慢性感染傷口細菌檢測的研究進展

　　摘要：慢性感染傷口是臨床處治的重難點，細菌生物膜的影響一直是臨床關注的重點。在一系列生物檢測技術(shù)的支持下，臨床可以對細菌生物膜加以識別，了解不同菌株特征，提高細菌生物膜檢出率，明確感染傷口的病原菌，臨床對于慢性感染傷口的研究重點也在于此。基于此，本文就慢性感染傷口細菌檢測的研究進展做了綜述，旨在幫助臨床深入認識慢性感染傷口的細菌生物膜，探索有效的臨床干預和用藥方案。

　　關鍵詞：慢性感染傷口;細菌生物膜;微生物檢測技術(shù)

　　細菌感染是引起慢性感染傷口的一個重要危險因素，臨床通過采集傷口標本，利用生物學檢測技術(shù)來評估傷口創(chuàng)面的菌群分布情況，了解感染菌株的特征、形態(tài)。以往臨床多通過傳統(tǒng)的細菌和傷口分泌物病原體培養(yǎng)檢測，這種方法可準確診斷急性感染傷口，但對于慢性感染傷口的檢測效果不佳，細菌培養(yǎng)率一直保持在1%~2%的低值區(qū)間[1];對于包括壓瘡在內(nèi)的慢性創(chuàng)面有效菌屬的培養(yǎng)大約為十二種，另外其陰性培養(yǎng)結(jié)果往往不符合明顯感染癥狀以及體征表現(xiàn)，嚴重干擾臨床治療。

　　細菌檢測評職知識：細菌耐藥論文投稿SCI雜志怎么找

　　而分子測序技術(shù)對于壓瘡等慢性創(chuàng)面的檢測效果較好，可檢出菌屬種類106種[2]。導致慢性傷口細菌培養(yǎng)效果不佳的原因較多，例如取材方式、檢測手段、標本采集部位以及培養(yǎng)時間等等，而且細菌以一種特殊形式——細菌生物膜存在導致慢性傷口感染加重，并逐步進展為難治性病灶。細菌生物膜導致傷口感染遷延不愈，頑固反復，而且傷口分泌物陽性培養(yǎng)率較低。研究表明，壓瘡、糖尿病足潰瘍以及下肢靜脈潰瘍等慢性傷口上容易出現(xiàn)細菌生物膜，是引起傷口疼痛的主要原因，同時也對傷口愈合造成嚴重影響[3]�；�于此，本文就慢性感染傷口細菌檢測的研究進展做了如下綜述，希望有所幫助。

　　1、慢性傷口滲液和組織特點分析

　　急性感染傷口滲液酸堿值一般在4~10，生長因子表達水平較高，炎性因子表達水平偏低;而慢性傷口滲液酸堿值一般在5.5~8.7之間，其成分主要為大量黏附因子、彈性蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、細菌以及免疫活性細胞，另外還有少量蛋白酶、電解質(zhì)、細胞素、葡萄糖以及生長因子[4]。細菌分泌內(nèi)毒素刺激炎性細胞因子表達水平不斷升高，進而提高MMPs水平并引起抑制素失衡表現(xiàn)，抑制微血管生成，導致生長因子表達水平降低，細胞代謝遲緩，同時衰老細胞開始大量增多。細菌在慢性傷口中感染后以生物膜形式存在，并在傷口創(chuàng)面上依附生長，感染宿主細胞并對細胞信號傳遞系統(tǒng)產(chǎn)生干擾，引起修復細胞凋亡、自溶，最終導致局部組織壞死[5]。

　　2、慢性傷口感染樣本的采集規(guī)范及培養(yǎng)方法

　　早期研究表明，傷口滲液標本中菌落計數(shù)水平較傷口組織更高。一項國內(nèi)研究[6]認為，為保證致病菌培養(yǎng)質(zhì)量，避免采樣時意外混入定植菌群，建議采樣前先準備無菌生理鹽水，對傷口進行充分的沖洗，將傷口表面壞死組織、滲出物、碎屑以及膿液等成分予以清除，盡量采用抽吸取樣的方法或者將采樣拭子深入傷口內(nèi)部，至基底部或者緊貼膿腫壁開始取樣。取樣手法一般為“十”字或者“Z”字，完成取樣后常溫保存，并在2h內(nèi)送檢培養(yǎng)。

　　膿液以及傷口分泌物的培養(yǎng)基一般為血瓊脂平板、麥康凱平板以及巧克力平板分離培養(yǎng)基，分三區(qū)劃線，巧克力平板置于5%~10% C02孵箱培養(yǎng)，溫度為35°±1℃，經(jīng)過18~24h培養(yǎng)后對菌落形態(tài)特征、大小、溶血情況、顏色以及氣味進行觀察。并與標本涂片染色結(jié)果進行對比，鑒定生長菌，同時評估菌落特征生化反應以及染色情況，開展藥敏試驗。對于抗菌藥物敏感試驗，其判定通常包括“敏感”、“中介”以及“耐藥”三個等級，其中“敏感”提示藥物可能有效，“中介”提示可能有效或失敗，“耐藥”提示可能失敗[7]。對于非膿性標本，檢驗人員應提前準備增菌肉湯培養(yǎng)，然后接種培養(yǎng)基。即便如此，關于慢性傷口檢測中傳統(tǒng)培養(yǎng)方法陽性率偏低的報道依然居多。有觀點指出，如果傷口存在竇道的情況下，可通過手術(shù)切除以及穿刺抽吸等途徑對深部傷口進行取材。

　　一項關于小鼠慢性傷口模型的實驗中，研究者將傷口組織切片取樣并在4%甲醛液中保存，然后用石蠟油固定并制備為薄切片，經(jīng)過HE染色和特殊處理，用玻片覆蓋樣本并逐一檢測。有學者為了觀察慢性傷口菌群的分布及特征表現(xiàn)，將內(nèi)層和外層傷口敷料作為檢測樣本取材，然后進行無菌和密封處理并冷藏保存，由實驗室人員進行檢測：將滲液浸透的敷料剪切成方形，面積為5cm x5cm，然后通過傷口液洗脫以及溫度控制培養(yǎng)制取獲得標本[8]。文獻報道指出傷口清洗完畢后可以用生理鹽水棉簽對傷口組織進行擦拭和采集，但應確保樣本量充足，防止病原菌在轉(zhuǎn)運過程中因干燥而凋亡。取樣操作時棉簽頭部應確保被滲液完全覆蓋并染色[9]。

　　總的來說，人工標本采集可能會對細菌培養(yǎng)結(jié)果造成影響，導致陽性率偏低，但并非唯一因素;導致細菌陽性率不高的因素還有實驗室培養(yǎng)技術(shù)、方法以及微生物檢測技術(shù)等等

　　[5]。除此之外，創(chuàng)傷出血性傷口、12h以內(nèi)的燒傷創(chuàng)面和敷藥后未超過4h的傷口均不建議采集樣本，此種情況下所取樣本培養(yǎng)陽性率偏低[10]。

　　3、微生物檢測技術(shù)

　　隨著檢測技術(shù)和檢測設備的不斷發(fā)展完善，臨床開始探索慢性感染傷口的檢測新技術(shù)，以確保微生物檢出率。常見的檢測技術(shù)有聚合酶鏈反應(PCP )、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)以及分子檢測技術(shù)等等[11]。研究表明，采用常規(guī)細菌培養(yǎng)方法對傷口表面采集拭子進行檢測，超過70%的患者致病菌以假單胞菌以及金葡菌為主，而通過分子技術(shù)對同樣方法采集的傷口拭子標本進行檢測，結(jié)果表明所檢出致病菌菌株為10種左右，其病原菌檢出率高出常規(guī)檢測方法約4倍[12]。另有研究通過FISH技術(shù)對慢性傷口小鼠模型進行檢測，通過對12d組織切片的檢測發(fā)現(xiàn)，同種類細菌呈帶狀分布，并且大多在傷口邊緣集中;一項研究觀察了確認存在有生物膜的慢性感染傷口，利用FISH技術(shù)檢測表明綠膿桿菌數(shù)量和常規(guī)細菌培養(yǎng)檢測所得結(jié)果也存在很大差異[13]。所以通過特異性微生物檢測技術(shù)對慢性傷口進行檢測，明確致病菌分布情況以及細菌聚集特點是支持慢性感染傷口臨床診斷的重要手段，便于臨床明確感染病原菌并開展針對性治療[14]。

　　4、慢性傷口感染和細菌培養(yǎng)關系

　　在細菌培養(yǎng)檢測中，細菌生物膜陽性檢出率不高是現(xiàn)階段的客觀事實[15]。一些觀點認為細菌生物膜外層胞外多糖基質(zhì)對抗生素的進入產(chǎn)生了延緩或阻礙作用，而生物膜內(nèi)各部分化學微環(huán)境有明顯的區(qū)域性特點，從外到內(nèi)生物膜的酸堿度、滲透壓、氧氣濃度以及營養(yǎng)物質(zhì)濃度存在梯度變化，細胞膜深層細菌雖然保持靜止休眠，但依然處于存活狀態(tài)，這可能是導致生物膜細菌培養(yǎng)陰性結(jié)果以及耐藥性的一個重要原因[16]。

　　有觀點指出，生物膜外層胞外多糖基質(zhì)對于機體抗體以及免疫細胞也產(chǎn)生了明顯的限制，導致其難以進入，進而削弱組織抗菌能力，同時向外釋放抗原，對機體產(chǎn)生刺激并形成大量特異性抗體，這些抗體受到胞外多糖基質(zhì)屏障效應的影響而無法進入生物膜，反而形成免疫復合物對周圍組織產(chǎn)生損傷，最終導致慢性感染持續(xù)性加重[17]。

　　另有研究[18]認為，人體感染中存在厭氧菌的病例幾乎接近100%，然而在大部分細菌性感染中，厭氧菌感染恰恰是最容易忽視的那一種，因為目前國內(nèi)外尚未大規(guī)模推動厭氧菌檢測技術(shù)的應用，采用常規(guī)方法進行厭氧菌培養(yǎng)時容易誤判為無菌性炎癥。一項研究以骨傷患者為研究對象，通過需氧培養(yǎng)技術(shù)對其傷處標本進行檢測，結(jié)果顯示44%的標本為“無菌生長”。對于慢性傷口標本的檢測，臨床發(fā)現(xiàn)在需氧菌制造的低氧環(huán)境下，厭氧菌的存活率提升，存活時間延長，致病力也隨之增加[19]。另外，對于細菌培養(yǎng)結(jié)果為陰性但明顯出現(xiàn)感染癥狀的傷口，臨床也應警惕厭氧菌感染的危險[20]。

　　5、體會

　　近年來隨著各類廣譜抗菌藥物的大量應用以及細菌生物膜的形成，細菌耐藥問題以及抗宿主免疫反應不斷加重，抗菌敷料和藥物難以取得應有的效果，慢性感染傷口因此成為困擾臨床的難題。常規(guī)細菌培養(yǎng)技術(shù)幾乎無助于慢性感染傷口的臨床診斷，除了需要持續(xù)更替現(xiàn)有檢測技術(shù)并加以完善外，我們還應對不同慢性傷口中不同感染菌群的差異有充分考慮。其次應充分清洗傷口，確保創(chuàng)面始終保持清潔，抑制細菌數(shù)量以及菌群定植幾率，以控制感染。這些操作也符合徹底清創(chuàng)并清洗后確保抗菌敷料發(fā)揮作用的觀點。另外，考慮到生物膜細菌具有多層存在的特點，而深層細菌具有更強的抵抗能力，傳統(tǒng)微生物檢查僅能完成細菌定型，或檢測潛在病原體對于各類抗生素的藥物敏感性，因此臨床多采用經(jīng)驗性用藥方案開展抗菌治療，而抗菌藥物敏感試驗指導臨床抗菌治療時，需要經(jīng)驗性治療結(jié)束后24~48h時才能得出結(jié)果，而在經(jīng)驗性治療后72h內(nèi)應結(jié)合臨床療效以及抗菌藥物敏感試驗對經(jīng)驗性治療方案展開重新評估，倘若療效不佳，抗菌藥物敏感試驗提示“耐藥”，則應調(diào)整用藥方案。

　　參考文獻：

　　[1]張雪艷.基因芯片法對細菌性痢疾患者黏液膿血便病原菌檢測陽性率的影響[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學雜志,2020,52(09):1031-1032.

　　[2]程燕.傷口分泌物細菌培養(yǎng)及藥敏試驗對慢性化膿性骨髓炎患者抗菌藥物合理使用的影響[J].河南醫(yī)學研究,2019,28(19):3597-3599.

　　[3]蔣琪霞,王建東,彭青, 等.負壓傷口治療結(jié)合納米銀敷料處理創(chuàng)傷性慢性傷口的效果比較[J].醫(yī)學研究生學報,2019,32(11):1198-1202.

　　[4]武潔,王荃.病原微生物檢測在感染判定的意義[J].中國小兒急救醫(yī)學,2020(03):175-176-177-178-179-180.

　　[5]劉伯讓,畢曉潔,王勤, 等.慢性化膿性骨髓炎傷口分泌物細菌學特征與耐藥性分析[J].中華醫(yī)院感染學雜志,2016,26(2):382-384.

　　[6]胡海洋,陳明剛,楊業(yè)永,張雪芹.微生物形態(tài)學檢驗用于感染性疾病診斷的應用價值[J].中國醫(yī)藥科學,2020,10(01):224-226+251.

　　作者：朱珊珊

轉(zhuǎn)載請注明來自發(fā)表學術(shù)論文網(wǎng)：http:///yxlw/25775.html