并定量動物源食品的膽固醇。GC-MS的定量更準確，誤差更小[15]。
目前，GC-MS檢測食品中膽固醇的技術(shù)日趨完善。CHEN等[16]建立了一種不經(jīng)衍生化的GC-MS測定普通植物油、雞蛋和奶粉中膽固醇的方法。樣品用7.5%氫氧化鉀的乙醇進行皂化，正己烷/石油醚(50:50，v/v)萃取，四氫呋喃定容，該法定量限為2mg/kg，加標(biāo)回收率在91%~100%之間。
陳樹東等[17]開發(fā)了一種基于固相萃取作為預(yù)處理方式的GC-MS，用來測定植物油中的膽固醇。該法采用Florisil固相萃取柱萃取，無須皂化和衍生化，其中膽固醇的檢出限為0.2mg/kg，回收率為84.5%~105.0%，適用于油類的膽固醇測定。隨著前處理條件的不斷優(yōu)化，食品中膽固醇的檢測時間也在不斷縮短。但GC-MS測定結(jié)果的準確性會受到食品基質(zhì)的干擾。與GC相似，利用GC-MS測定食品中的膽固醇，采用內(nèi)標(biāo)法能使基質(zhì)效應(yīng)的影響降到最低。高靈敏度、高精密度、高選擇性等優(yōu)點使GC-MS成為食品中膽固醇檢測的主流的技術(shù)之一。
1.3.3液相色譜法
基于從非皂化物中分離膽固醇的測定目的，液相色譜法(highperformanceliquidchromatography，HPLC)逐漸被應(yīng)用到食品中膽固醇含量的測定。食品中膽固醇測定的HPLC選擇極性有機溶劑乙腈與甲醇、乙醇或異丙醇作為混合流動相，采用硅膠與辛基(C8)或十八烷基(C18)的合相為固定相。DANESHFAR等[18]提出了一種基于分散液液微萃取的快速、簡便、靈敏的樣品制備方法，利用HPLC測定食品中的膽固醇,檢出限和定量限分別為0.01μg/L和0.03μg/L,并用于對牛奶、蛋黃中的膽固醇進行分析。
張曉林等[19]針對動物源食品中含有大量的甾醇和脂肪的特點，建立了加速溶劑萃取-凝膠色譜凈化的高效液相色譜法，通過凝膠色譜凈化，排除了甾醇和脂肪等雜質(zhì)的干擾。測定結(jié)果表明，膽固醇濃度在1.0~40.0mg/L，相對標(biāo)準偏差為3.1%~7.8%，對于富含脂類的動物源食品有較好的檢測效果。
相比于傳統(tǒng)的HPLC，超高效液相色譜法(ultrahighperformanceliquidchromatography，UHPLC)能夠有效地減少有機溶劑的消耗與分析時間且分離效果更好。ALBUQUERQUE等[20]比較了HPLC和UHPLC對于動物源食品中膽固醇的測定，相較于HPLC，簡單、可靠、經(jīng)濟和快速的UHPLC對于動物源食品基質(zhì)中膽固醇含量的質(zhì)量控制更好，并易于被分析實驗室采用。色譜法因具有高選擇性、低檢出限和高準確度的優(yōu)點，會長期用于實驗室中食品膽固醇的定量分析。
1.4近紅外光譜法
近紅外光譜技術(shù)作為一種準確、快速和無損的質(zhì)量分析技術(shù)，近年來發(fā)展迅速。目前近紅外光譜技術(shù)已普遍運用到肉與肉制品的感官品質(zhì)及理化指標(biāo)的分析檢測中[21-22]，在食品中膽固醇檢測方面的研究不是很多。早期用于膽固醇定量的近紅外光譜技術(shù)是基于對樣品中的膽固醇的化學(xué)提取，但沒有達到省時的目的。
通過將近紅外光譜技術(shù)與化學(xué)計量相結(jié)合，以偏最小二乘法(partialleast-squares，PLS)為基礎(chǔ)，分析模型的構(gòu)建，快速定量食品中的膽固醇。王輝等[23-24]利用中波近紅外光譜技術(shù)，構(gòu)建生鮮雞肉和牛肉中膽固醇定量分析的模型，在60~100mg/100g和50~70mg/100g區(qū)間效果最好，適合生鮮雞肉和牛肉中膽固醇的定量分析。CHITRA等[25]利用傅里葉變換近紅外光譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)技術(shù)構(gòu)建的二階導(dǎo)數(shù)PLS模型，具有最佳性能指標(biāo)。
測得不同奶粉中膽固醇的含量在61.40~235.22mg/100g之間，交叉驗證的均方根誤差只有1.05mg/100g。也可利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型與近紅外光譜技術(shù)結(jié)合來定量膽固醇，已開發(fā)的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可通過紫外可見-近紅外光譜來區(qū)分低、中、高膽固醇值[26]。近紅外光譜技術(shù)可用于肉類、奶粉中膽固醇的定量。近紅外光譜技術(shù)往往與化學(xué)計量或人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型相結(jié)合，在相應(yīng)的膽固醇濃度區(qū)間對膽固醇準確定量。近紅外光譜最大的優(yōu)勢是快速無損，綠色環(huán)保。因此，通過定量模型的構(gòu)建與優(yōu)化，未來近紅外光譜技術(shù)在食品中膽固醇的定量仍可作為一種常規(guī)方式。
1.5電化學(xué)法
電化學(xué)法具有高選擇性、易制樣、儀器成本低、簡便快速的優(yōu)點，是膽固醇檢測的常用方式。其中酶傳感器的應(yīng)用由來已久。目前，大多數(shù)利用酶傳感器對膽固醇測定是基于固定在導(dǎo)電聚合物、金屬及其氧化物納米材料、碳納米材料和復(fù)合型納米材料等電極表面的膽固醇氧化酶(cholesteroloxidase，ChOx)的氧化反應(yīng)，通過過氧化氫還原或氧化電流來間接定量膽固醇[27]。XIA等[28]開發(fā)了一種膽固醇氧化酶傳感器，通過加入氧化還原介質(zhì)(Fe(CN)63-)促進膽固醇氧化過程中從分析物到修飾電極的方法，檢出限低至0.11nM。相較于酶電化學(xué)法，非酶傳感器顯示出獨特的優(yōu)越性。
DERINA等[29]報道了一種基于1，4-二乙�；孰宥⑺嶙鳛殡姌O表面修飾劑的新型非酶傳感器，表現(xiàn)出高穩(wěn)定性和高靈敏度，膽固醇能在修飾的碳基電極上獲得穩(wěn)定的陽極響應(yīng)，測得牛奶中膽固醇的量在15~25mg/100g之間，RSD均小于2.6。WILLYAM等[30]制備了一種靈敏、特異和小型化的非酶膽固醇傳感器，通過利用β-環(huán)糊精與含不同濃度膽固醇的溶液之間反應(yīng)釋放的甲基藍電化學(xué)測量結(jié)果作輸入信號來間接計算膽固醇濃度，可以在0~150μmol/L的濃度范圍內(nèi)實現(xiàn)良好的線性以及出色的準確度和可重復(fù)性，檢出限為2.88μmol/L。
電化學(xué)酶傳感器在制備過程中，固載材料和固定方法選擇尤為重要，這直接影響到傳感器的性能。與酶傳感器相似，非酶傳感器的制備也十分依賴電極表面修飾材料的選擇。目前利用電化學(xué)法主要通過收集電信號的形式來間接測定膽固醇的含量，多應(yīng)用于人體的血清[31]，由于食品天然基質(zhì)的復(fù)雜性，電化學(xué)法在食品中膽固醇的定量檢測實踐不多。
迄今為止，比色法、酶-熒光法、色譜法、近紅外光譜法和電化學(xué)法都在食品膽固醇的檢測分析方面有所應(yīng)用，列出了各種方法的優(yōu)缺點。傳統(tǒng)比色法作為最經(jīng)典的食品中膽固醇定量方法一直被沿用，但存在測定誤差，酶比色法和納米探針比色法逐漸被應(yīng)用于膽固醇的定量。
酶-熒光法雖適用于膽固醇的常規(guī)分析，但因食品基質(zhì)的復(fù)雜性，酶-熒光法對膽固醇的測定選擇性較差。色譜法具有選擇性高，分離效果好，分析所需樣品較少的特點，但色譜技術(shù)的性能更依賴于樣品制備，如皂化、萃取和濃縮。近紅外光譜法在食品中膽固醇的檢測分析比較少，對于定量模型的選擇更為重要。電化學(xué)法最主要的特點在于簡便快速，但酶電化學(xué)法的穩(wěn)定性低，溫度和酸堿度等因素會影響實際工作中酶傳感器的性能，而非酶傳感器的主要挑戰(zhàn)是化學(xué)修飾電極選擇性。
2食品中膽固醇的脫除技術(shù)
目前食品中膽固醇的脫除方法包括物理法(蒸餾法、吸附法和超臨界流體萃取法)、化學(xué)法(沉淀法和微膠囊包合法)、生物法(微生物法和酶法)。
2.1物理法
2.1.1蒸餾法
目前食品中膽固醇的脫除方法包括蒸汽蒸餾法和分子蒸餾法。BOUDREAU等[32]提過利用真空蒸汽蒸餾來實現(xiàn)乳脂中膽固醇的分離，在真空環(huán)境中，蒸汽通過鼓泡的形式穿過液態(tài)乳脂，可去除乳脂中93%的游離膽固醇。此法對乳脂中膽固醇的脫除率很高，但實際應(yīng)用成本較高。分子蒸餾法的原理是在合理控制壓強和溫度的情況下，使膽固醇從蒸發(fā)液體的熱表面轉(zhuǎn)移到冷凝器的冷表面，此法要考慮到食品中揮發(fā)性營養(yǎng)物質(zhì)的揮發(fā)和膽固醇氧化的問題。
BERTI等[33]通過分子蒸餾技術(shù)來分離乳脂中的膽固醇，并分析處理前后的感官特性，可除去約60%的膽固醇。此法能用于乳脂中膽固醇的脫除。采用蒸餾法會導(dǎo)致食品中其他揮發(fā)性成分的損失。因此，如何有效地回收這些揮發(fā)性成分是蒸餾法脫除膽固醇亟待解決的問題。
2.1.2吸附法
吸附法是利用物理吸附作用，對食品中的膽固醇進行脫除。朱林韜等[34]分析比較了6種不同的吸附劑對蠶蛹油中膽固醇的脫除效果，其中中性氧化鋁的效果最明顯，膽固醇的脫除率達到(38.24±2.92)%。馮艷平等[35]利用活性白土吸附魚油中的膽固醇，在吸附溫度190℃，時間45min的真空條件下，魚油中膽固醇的脫除率達到72.89%。YILMAZ等[36]利用金屬有機骨架對黃油和羊脂中的膽固醇進行脫除，含金屬的單元與具有永久孔隙率結(jié)構(gòu)的有機分子或晶體框架結(jié)合，鋁-金屬有機骨架和鈦-金屬有機骨架的降膽固醇率分別為27.45%和26.28%，不會對原樣品造成危害。
近年來，分子印跡聚合物(molecularlyimprintedpolymer,MIP)逐漸地應(yīng)用于食品中膽固醇的脫除。KARTAL等[37]開發(fā)了從牛奶樣品中分離膽固醇分子印跡的低溫凝膠珠，具有特定的膽固醇結(jié)合位點，通過吸附牛奶中的膽固醇達到膽固醇脫除的目的，脫除率高達60%，回收率為94.3%~100.3%，相對標(biāo)準偏差為2.0%~5.2%。這表明利用分子印跡低溫凝膠珠吸附牛奶中的膽固醇能達到很好的效果。使用這些吸附材料進行吸附作用時，要同時顧及吸附材料對食品造成的安全性問題。如何減少甚至消除吸附性殘留的危害，開發(fā)更綠色環(huán)保的吸附材料是未來研究的重點方向。
2.1.3超臨界流體萃取法
超臨界流體萃取(Supercriticalfluidextraction，SFE)因良好的萃取效果廣泛用于規(guī)�；a(chǎn)中。利用超臨界CO2萃取法能特定進行膽固醇的分離，并實現(xiàn)CO2的循環(huán)利用。同時合理地改變壓力或溫度能提高超臨界流體的溶解能力，使得從更加復(fù)雜的化合物分離膽固醇成為可能[38]。CHITRA等[39]研究了超臨界CO2萃取對于全脂奶粉中的膽固醇脫除的影響，確定在68℃，20.7MPa的條件下，靜態(tài)時間為40min，動態(tài)時間為2h，流速為6L/min，膽固醇降低約55.8%，且全脂奶粉中的有益成分不會減少。
有研究表明，相較于超臨界CO2，對于某些卵粉的膽固醇溶解性在超臨界四氟乙烷中要好[40]。INDIRA等[41]采用乙醇作為共溶劑的超臨界CO2從全脂奶粉中提取膽固醇，采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝參數(shù)，在48℃、17MPa和31mL共溶劑的優(yōu)化條件下，膽固醇降低了約46%。同時全脂奶粉的脂肪含量、溶解指數(shù)和透光率限值分別為183.67g/kg、96.3%和96.90%，對理化性質(zhì)變化影響不大。超臨界流體萃取法可對特定食品中的膽固醇進行脫除，通過優(yōu)化調(diào)節(jié)超臨界流體的溫度、壓力、密度和流量等參數(shù)，能不斷提高膽固醇的脫除率。
2.2化學(xué)法
2.2.1沉淀法
研究表明，植物中的皂苷可脫除奶油中膽固醇[42]。皂苷可以與膽固醇相互作用，形成膽固醇-皂苷復(fù)合物。在65℃混合1h，通過硅藻土過濾并洗滌可使奶油中的膽固醇減少80%，且不會對奶油產(chǎn)生不良影響。有研究發(fā)現(xiàn)海星中也存在有膽固醇結(jié)合能力的皂苷，最高結(jié)合膽固醇達33%，對食品中的膽固醇的脫除有著重要意義[43]。
RAJU等[44]研究了在不同條件下，利用皂苷和硅藻土聯(lián)合去除凡納濱對蝦頭胸部脂質(zhì)中的膽固醇，在脂質(zhì)與皂苷比例為1:6并混合20倍體積的50%乙醇的條件下，膽固醇去除率達到(88.77±0.18)%。沉淀法所用的天的皂苷可以從人參或者文冠果葉中提取得到[45]，易與膽固醇結(jié)合，具有良好的降膽固醇的功效，優(yōu)化皂苷的提取與尋找有效天然的沉淀材料將有助于這項技術(shù)的發(fā)展。
2.2.2微膠囊包合法
微膠囊包合法的原理是某些具有膽固醇選擇性的高分子化合物與膽固醇相結(jié)合，形成穩(wěn)定的包合復(fù)合物，利用特定的分離技術(shù)，將復(fù)合物從原有的食品體系中分離出來。目前應(yīng)用最多的微膠囊是β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin，β-CD)，利用β-CD對膽固醇的包合進行膽固醇脫除的應(yīng)用十分廣泛。β-CD是由β-1,4-糖苷鍵連接的截錐晶形結(jié)構(gòu)的環(huán)狀寡糖，對膽固醇等非極性分子有親和力，因此β-CD可以與膽固醇形成非共價的主客體包合物。
β-CD無毒、不吸濕、具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和可食用性[46]。劉琳等[47]利用β-CD對牛油中膽固醇的脫除工藝進行了優(yōu)化，膽固醇脫除率可達到(47±1.83)%，且對牛油感官品質(zhì)的影響較小。JIA等[48]開發(fā)合成了一種基于玉米蛋白與β-CD為主體的玉米蛋白-接枝-β-CD薄膜。
這種玉米蛋白-接枝-β-CD薄膜有良好的膽固醇吸附能力，每克薄膜的最大吸附量達(5.70±0.56)mg，在三次重復(fù)使用后仍然保持(3.10±0.89)mg的吸附能力，采用蛋白酶與淀粉酶混合形成的復(fù)合酶1周內(nèi)降解率達到98.81%。在未來的食品工業(yè)中，基于β-CD作為吸附劑對食品中膽固醇脫除的良好效果，以β-CD為主體與某些化合物結(jié)合使用將是食品中膽固醇脫除的重要發(fā)展方向。
2.3生物法
2.3.1微生物法
研究表明，許多微生物都具有轉(zhuǎn)化降解膽固醇的能力，如乳桿菌屬[49-50]、雙歧桿菌屬[51]等。乳酸菌降膽固醇主要機制的爭論在于乳酸菌對膽固醇的共沉淀作用與吸收作用。酵母菌主要通過產(chǎn)生的膽鹽水解酶與膽固醇的共沉淀作用以及酵母菌自身細胞壁上的膳食纖維對膽固醇進行吸收作用。郭晶晶等[49]從然發(fā)酵豆醬樣品中篩選出的3株乳酸菌對膽固醇的降解率分別為34.56%、27.12%和29.20%。
王成濤等[52]利用篩選出的紅球菌和短桿菌用于兩種鮮肉糜中膽固醇的脫除，脫除率分別為40.5%和41.3%，并將其產(chǎn)生的粗酶液應(yīng)用于實際香腸制作中，降膽固醇效果明顯，食品風(fēng)味保持良好。用于食品中膽固醇脫除的微生物最好是從同類型食品中篩選出來，并且盡可能避免對食品的營養(yǎng)與感官品質(zhì)造成影響。盡管如此，考慮到微生物的來源與種類不同，微生物本身的代謝活動也會影響膽固醇的降解作用，微生物對膽固醇的降解均建立在實驗研究的角度，在實際生活中微生物用于食品膽固醇脫除并不廣泛。
2.3.2酶法
相比于直接利用微生物降解膽固醇，多數(shù)研究更傾向于將微生物產(chǎn)生的酶進行分離純化再直接作用于膽固醇的降解。KHIRALLA等[53]從羊肉中篩選出的14種乳酸菌，分離純化的膽固醇氧化酶能對肉湯中90%的膽固醇進行降解。JITPAKDEE等[54]將從發(fā)酵食品中篩選出的兩種乳酸菌共同培養(yǎng)，產(chǎn)出的膽固醇氧化酶能有效的降低牛奶中的膽固醇(10.98±3.80)%。除了膽固醇氧化物酶，從細菌和植物葉子中能夠提取的膽固醇還原酶，可將牛奶、奶油、碎牛肉和豬肉中的膽固醇轉(zhuǎn)化為糞甾烷醇，達到膽固醇脫除的作用。
目前利用微生物降解能力對食品中膽固醇的脫除沒有在食品商業(yè)運作中得到推廣。從微生物中分離出膽固醇氧化酶的方法早已經(jīng)建立，膽固醇還原酶也可通過分離純化得到，但基于膽固醇氧化與還原產(chǎn)物的安全性問題始終沒有定論。目前研究者們也在積極尋找能提出具有膽固醇降解能力的微生物及相關(guān)酶，推動這項技術(shù)的發(fā)展。不同食品中膽固醇的脫除技術(shù)都有優(yōu)勢和局限性。物理法中的蒸餾法和化學(xué)法脫除率高，但會造成食品中部分成分的損失;超臨界流體萃取法和微膠囊包合法適合工業(yè)化生產(chǎn);生物法還處于實驗研究階段。
目前大多數(shù)膽固醇脫除技術(shù)更適用于液體類的食品，如油脂、牛奶、奶油，蛋黃等，固體類食品中膽固醇脫除的技術(shù)并不成熟。從實際食品加工來看，低膽固醇食品的開發(fā)和膽固醇的脫除需要有與之配套的技術(shù)，保持食品原有的風(fēng)味，是目前食品中膽固醇的脫除所面臨的挑戰(zhàn)。
3總結(jié)與展望
隨著經(jīng)濟社會的不斷發(fā)展，人們對食品營養(yǎng)的要求也逐漸提高，低膽固醇食品的開發(fā)有著十分廣闊的發(fā)展前景，因此對現(xiàn)有技術(shù)進行創(chuàng)新是適應(yīng)未來發(fā)展的必由之路。本文系統(tǒng)地闡述了食品中膽固醇的檢測及脫除技術(shù)的應(yīng)用，總結(jié)了各種技術(shù)的優(yōu)勢和局限性。傳統(tǒng)比色法的測定誤差較大，不適合膽固醇的精準定量，新型比色法與酶熒光法均利用膽固醇水解酶的作用產(chǎn)生過氧化氫來間接定量膽固醇，多應(yīng)用于血清、牛奶等液體樣品中膽固醇的檢測。由于食物天然基質(zhì)的復(fù)雜性，近紅外光譜法和電化學(xué)法測定食品中的膽固醇的應(yīng)用有限。色譜法因具有選擇性高，分離效果好，分析所需樣品較少的特點，是目前食品中膽固醇檢測最主流的方法。
色譜法應(yīng)用廣泛，不僅可以定量牛奶、動物油以及蛋黃液等液體樣品中的膽固醇，各類動物組織肉、水產(chǎn)品中的膽固醇都可采用色譜法進行分離定量。針對未來食品中膽固醇的檢測，色譜法仍是最受歡迎的檢測技術(shù)，尤其是氣相色譜-質(zhì)譜法和高效液相色譜法。
建立一套針對不同類型食品的檢測體系勢在必行，可以更加快速、準確地對食品中的膽固醇進行檢測定量。特定食品中膽固醇脫除也是符合未來人們對食品安全的要求。從目前脫除技術(shù)的特點來看，微膠囊包合法和超臨界流體萃取法可大規(guī)模應(yīng)用于商業(yè)性膽固醇的脫除。
以β-環(huán)糊精為主的微膠囊包合法和以CO2為主的超臨界流體萃取法可使鮮奶、稀奶油、蛋黃液中膽固醇得以脫除，為生產(chǎn)低膽固醇奶、低膽固醇奶油(奶油粉)，以及低膽固醇蛋黃粉奠定了堅實的基礎(chǔ)。β-環(huán)糊精法的應(yīng)用也為我國乳制品的生產(chǎn)提出了新的方向，而超臨界CO2流體萃取法也成為奶制品中膽固醇脫除的重要手段，可以通過研究超臨界流體萃取法的工業(yè)化工藝來降低其對試劑的限制。
隨著人們對微生物降膽固醇的研究，考慮其成本、效率和安全性等使該方法的工業(yè)化成為可能。目前研究者們也在積極尋找能提取出具有膽固醇降解能力的微生物及相關(guān)酶，這必然會推動這項技術(shù)的發(fā)展。未來可通過多種膽固醇脫除技術(shù)的結(jié)合，構(gòu)建高效、綠色、經(jīng)濟和保質(zhì)的聯(lián)合脫除技術(shù)，以滿足實際食品生產(chǎn)的需要。
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作者：胡磊1，謝慶超1,2，劉會1，劉海泉1,2,3，趙勇1,2,3
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