本文摘要：摘要：草酸(oxalicacid)是一種重要的生物代謝產(chǎn)物，廣泛分布于植物、動(dòng)物和微生物中，在不同的生命體中發(fā)揮重要功能。本文回顧了國內(nèi)外關(guān)于真菌草酸的相關(guān)研究進(jìn)展。許多真菌能夠分泌草酸，包括植物病原真菌、食藥用真菌及工業(yè)真菌等。草酸作為一種簡單的二元羧酸，在
摘要：草酸(oxalicacid)是一種重要的生物代謝產(chǎn)物，廣泛分布于植物、動(dòng)物和微生物中，在不同的生命體中發(fā)揮重要功能。本文回顧了國內(nèi)外關(guān)于真菌草酸的相關(guān)研究進(jìn)展。許多真菌能夠分泌草酸，包括植物病原真菌、食藥用真菌及工業(yè)真菌等。草酸作為一種簡單的二元羧酸，在真菌中主要通過三羧酸循環(huán)途徑、乙醛酸循環(huán)途徑和草酰乙酸途徑合成。草酸是真菌產(chǎn)生的一種重要的生物因子，能夠影響真菌的生長與發(fā)育，還能夠通過毒素作用、酸化寄主組織環(huán)境、參與細(xì)胞壁降解和誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生等作用方式，在真菌與寄主植物的互作中發(fā)揮作用，在真菌的生活史和侵染循環(huán)中發(fā)揮重要的生物學(xué)和病理學(xué)作用。本文從草酸的理化特性、代謝途徑、產(chǎn)草酸的真菌種類、草酸的作用、草酸相關(guān)基因功能等方面進(jìn)行綜述，并對未來真菌草酸研究應(yīng)關(guān)注的問題提出了建議。
關(guān)鍵詞：真菌，草酸，代謝，致病性，脅迫
草酸(oxalicacid，OA)是一種廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物等生物體內(nèi)的重要代謝產(chǎn)物[1]。真菌能夠合成并分泌草酸以維持生存環(huán)境中適宜的pH值[2]。草酸在真菌生長發(fā)育、環(huán)境(生物和非生物因素)脅迫響應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用[3-5]。
生物方向評職知識(shí)：生物質(zhì)轉(zhuǎn)化方面論文發(fā)表期刊
1草酸理化特性
草酸又稱乙二酸，作為眾多有機(jī)強(qiáng)酸中一種最簡單的二元羧酸，易溶于乙醇，可溶于水，微溶于乙醚，不溶于苯和氯仿等有機(jī)溶劑。草酸是無色透明晶體或粉末，通常以二水化合物(H2C2O42H2O)形態(tài)存在于自然界，具有2種晶體結(jié)構(gòu)形態(tài)(菱形的α型和單斜晶形的β型)，相對密度約為1.65，晶體折射率為1.54[6]。草酸在190°C或遇濃硫酸時(shí)分解成二氧化碳(CO2)、一氧化碳(CO)及水[7]。草酸的酸度比醋酸強(qiáng)約一萬倍，具有酸的通性，也是一種強(qiáng)還原劑。草酸還具有毒性和腐蝕性，也是一種強(qiáng)螯合劑，能夠與金屬離子(如鈣離子Ca2+)等螯合形成草酸鹽(如草酸鈣等)[2]。其中，真菌中草酸通常以草酸鹽的形態(tài)存在[8]。
2草酸代謝途徑
草酸是生物體內(nèi)一種重要的代謝產(chǎn)物[1]。其中植物草酸合成途徑主要包括乙醛酸/乙醇酸途徑、抗壞血酸途徑和草酰乙酸途徑[9-10]。不同于植物，真菌草酸合成主要是通過三羧酸循環(huán)(tricarboxylicacidcycle，TCA)、乙醛酸循環(huán)(glyoxylicacidcycle，GAC)和草酰乙酸途徑 [2,11]，其中草酰乙酸途徑起源尚未明確[12]。真菌草酸合成的相關(guān)研究開展較早，1877年首次報(bào)道在27種真菌培養(yǎng)基中檢測到草酸[13]。1900年在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的液體培養(yǎng)基中也發(fā)現(xiàn)草酸，隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)眾多真菌能夠合成草酸[14]。真菌中影響草酸生物合成的因素主要包括碳源、氮源等營養(yǎng)條件以及pH值等環(huán)境因素[11]。
例如，寄生隱叢赤殼(Cryphonectriaparasitica)在以碳酸鈣為碳源的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的草酸最多，在pH值達(dá)到5.0及以上時(shí)積累大量草酸[15]。同時(shí)，草酸的產(chǎn)生也與多種酶有關(guān)。例如，核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)的草酸合成主要通過草酰乙酸乙酰水解酶(oxaloacetateacetylhydrolase，OAH)催化水解草酰乙酸(oxaloaceticacid)生成草酸[16]。此外，核盤菌的過氧化物酶體系內(nèi)的肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(carnitineacetyltransferase，CAT)也參與調(diào)控草酸的合成[4]。
草酸的降解主要有氧化和脫羧兩種途徑。其中，氧化途徑由草酸氧化酶(oxalateoxidase，OXO)催化，使草酸轉(zhuǎn)化為二氧化碳(CO2)和過氧化氫(H2O2)，主要存在于部分真菌如淡黃褐栓菌(Trametesochracea)和小麥矮腥黑粉菌(Tilletiacontraversa)中[17];而脫羧途徑主要存在于部分真菌如黑曲霉(Aspergillusniger)和綿腐臥孔菌(Postiaplacenta)內(nèi)，通過草酸脫羧酶(oxalatedecarboxylase，ODC)使草酸轉(zhuǎn)化為甲酸(HCOOH)和二氧化碳(CO2)[18]。
例如，在環(huán)境pH呈酸性條件下，黑曲霉(.niger，pH1.1)的ODC活性被誘導(dǎo)增加，以降低OA等無機(jī)酸對生長的抑制作用[19];綿腐臥孔菌(Postiaplacenta)通過ODC降解草酸，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和菌絲周圍的草酸濃度[11]。另外，真菌草酸降解途徑作為靶標(biāo)已用于真菌病害的防治。
通過調(diào)控植物的OXO和ODC表達(dá)分解草酸，減弱草酸作用，抵御病原真菌的侵染，提高植物抗性[20-21]。例如，過表達(dá)OXO基因的轉(zhuǎn)基因番茄對草酸具有較高的耐受性，活性氧的積累能力增強(qiáng)，對灰霉病和菌核病的抗性提高[22]，轉(zhuǎn)基因大豆也具有明顯的抗菌核病性狀[23-24]。此外，過表達(dá)ODC基因的轉(zhuǎn)基因番茄和萵苣對核盤菌具有顯著的抗性[25-26]。
3產(chǎn)草酸真菌
文獻(xiàn)檢索(1877−2021年)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，多種真菌能夠產(chǎn)生草酸。產(chǎn)草酸真菌的種類主要屬于子囊菌門和擔(dān)子菌門。其中，植物病原真菌主要包括：引起玉米、高粱、花生、蘋果等腐爛病[27]的曲霉屬(Aspergillus)真菌，導(dǎo)致番茄、瓜類、煙草和豆科等灰霉病[28]的葡萄孢屬(Botrytis)真菌，造成向日葵、油菜、大豆等油料作物及郁金香等園藝作物菌核病[29]的核盤菌屬(Sclerotinia)真菌。此外，一些菌根真菌如網(wǎng)褶菌屬(Paxillus)[30]、部分降解木質(zhì)素的工業(yè)真菌如栓孔菌屬(Trametes)[11]及少量食用菌如金錢菌屬(Collybia)[31]也能夠產(chǎn)生草酸。
4真菌草酸的作用
4.1影響真菌的生長與發(fā)育
研究表明，草酸能夠影響真菌的生長與發(fā)育[62]。例如核盤菌通過產(chǎn)生草酸以營造適宜菌核發(fā)育的酸性環(huán)境，實(shí)現(xiàn)對不良環(huán)境的抗逆性[63-64]。核盤菌菌核滲出液中的草酸可促進(jìn)真菌分泌的細(xì)胞壁降解酶的活性降解寄主植物細(xì)胞壁，并為菌核發(fā)育提供營養(yǎng)來源[65]。
核盤菌分泌的草酸降低環(huán)境pH值，進(jìn)而提高絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)的活性，調(diào)控菌核的發(fā)育[66];肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(carnitineacetyltransferase，CAT)的缺失引起核盤菌Ssoah1基因的表達(dá)降低，進(jìn)而草酸分泌減少，導(dǎo)致菌核發(fā)育缺陷、附著胞畸形及侵染墊(infectioncushion)功能喪失[4]。通過紫外線誘導(dǎo)或同源重組的方法獲得的核盤菌oah基因突變體菌株，表現(xiàn)為草酸合成及菌核形成能力降低[67-68]。
此外，綿腐臥孔菌(.placenta)通過分泌OXO降解草酸，以維持營養(yǎng)體菌絲周圍的pH值，避免草酸濃度過高而抑制菌絲生長[11]。草酸還能夠抑制重寄生真菌小盾殼霉(Coniothyriumminitans)的菌絲生長和孢子萌發(fā)，減弱其對核盤菌的重寄生作用[69]。
4.2參與病原真菌的致病性及與寄主植物互作
草酸是死體營養(yǎng)型(necrotrophic)植物病原真菌侵染植物的關(guān)鍵因素之一，是一種重要的致病或毒性因子[21,36]。草酸通過毒素作用、酸化寄主植物組織環(huán)境、參與細(xì)胞壁降解和誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)等方式，在真菌與寄主植物的互作中發(fā)揮重要作用[2,51]。
(1)毒素特性草酸具有毒素作用，誘導(dǎo)寄主植物形成與病原真菌(如核盤菌)侵染相似的癥狀，在真菌侵染過程中發(fā)揮重要作用[36]。例如，核盤菌在侵染初期分泌大量草酸，在寄主組織中不斷積累;隨著侵染部位草酸濃度的不斷升高，在胞間層內(nèi)直接產(chǎn)生毒素作用，引起寄主細(xì)胞壞死[70-71]，影響患病植物逆境響應(yīng)調(diào)控[72]。此外，一些植物(如大麥、玉米、燕麥、大米、黑麥、小麥等)具有OXO活性，可以將真菌分泌的草酸氧化分解為H2O2，既降低草酸的毒素作用，同時(shí)產(chǎn)生的H2O2也不利于病原真菌的侵入及擴(kuò)展[73]。
(2)酸化作用真菌通過分泌草酸營造有利于侵染的酸性環(huán)境[70]。例如，核盤菌在侵染初期分泌草酸，酸化寄主細(xì)胞環(huán)境，利于病原菌侵染[74-75]。隨著寄主植物細(xì)胞環(huán)境酸度增加，細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化水平也隨之升高，進(jìn)而改變細(xì)胞的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞喪失水分并引起細(xì)胞器結(jié)構(gòu)損傷，加速細(xì)胞死亡[16,76]。
草酸可調(diào)節(jié)植物保衛(wèi)細(xì)胞(guardcell)的開放。病原真菌分泌并積累草酸，調(diào)控離子(如K+)通道，干擾脫落酸(abscisicacid)誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉，利于病原真菌侵入寄主植物[74]。在病原菌侵染過程中，真菌分泌的草酸誘導(dǎo)寄主植物的ROS反應(yīng)及細(xì)胞程序性死亡(programmedcelldeath，PCD)[21]。此外，草酸與磷酸根離子(PO43−)存在顯著正相關(guān)性，菌根真菌(mycorrhiza)分泌的草酸能夠增強(qiáng)土壤中磷元素溶解和流動(dòng)[77]。
例如，草酸青霉(.oxalicum)和黑曲霉(.niger)能夠通過產(chǎn)生草酸營造酸性環(huán)境以提高難溶性磷化合物的溶解[44]。許多菌根真菌通過分泌草酸與銨離子結(jié)合形成草酸銨(ammoniumoxalate)，實(shí)現(xiàn)對重金屬離子(如鉛、銅和鋅離子)的耐受性[8]。另外，菌根真菌分泌的草酸也加速土壤風(fēng)化，提高伴生植物吸收營養(yǎng)的有效性[2]。例如，真菌草酸通過螯合土壤中的鋁和鐵影響鋁離子和鐵離子的運(yùn)輸，促使磷酸鹽易被植物根系吸收[78-80]。
(3)細(xì)胞壁降解酶的酶促活性
植物細(xì)胞壁具有抵御病原真菌侵染及逆境的作用[81]，而植物病原真菌侵染和定殖通常與寄主的細(xì)胞壁降解相關(guān)[58]。植物病原真菌致病過程中產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶類(cellwalldegradingenzyme，CWDE)，如纖維素酶(cellulase)、木質(zhì)素降解酶(lignindegradingenzyme)、果膠酶(pectinase)和多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)等，降解寄主植物角質(zhì)層和細(xì)胞壁，實(shí)現(xiàn)侵染與擴(kuò)展[82]。隨著病原菌的侵染及定殖，草酸的積累導(dǎo)致CWDE活性增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)真菌侵入及病害擴(kuò)展[83]。
例如，真菌分泌的PG有助于真菌的侵入和定殖，而真菌分泌的草酸能夠?qū)⒓闹鹘M織的pH值降至PG活性適宜水平[84-85]。典型的死體營養(yǎng)型植物病原真菌(如核盤菌和灰霉菌)通過分泌草酸可將侵染部位細(xì)胞環(huán)境pH值降至5.0左右，而這類真菌所產(chǎn)生的CWDE(如PG)活性最適pH值一般小于6.0[86]。真菌草酸發(fā)揮協(xié)同作用，使立枯絲核菌(.solani)和齊整小核菌(S.rolfsii)分泌的PG更易水解寄主植物果膠層，有助于病原菌的侵入[87]。
此外，真菌草酸也通過螯合植物細(xì)胞壁的鈣離子(Ca2+)形成草酸鈣晶體，創(chuàng)造有助于真菌侵入寄主細(xì)胞角質(zhì)層的環(huán)境，加速患病組織的細(xì)胞壁降解，破壞寄主植物細(xì)胞壁完整性及免疫反應(yīng)[2,88]。草酸還能夠影響植物產(chǎn)生的抑制真菌PG活性的蛋白(如polygalacturonase-inhibitingprotein，PGIP)活性，從而逃避植物防衛(wèi)反應(yīng)[89]。
(4)誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生植物病原真菌侵染寄主過程中，草酸作用具有兩面性[5]。一方面，草酸在侵染過程中誘導(dǎo)寄主植物ROS產(chǎn)生，促進(jìn)核盤菌的侵染[66];另一方面，草酸抑制寄主植物氧暴發(fā)反應(yīng)，改變寄主體內(nèi)氧化還原水平，解除寄主防衛(wèi)反應(yīng)，誘導(dǎo)寄主PCD實(shí)現(xiàn)真菌的侵染和擴(kuò)展[68]。例如，核盤菌分泌的草酸降低患病細(xì)胞環(huán)境pH值或螯合鈣離子來抑制寄主的氧暴發(fā)反應(yīng)，或直接抑制氧暴發(fā)相關(guān)的多酚氧化酶(polyphenoloxidase)、阻斷氧化酶激活的識(shí)別信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低寄主的抗性[21,90]。
此外，核盤菌侵染過程中，草酸發(fā)揮動(dòng)態(tài)調(diào)控作用。核盤菌侵染初期，草酸抑制ROS產(chǎn)生和胼胝質(zhì)(callose)沉積等防衛(wèi)反應(yīng);而侵染后期，草酸誘導(dǎo)寄主的ROS水平升高，誘發(fā)寄主細(xì)胞PCD反應(yīng)，促進(jìn)腐生性病原菌在寄主內(nèi)的進(jìn)一步擴(kuò)展[63]。蛋白質(zhì)組水平分析也表明，草酸通過調(diào)控ROS與植物激素信號網(wǎng)絡(luò)，誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生抗性[72]。因此，低濃度草酸已用于抗灰霉病的番茄品種選育[91]。
5草酸相關(guān)基因功能
植物病原真菌的草酸合成及其他相關(guān)調(diào)控基因的功能研究逐漸開展，主要影響真菌的草酸代謝、生長和發(fā)育、致病性等。其中，真菌草酸合成相關(guān)基因研究表明，核盤菌Ssoah基因突變導(dǎo)致草酸無法產(chǎn)生且菌核形成受阻[68]。近期，有研究發(fā)現(xiàn)microRNA-likeRNAs通過靶向草酸相關(guān)基因(如oah)參與核盤菌草酸合成與調(diào)控[92]�；颐咕鶥cOah基因敲除后致病性減弱和毒性降低[28]。金黃殼囊孢菌(Cytosporachrysosperma)的CcOah缺失，導(dǎo)致無法合成草酸、分生孢子數(shù)量減少、毒性顯著降低[40]。真菌草酸降解相關(guān)基因具有重要的作用，例如核盤菌Ssodc2基因敲除后草酸和致病性顯著降低[93]。
此外，一些基因也影響真菌草酸的產(chǎn)生，例如核盤菌SsCaf1和SsSOD1基因敲除后草酸分泌的能力明顯下降，生長發(fā)育及致病性等也顯著受阻[94-95]。核盤菌黑色素合成途徑SCD1和THR1基因缺失，能夠降低草酸的產(chǎn)生，影響菌核發(fā)育[96]。黑曲霉OAH基因敲除后草酸的合成完全被阻斷[27]，過表達(dá)oahA基因的黑曲霉的草酸產(chǎn)量約為野生型菌株的2倍[33]。
6展望
真菌分泌的草酸具有多種功能和作用，在真菌的生長發(fā)育及侵染寄主植物等方面具有重要意義。本文梳理了真菌草酸的理化特性、代謝途徑、產(chǎn)草酸真菌種類、作用影響及相關(guān)基因功能等研究進(jìn)展，總結(jié)了草酸在真菌的生長發(fā)育和致病機(jī)制等方面的重要作用，但關(guān)于真菌草酸的系統(tǒng)性研究仍有待加強(qiáng)。未來真菌草酸研究的開展應(yīng)關(guān)注以下幾個(gè)方面：
(1)產(chǎn)生草酸的真菌資源調(diào)研與利用范圍有待拓展，特別是模式真菌及重要植物病原真菌;(2)真菌草酸的完整合成途徑及調(diào)控機(jī)制仍有待明確，如草酰乙酸途徑源于TCA或GAC或兩者尚未解析。(3)草酸對真菌生命活動(dòng)的作用仍有待系統(tǒng)性開展，包括高通量組學(xué)分析發(fā)掘大數(shù)據(jù)信息并構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)或發(fā)掘重要因子，采用多種技術(shù)(如基因敲除、RNAi沉默、CRISPR/Cas等)明確基因功能等;(4)產(chǎn)生草酸的植物病原真菌引起的作物病害綠色防控方法有限，隨著農(nóng)藥過量使用、環(huán)境污染及抗藥性發(fā)生等問題不斷出現(xiàn)，加快探索植物病原真菌的致病機(jī)理與重要致病因子(如草酸)的生物學(xué)功能具有重要意義。
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作者：王澤昊，田佳美，孫慧穎，丁鋮松，安夢楠，楊新宇，梁月
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