奈立膦酸鈉原料藥有關(guān)物質(zhì)方法學(xué)研究

　　摘要：目的本文采用了薄層色譜法，容量法以及高效液相色譜法對奈立膦酸鈉的原料藥中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了測定。方法采用薄層色譜法對奈立膦酸鈉的起始原料6-氨基己酸以及磷酸鹽雜質(zhì)的含量進(jìn)行測定，采用容量法對亞磷酸鹽雜質(zhì)進(jìn)行研究，原料藥中的未知雜質(zhì)則通過高效液相色譜法進(jìn)行測定。結(jié)果本實驗設(shè)計的薄層色譜法檢測6-氨基己酸以及磷酸鹽含量能夠準(zhǔn)確分離奈立膦酸鈉和雜質(zhì)，專屬性很好，原料藥樣品中未檢出6-氨基己酸以及磷酸鹽雜質(zhì)。容量法檢測原料藥的亞磷酸鹽含量結(jié)果顯示，該方法專屬性、線性、精密度和準(zhǔn)確度均滿足要求。未知雜質(zhì)通過高效液相色譜法進(jìn)行檢測，報告顯示未有未知雜質(zhì)檢出。

　　關(guān)鍵詞：奈立膦酸鈉有關(guān)物質(zhì)薄層色譜法容量法

　　醫(yī)學(xué)論文投稿刊物：《第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報》是經(jīng)中國人民解放軍總政治部、國家新聞出版署批準(zhǔn)，由第二軍醫(yī)大學(xué)主管、主辦，國內(nèi)外公開發(fā)行的綜合性醫(yī)藥衛(wèi)生類學(xué)術(shù)刊物，1980年6月創(chuàng)刊。主要報道基礎(chǔ)、臨床、預(yù)防、軍事醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和中國醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的最新科研成果。

　　前言

　　奈立膦酸鈉(NeridronateSodium)化學(xué)名為6-氨基-1-羥基亞己基-1,1-二膦酸一鈉鹽，是一種抑制甲羥戊酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶(FPP合成酶)，能夠干擾破骨細(xì)胞的骨吸收和成活所必要的一系列細(xì)胞功能，[1-4]具有抑制破骨細(xì)胞活性，減少骨量流失的作用[5-7]。奈立膦酸鈉是由意大利AbiogenPharmaS.P.A.開發(fā)一種含氮的雙膦酸鹽，劑型為注射液，規(guī)格為1)2ml：25mg，2)8ml：100mg(按奈立膦酸計)，商品名為NERIXIA[8-9]，以復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征Ⅰ(CRPS-Ⅰ)和成骨不全癥(OI)為適應(yīng)癥于2002年在意大利上市[10]，但是各國的藥典都沒有收載奈立膦酸鈉的原料藥和制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

　　本實驗基于對奈立膦酸鈉的工藝研究，對其原料藥中可能出現(xiàn)的雜質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測，包括起始原料6-氨基己酸、磷酸鹽、亞磷酸鹽以及未知雜質(zhì)。本文中簡要闡述了6-氨基己酸的薄層色譜檢測法，磷酸鹽的薄層色譜檢測法，亞磷酸鹽的容量檢測法以及檢測未知雜質(zhì)的HPLC法，并對各個檢測方法進(jìn)行方法學(xué)驗證，期望能為后續(xù)的奈立膦酸鈉原料藥及制劑的雜質(zhì)檢測提供依據(jù)。

　　1儀器與試藥

　　PerkinElmer200系列高效液相色譜儀，PerkinElmerTotalchrom工作站，恒溫干燥箱，薄層涂板(20*20cm，0.1mm，無熒光指示劑纖維素)奈立膦酸鈉對照品()，奈立膦酸鈉原料藥(批號78821,78819)，甲醇，乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

　　2方法與結(jié)果

　　2.1

　　6-氨基己酸精密稱取12.5mg的6-氨基己酸，置于100mL量瓶中，然后用水稀釋至刻度作為對照品母液，隨后從母液中取出1ml到10ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為6-氨基己酸對照品溶液。精密稱取50mg供試品，在10mL量瓶中溶解，用水稀釋至刻度，作為供試品溶液。精密稱取50mg奈立膦酸鈉，取1mL的對照品母液，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，用水定容到刻度作為混合溶液。

　　2.1.1薄層色譜條件

　　通過TLC法進(jìn)行檢測，采用的試驗條件見下表。分別將上述的溶液于板上點(diǎn)樣：40μL溶液對照品溶液，40μL供試品溶液，40μL混合溶液;展開之后，薄層板置于空氣中晾干，噴以含0.2%茚三酮的乙醇溶液，置于100℃中干燥5分鐘。6-氨基己酸的對應(yīng)斑點(diǎn)為紫色，其Rf值約為0.81;奈立膦酸鈉的對應(yīng)斑點(diǎn)為粉紅色，其Rf值約為0.38。在供試品溶液色譜圖中的6-氨基己酸的對應(yīng)斑點(diǎn)不得比其在對照品溶液色譜圖中更深�；旌先芤荷�譜圖顯示的6-氨基己酸和奈立膦酸鈉的斑點(diǎn)應(yīng)顯示清晰分離。

　　2.1.2方法驗證

　　2.1.2.1專屬性實驗

　　分別按2.1項下供試品溶液配制方法制備不同批次的奈立膦酸鈉的水溶液(批號78821,78819)作為供試品溶液，分別將40μL的溶液6-氨基己酸對照品、78821批奈立膦酸鈉水溶液、78819批奈立膦酸鈉水溶液和混合溶液分別點(diǎn)在薄層板上，保溫45℃。讓溶劑展開大約15cm，干燥薄層板。對照品溶液和混合溶液點(diǎn)樣兩次。向薄層板噴以顯色劑，并在100℃的通風(fēng)烘箱中干燥5分鐘。奈立膦酸鈉對照品和樣品的Rf值在0.35左右，6-氨基己酸的Rf值在0.72左右，結(jié)果顯示TLC法能夠突出雜質(zhì)，并能準(zhǔn)確分離奈立膦酸鈉和雜質(zhì)，不存在對檢測的干擾。樣品中未出現(xiàn)可檢測到的6-氨基己酸。

　　2.1.2.2檢測限用從40μL到5μL逐漸減量的對照品溶液，同時加40μL供試品溶液點(diǎn)樣，噴以顯色劑，并在100℃的通風(fēng)烘箱中干燥5分鐘。結(jié)果顯示，TLC法顯示6-氨基己酸的檢測限為120ng。

　　2.2磷酸鹽精密稱取50mg奈立膦酸鈉原料藥及對照品，置于10mL量瓶中，然后用水稀釋至刻度，分別作為奈立膦酸鈉供試品和對照品溶液。精密移取0.23mL85%磷酸至100mL量瓶中，用水稀釋至刻度。吸取0.5mL此溶液置于100mL量瓶中，用水稀釋至刻度，作為磷酸鹽對照溶液。

　　2.2.1薄層色譜條件通過TLC法進(jìn)行檢測，采用的試驗條件見下表分別取上述溶液進(jìn)行點(diǎn)板：40μL的奈立膦酸鈉溶液;40μL奈立膦酸鈉對照品溶液和12μL磷酸鹽對照品溶液;12μL的磷酸鹽對照品溶液。展開之后，干燥薄層板，噴以顯色劑(1)，100℃加熱5分鐘。冷卻到室溫后噴以顯色劑(2)。出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，其強(qiáng)度隨時間增長。反應(yīng)6小時后，觀察薄層板發(fā)現(xiàn)，磷酸鹽和奈立膦酸鈉對照品的對應(yīng)斑點(diǎn)應(yīng)清晰分離。在奈立膦酸鈉溶液色譜圖中的磷酸鹽的對應(yīng)斑點(diǎn)不得比其在磷酸鹽對照品的色譜圖中的更大更深。

　　2.2.2方法學(xué)驗證

　　2.2.2.1專屬性

　　分別取40μL的奈立膦酸鈉溶液;40μL奈立膦酸鈉對照品溶液(WS)和12μL磷酸鹽對照品溶液;12μL的磷酸鹽對照品溶液點(diǎn)三個點(diǎn)。薄層板保溫45℃。讓溶液展開大約15cm，在空氣中正確干燥薄層板。噴以顯色劑(1)，并立即將薄層板置于100℃的通風(fēng)烘箱中干燥5分鐘，然后冷卻，再噴以顯色劑(2)。奈立膦酸鈉對照品和樣品的Rf值約為0.53，磷酸鹽的Rf約為0.75。結(jié)果顯示TLC法能夠突出雜質(zhì)，并能準(zhǔn)確分離奈立膦酸鈉和雜質(zhì)，不存在對檢測的干擾，并且樣品中未出現(xiàn)可檢測到的磷酸鹽。

　　2.2.2.2檢測限

　　用從12μL到1.5μL逐漸減量的磷酸鹽對照溶液同時加40μL供試品溶液點(diǎn)樣。噴以顯色劑(1)，并立即在100℃的通風(fēng)烘箱中干燥5分鐘(避免薄層板觸碰到烘箱壁)，然后冷卻，再噴以顯色劑(2)。由結(jié)果可知，TLC法顯示磷酸鹽的檢測限為50ng。

　　2.3亞磷酸鹽

　　準(zhǔn)確稱取3.5g奈立膦酸鈉供試品，置于250mL具塞量瓶中，加70mL水。在攪拌的條件下加入20mL緩沖液(準(zhǔn)確稱量6.9g磷酸二氫鈉，溶解在500mL水中，加入400mL0.1N氫氧化鈉配制);加入25%氫氧化鈉，檢查pH(使用玻璃電極)至pH達(dá)7.3±0.2。向得到的溶液中加入20mL0.1NI2溶液，停止攪拌，避光靜置3小時。用6N乙酸調(diào)節(jié)pH至4.5±0.2。

　　用0.1N硫代硫酸鈉滴定至呈微黃色。然后加入2mL淀粉溶液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失。進(jìn)行空白滴定，從而進(jìn)行校正。使用下面的公式計算亞磷酸鹽的含量：亞磷酸鹽含量=0.520×其中：Vb=表示空白滴定消耗的0.1N硫代硫酸鈉溶液容積(mL)Vc=表示樣品滴定消耗的0.1N硫代硫酸鈉溶液容積(mL)W=表示樣品的重量，單位用g表示。

　　2.3.1方法學(xué)驗證

　　2.3.1.1專屬性對6份空白溶液進(jìn)行分析，以評價方法的專屬性。溶液中包含除了奈立膦酸鈉原料藥外制備樣品溶液的所有試劑�？瞻讟悠返味ㄏ�耗硫代硫酸鈉體積的平均值為19.80mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.23%。說明本實驗方法專屬性良好。

　　2.3.1.2QL(定量濃度)測定確定目標(biāo)分析物的QL濃度為相對于樣品中奈立膦酸鈉的理論濃度的0.10%。進(jìn)行3次獨(dú)立測定。QL測定的結(jié)果顯示，在QL水平上，亞磷酸鹽的平均回收率為100.1%，RSD值為3.7%。

　　2.3.1.3線性線性評價范圍在QL～0.8%的奈立膦酸鈉量的理論濃度之間。線性回歸方程是y=0.071x+0.188，相關(guān)系數(shù)(R2)為1.000，說明該方法用于檢測亞磷酸鹽的濃度可行。

　　2.3.1.4精密度

　　重復(fù)性：取6份獨(dú)立原料藥樣品進(jìn)行含量測定。如果亞磷酸鹽量低于估算的QL，那么樣品中加入29.08mgNaH2PO3·5H2O(相當(dāng)于0.4%)。中間精密度：第二個分析員在不同日期對相同的批次原料藥重復(fù)進(jìn)行精密度試驗。精密度試驗中得到的兩組亞磷酸鹽回收率數(shù)據(jù)無統(tǒng)計學(xué)差異，應(yīng)用單因素ANOVA檢驗(p=0.05，單側(cè))，計算的t值(2.26)低于臨界值表中值(4.96)。因此，方法的精密度，即重復(fù)性和中間精密度，都滿足要求。

　　2.3.1.5準(zhǔn)確度

　　準(zhǔn)確度評價范圍在QL～0.8%的奈立膦酸鈉量之間。向奈立膦酸鈉活性物質(zhì)溶液中加入已知量的亞磷酸鹽得到各樣品，通過本方法檢測亞磷酸鹽含量，記錄回收率和RSD值。結(jié)果顯示回收率在98.9%~104.1%之間，RSD值為2.0%，滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。

　　2.4未知雜質(zhì)

　　采用HPLC法檢測奈立膦酸鈉原料藥中的未知雜質(zhì)含量。準(zhǔn)確稱量27.0mg奈立膦酸鈉工作對照品，置于250mL量瓶中。加入約100mLHPLC用水，然后用同一溶劑稀釋至刻度。取配成的溶液50mL，轉(zhuǎn)移至100mL量瓶中，然后用0.2M枸櫞酸鈉溶液稀釋至刻度。在Sovirel玻璃管中依次加入：5.0mL對照品溶液，5.0mL0.1M硼酸鈉(pH9.0)，振搖，在加入5.0mLFMOC溶液(取250mg9-芴甲基氯甲酸酯至250mL量瓶中，用乙腈溶解稀釋至刻度)，機(jī)械振搖約10秒，在室溫下靜置25分鐘。加入25mL的二氯甲烷，振搖30～45秒，靜置以便兩相分離。取上層水相(必須澄清)作為對照品溶液。同法取27.0mg的奈立膦酸鈉原料藥配制供試品溶液。

　　2.4.1色譜條件

　　色譜柱：PolymerxRP1(5μm，250×4.6mm)或等效柱;流動相為乙腈-甲醇-pH5緩沖液24：6：70(pH5.0緩沖液配制：取1000mL量瓶，將14.7g二水枸櫞酸鈉和7.05g無水磷酸氫二鈉溶解在900mLHPLC用水中，磷酸調(diào)節(jié)至pH5，然后加HPLC用水稀釋至刻度)。流速1.0mL/min等度洗脫，檢測波長：265μm，柱溫：35℃，進(jìn)樣體積:50μL，奈立膦酸鈉的保留時間約為9.5min。

　　2.4.2方法學(xué)驗證

　　2.4.2.1專屬性A.分別取1%及0.1%奈立膦酸鈉對照品溶液(0.0025mg/5mL和0.00025mg/5mL)、供試品溶液以及6-氨基己酸(起始物料)對照溶液(0.0025mg/5mL)，色譜圖見圖5，在目標(biāo)峰下無溶劑峰或起始物料峰的干擾，證明了其專屬性合格。本實驗同時還驗證了該方法的破壞專屬性，分別取在高溫條件下(70℃)處理5天的樣品以及室溫下處理48h的樣品進(jìn)行檢測，圖譜分別見圖6，奈立膦酸鈉原料藥在試驗條件下相當(dāng)穩(wěn)定，活性成分峰始終純凈，未檢測到含量超過最低檢測限的降解產(chǎn)物。

　　2.4.2.2定量限(LOQ)和檢測限(LOD)目標(biāo)分析物的定量限和檢測限通過特定校正曲線確定，校正曲線采用能達(dá)到的盡可能低的濃度(0.03%活性成分，即0.000075mg/5mL)。各溶液進(jìn)樣3次。結(jié)果評價根據(jù)線性回歸線的斜率和截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行。活性成分的LOD和LOQ計算值用未知雜質(zhì)按相對奈立膦酸的面積百分比進(jìn)行定量，LOD相當(dāng)于3.3σ/S，LOQ相當(dāng)于10σ/S。(σ為截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為線性回歸的斜率)。計算得到的LOQ值為0.0005mg/5mL，LOD值為0.00025mg/5mL。

　　2.4.2.3線性線性評價范圍為LOQ到樣品溶液活性成分濃度(0.25mg/5mL)的1.3%。線性試驗的溶液配制濃度0.00025、0.0125、0.00250、0.00325mg/5mL。每份溶液進(jìn)樣3次。結(jié)果顯示，目標(biāo)分析物的測試方法在相關(guān)測試范圍內(nèi)呈線性，相關(guān)系數(shù)R。

　　2.4.2.4精密度重復(fù)性試驗中，由于奈立膦酸鈉原料藥不含任何未知雜質(zhì)，所以精密度試驗通過對6份獨(dú)立的0.1%奈立膦酸鈉原料藥樣品(相當(dāng)于未知降解產(chǎn)物規(guī)定限度)測定含量進(jìn)行每份樣品進(jìn)樣一次，按測試方法測定。中間精密度是由不同的分析員，在不同時間內(nèi)，使用不同的HPLC重復(fù)精密度試驗。目標(biāo)分析物的方法學(xué)試驗中的精密度和中間精密度的兩組數(shù)據(jù)無統(tǒng)計學(xué)差異，應(yīng)用單因素ANOVA檢驗(p=0.005，單側(cè))，計算的T值(2.50)低于臨界值表T值(4.96)。證明了方法的精密度和中間精密度滿足要求

　　2.4.2.5準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度用從LOQ到樣品溶液中活性成分濃度(0.25mg/5mL)的1.3%濃度范圍的奈立膦酸評價。配制濃度為0.00025、0.0005、0.0025、0.00325mg/5mL的對照品溶液，每個濃度樣品獨(dú)立配制三份。根據(jù)外標(biāo)校準(zhǔn)模式，定量準(zhǔn)確度樣品，并表達(dá)為加入濃度和檢測濃度之間的回收率。報告顯示各個濃度下的回收率在97.4%~99.4%之間，符合所有溶液的準(zhǔn)確度范圍在90.0～110.0%的標(biāo)準(zhǔn)，且各濃度下的回收率RSD小于10.0%。說明該方法的準(zhǔn)確度滿足規(guī)定。

　　2.4.2.6耐用性取2.4項下的對照品溶液以及供試品溶液，在初始色譜條件、流速0.2mL/min，色譜條件5℃以及流動相pH0.2pH單位的條件下進(jìn)行檢測。評價對照溶液進(jìn)樣的下列參數(shù)(方法質(zhì)量指標(biāo))：保留時間(Tr)，色譜效率(理論塔板數(shù)，歐洲藥典)和峰對稱性(對稱性，歐洲藥典)。

　　從得到的結(jié)果中可以明顯的看到，和預(yù)期一樣，流速、柱溫、緩沖液的pH或者流動相組分改變，影響目標(biāo)分析物的保留時間，但不影響測定目標(biāo)分析物方法的可信度，并且未檢出未知雜質(zhì)�？紤]到對照溶液中目標(biāo)分析物峰的系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)，該方法考慮對以下情況視為耐用：·流速從0.8mL/min變化到1.2mL/min;·流動相的緩沖液pH從4.8變化到5.2pH單位;·柱溫從30℃變化到40℃;·流動相中緩沖液百分比從68%變化到72%。

　　2.4.2.7溶液穩(wěn)定性

　　取2.4項下的對照溶液、供試品溶液以及0.1%的供試品溶液分別置于透明容量瓶中，室溫儲存48h。沒分溶液進(jìn)樣兩次，在0、15、18、24h時對奈立膦酸鈉的含量進(jìn)行測定。結(jié)果顯示樣品溶液在18h后不再穩(wěn)定。

　　3結(jié)論

　　本實驗建立了奈立膦酸鈉原料藥有關(guān)物質(zhì)測定的方法學(xué)，利用簡便快捷的薄層色譜法對原料藥中的6-氨基己酸以及磷酸鹽雜質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測，本實驗中檢測的78821,78819批的原料藥中并未檢測出這兩種雜質(zhì)。通過容量法對原料藥的亞磷酸鹽雜質(zhì)檢測的方法學(xué)驗證說明該方法的專屬性，線性，精密度，準(zhǔn)確度都符合規(guī)定，可以應(yīng)用于奈立膦酸鈉有關(guān)物質(zhì)的測定。最后，除6-氨基己酸、磷酸鹽以及亞磷酸鹽之外的其他雜質(zhì)通過HPLC法進(jìn)行，未有其他雜質(zhì)檢出。綜上所述，本文建立了完善的奈立膦酸鈉有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，為該藥物的原料藥監(jiān)控以及制劑的研究提供了依據(jù)。

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