本文摘要：摘要以甜蕎品種西農(nóng)9976為材料，基于前期干旱轉錄組學數(shù)據(jù)挖掘克隆獲得FeTCP1，其有1個1623bp的開放閱讀框，編碼540個氨基酸。蛋白質理化性質預測顯示，F(xiàn)eTCP1蛋白質的分子質量為58623.75ku，等電點為5.97，疏水性總平均值為-0.032，屬于親水性蛋白。同源性
摘要以甜蕎品種‘西農(nóng)9976’為材料，基于前期干旱轉錄組學數(shù)據(jù)挖掘克隆獲得FeTCP1，其有1個1623bp的開放閱讀框，編碼540個氨基酸。蛋白質理化性質預測顯示，F(xiàn)eTCP1蛋白質的分子質量為58623.75ku，等電點為5.97，疏水性總平均值為-0.032，屬于親水性蛋白。同源性分析顯示，F(xiàn)eTCP1與甜菜、睡蓮和罌粟親緣關系最近，與苦瓜屬植物的親緣性較遠，符合植物形態(tài)學分類與進化規(guī)律。qRT-PCR結果顯示，F(xiàn)eTCP1在甜蕎根部中的表達量相對較高;受干旱脅迫誘導表達，F(xiàn)eTCP1在甜蕎根和葉中出現(xiàn)不同程度的上調，進一步推測FeTCP1基因與甜蕎在干旱脅迫下的應答反應有關。
關鍵詞甜蕎;FeTCP1;生物信息學分析;逆境脅迫;表達分析
TCP是調控植物發(fā)育的特異性因子，具有一個非典型的約59個氨基酸的bHLH保守結構域[1]。目前，已知TCP家族的成員可分為PCF亞家族和CIN和CYC/TB1亞家族[2]。PCF亞家族大部分成員的蛋白序列較短，基序組成較為保守，調控基因正向表達;CIN和CYC/TB1亞家族的成員存在一個富含精氨酸的基序(18～20個氨基酸)稱為R結構域，主要包含調控植物側生器官生長和形態(tài)發(fā)育的基因[3-4]。PCF亞家族成員主要介導細胞生長和分裂的顯著刺激，CIN和CYC/TB1亞家族成員則協(xié)同抑制細胞生長和分裂[5]。
TCP家族廣泛參與調控植物生長、發(fā)育、非生物脅迫以及激素反應等，與植物器官形態(tài)性狀的進化密切相關，控制著花的對稱性及葉的性狀表型[6]，還參與植株內激素信號的轉導[7]。在番茄(Solanumlycopersicum)[8-10]、擬南芥(Arabi-dopsisthaliana)[5，11-13]、玉米(Zeamays)[14]、水稻(Oryzasativa)[15]等植物中證實TCP基因在植物逆境應答方面發(fā)揮著作用。在擬南芥中At-TCP11通過上調VND7基因的表達量，來引起維管束發(fā)育的缺陷;AtTCP3、AtTCP15也是通過調控生長素來響應相關的表達[12];AtTCP5、AtTCP13、AtTCP17主要通過依賴和不依賴PITS兩個途徑來促進生長素的合成[4]。水稻的OsPCF2、OsPCF5、OsPCF6均涉及干旱和冷脅迫的耐受性[15]。甜蕎(FagopyrumesculentumMoench)是蓼科蕎麥屬植物，具有較強的抗逆能力。目前關于TCP家族成員在甜蕎中的研究相對較少。
本研究以抗旱品種‘西農(nóng)9976’為試驗驗材料，利用同源克隆方法得到FeTCP1基因的CDS序列，運用生物信息學方法對FeTCP1基因序列和編碼蛋白序列進行分析和鑒定，利用系統(tǒng)進化樹分析不同物種間TCP1蛋白的親緣關系。同時在逆境脅迫下對FeTCP1基因在甜蕎幼苗的轉錄表達進行實時熒光定量分析。結合蛋白序列和實時熒光定量分析來預測TCP1基因在甜蕎中的表達模式。為TCP1基因在逆境脅迫下的功能分析提供理論基礎，將有助于進一步研究TCP基因家族的進化關系和分子基礎。
1材料與方法
1.1材料與處理
供試材料為甜蕎品種‘西農(nóng)9976’。篩選均一飽滿的蕎麥種子，經(jīng)0.1%HgCl消毒5min后，用無菌水洗凈，置于培養(yǎng)皿中，25℃催芽。待根長生長到2cm左右時，將發(fā)芽一致的甜蕎種子移栽至水培盒，置于人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：25℃12h光照，20℃12h黑暗;相對濕度恒定為60%。待培養(yǎng)7d至甜蕎幼苗子葉完全展開時，分別利用15%PEG6000和0.1%NaCl溶液對甜蕎幼苗進行脅迫處理，以處理0h為對照，設3個生物學重復。分別于脅迫后3h、6h、12h、24h和48h對甜蕎幼苗的子葉和根部進行樣品采集，液氮速凍后，置于-80℃保存，備用。
1.2FeTCP1基因的克隆
利用RNA試劑盒(RN38)提甜蕎幼苗葉片和根部的總RNA，利用反轉錄試劑盒(TaKaRa)合成cDNA，根據(jù)長江大學耐漬麥類種質資源實驗室前期轉錄組學測序得到的cDNA序列，利用NCBI進行PrimerBlast設計特異性引物，PCR擴增出FeTCP1序列。引物合成和DNA測序均由北京擎科生物公司完成。
1.3FeTCP1基因生物信息學分析
利用NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov)確定FeTCP1基因開放式閱讀框(ORF)和氨基酸數(shù)目;利用ExPASy(https：//web.expasy.org/protparam/)預測FeTCP1的氨基酸長度、分子質量(MW);利用軟件NPS@(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/)預測FeTCP1蛋白二級結構;利用SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)預測蛋白質三級結構;利用NCBI進行Pro-teinBlast搜索同源序列，篩選雙子葉植物中的同源序列，用MEGA7.0構建系統(tǒng)進化樹，確定FeTCP1在各物種間的演化關系。
1.4FeTCP1基因在干旱和鹽脅迫下的表達分析
在甜蕎幼苗脅迫處理后分別提取其葉片和根部的總RNA，去除殘留的DNA后檢測其質量與完整性，利用cDNA進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)，檢測FeTCP1基因在脅迫誘導下的表達模式。使用Primer進行特異性引物設計，上、下游特異性引物分別為QFeTCP-RTF和QFeTCP-RTR;qRT-PCR檢測所用的陽性對照內參基因為甜蕎的ACTIN基因(Gen-bank登錄：HQ398855.1)，檢測特異性引物分別為QFeACTIN-F和QFeACTIN-R。采用兩步法PCR擴增程序，使用2-ΔΔCt法計算表達量，用SPSS19.0對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，用Mi-crosoftexcel2003作圖。
2結果與分析
2.1甜蕎FeTCP1基因的克隆
利用引物FeTCP1-F/FeTCP1-R對甜蕎品種‘西農(nóng)9976’的cDNA進行擴增，經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢驗，獲得1條1800bp左右的PCR產(chǎn)物。將目的條帶回收純化后，經(jīng)連接、轉化，篩選陽性克隆進行測序。利用NCBI在線分析序列，開放式閱讀框(ORF)為1623bp，編碼540個氨基酸。進行Blast同源性搜索，結果與茶樹CsTCP1(XM_028267645.1)的同源性高達98%，將其命名為FeTCP1，GenBank登錄：MW092108。
2.2FeTCP1在干旱與鹽脅迫下的表達分析
初步分析FeTCP1在甜蕎組織中的功能，利用qRT-PCR定量分析甜蕎幼苗葉片和根部在干旱和鹽脅迫誘導下的表達情況。結果顯示在干旱處理下，F(xiàn)eTCP1在葉片中的表達量均高于對照，在干旱處理12h左右達到峰值，其大致趨勢為先增后減;根的FeTCP1表達量均高于對照、葉片，在6h達到峰值;在鹽處理下，發(fā)現(xiàn)FeTCP1的表達情況較為復雜，組織之間存在差異，葉片中FeTCP1的表達量呈上升趨勢，12h后顯著高于根的表達量。在根中則呈現(xiàn)下降趨勢，在3h左右達到峰值，之后逐漸下降。
3討論
TCP基因在植物中廣泛存在，已在擬南芥[5，11-13]、水稻[15]、玉米[14]、番茄[8-10]等植物中發(fā)現(xiàn)TCP參與植物脅迫后的應答反應[16]。水稻OsPCF2蛋白可通過與NHX1基因的啟動子結合激活其表達而提高鹽耐受性[17]，OsTCP19的過表達可通過上調IAA3、ABI3、ABI4和下調LOX2誘導一些信號通路從而提高擬南芥對干旱與高鹽脅迫的耐受性[18]。大多數(shù)TCP基因的上游區(qū)域至少包含一種激素相關元件，啟動子中包含一個或多個與脅迫相關的元件，但激活的時間存在差異[19]。
TCP在轉錄水平和轉錄后水平上的調節(jié)對于植物響應多變的環(huán)境條件的發(fā)育可塑性至關重要[20]。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)TCP基因在干旱脅迫中轉錄表達量均出現(xiàn)下調，僅且存在少量上調基因。這些研究證實TCP成員參與了干旱脅迫的反應過程，同時，推測出TCP成員在植物器官形態(tài)建成[21-24]、逆境應答中的功能特性[19]。本研究從甜蕎中克隆出的FeTCP1共編碼540個氨基酸，從功能結構域分析表明，F(xiàn)eTCP1基因具有TCP1_alpha典型結構域屬于TCP-1家族-α亞單位。這些蛋白通常是由兩個堆疊環(huán)組成的雙圓環(huán)結構，介導多種細胞間隔中ATP依賴的多肽鏈折疊。
通過選取不同雙子葉植物的同源序列構建系統(tǒng)發(fā)生進化樹，結果表明，F(xiàn)eTCP1與甜菜、睡蓮和罌粟親緣關系最近，與苦瓜的親緣關系相對最遠，表明TCP1基因在雙子葉藜科植物中存在著較高的同源保守性。本研究中FeTCP1基因在PEG與鹽誘導脅迫過程中葉片和根部中的表達量均出現(xiàn)上調，證實FeTCP1參與干旱脅迫調控，與前人研究相似[7，9]。但本研究中FeTCP1基因屬于TCP家族中少數(shù)上調基因，且FeTCP1的表達量在48h的脅迫處理下先增后減。與其他研究不盡相同，這種差異可能由于物種間差異以及植物的生長發(fā)育階段的變化所導致。
生物工程論文：基因工程創(chuàng)造的最奇異生物范例
甜蕎FeTCP1可以響應15%PEG6000和0.1%NaCl鹽脅迫，證實FeTCP1基因參與干旱脅迫的應答調控。干旱響應機制主要包括光合作用、滲透調節(jié)、抗氧化系統(tǒng)以及各種蛋白質和代謝物合成等，主要涉及滲透穩(wěn)態(tài)、脅迫傷害控制和生長控制3個方面。下一步的研究方向為通過轉基因技術探究FeTCP1主要參與干旱響應的哪些過程以及具體的調控機理機制，為培育優(yōu)良的抗逆品種提供借鑒。
參考文獻Reference：
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作者：朱旭東;方正武;熊澤浩，徐銳，曹艷，侯澤豪
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