三七總皂苷白蛋白微球注射液在家兔體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究

　　摘要:目的:對(duì)三七總皂苷白蛋白微球注射液(PNS-BSA-MS-inj)在家兔體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。方法:以新西蘭大白兔為模型動(dòng)物，以血塞通注射液為對(duì)照制劑，關(guān)節(jié)腔注射PNS-BSA-MS-inj和血塞通注射液，運(yùn)用UPLC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)家兔體內(nèi)人參皂苷Rb1的血藥濃度變化，同時(shí)建立人參皂苷Rb1的血漿定量分析方法。利用DAS2.0軟件分析PNS-BSA-MS-inj和血塞通注射液的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)差異。結(jié)果:家兔關(guān)節(jié)腔注射PNS-BSA-MS-inj和血塞通注射液后，藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下:半衰期(t1/2)分別為59.350h和35.694h，藥峰濃度(Cmax)分別為34.340μg/mL和42.340μg/mL;達(dá)峰時(shí)間(tmax)分別12h和1h;藥時(shí)曲線下面積(AUC0-∞)分別為2265.702mg/(L·h-1)和1961.411mg/(L·h-1);PNS-BSA-MS-inj的相對(duì)生物利用度為116%。結(jié)論:與血塞通注射液相比，PNS-BSA-MS-inj能顯著提高藥物在家兔體內(nèi)的滯留時(shí)間，并能提高藥物在家兔體內(nèi)的生物利用度，說(shuō)明PNS-BSA-MS-inj具有緩釋效果。

　　關(guān)鍵詞:三七總皂苷;白蛋白微球;關(guān)節(jié)腔注射;人參皂苷Rb1;UPLC-MS/MS

　　三七總皂苷(panaxnotoginsengsaponins，PNS)為三七的主要有效成分，目前研究表明其藥理作用廣泛，除具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗血栓、抗心律失常、抗氧化、抗腫瘤[1]等藥理作用外，還具有抑制促炎癥因子分泌、抑制金屬蛋白酶的活性、保護(hù)軟骨基質(zhì)、抑制滑膜炎癥等作用[2]。

　　醫(yī)學(xué)藥物論文： 臨床藥學(xué)干預(yù)在抗菌藥物合理使用中的效果觀察

　　有研究表明采用膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)直接注射三七總皂苷及其制劑，可使藥物直接分布于病變局部，能夠改變骨性關(guān)節(jié)炎的病理狀態(tài)，從而發(fā)揮治療骨性關(guān)節(jié)炎或者骨折等疾病的作用，具有操作方便、起效快速、藥物易于吸收等優(yōu)點(diǎn)[3，4]。但常規(guī)關(guān)節(jié)腔注射給藥，大量藥物滲漏進(jìn)入體循環(huán)，藥物在關(guān)節(jié)組織滯留時(shí)間短，治療效果不理想，且需要頻繁用藥，不良反應(yīng)大，病人的順應(yīng)性差[5]。因此，注射用緩控釋制劑已逐漸成為關(guān)節(jié)腔注射給藥的研究熱點(diǎn)[6-8]。

　　白蛋白微球是一種可作為控制藥物釋放的新型給藥系統(tǒng)，由于其與人體組織的親和性較好，利用白蛋白將藥物制成微球后，不僅能夠顯著增加藥物在血漿的溶解性，提高藥物的選擇性和生物利用度[9]，包封在微球中的藥物還具有緩釋的作用，能在降低不良反應(yīng)的同時(shí)具有延長(zhǎng)藥效的作用[10]。為了延長(zhǎng)藥物在關(guān)節(jié)腔內(nèi)使用時(shí)間，本研究以牛 血清蛋白(bovinesrumalbumin，BSA)為載體材料，PNS為藥物通過(guò)加熱固化法制備得到三七總皂苷白蛋白微球，使其具有緩釋作用，提高生物利用度，降低給藥劑量。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)家兔關(guān)節(jié)腔注射PNS-BSA-MS-inj，以血塞通注射液作為參比制劑，采用UPLC-MS/MS法測(cè)定不同時(shí)間家兔血漿中的人參皂苷Rb1的含量，考察藥物在家兔體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征。

　　1儀器與材料

　　1.1儀器WASTERSXEVOTQ超高液-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)，AE/240型十萬(wàn)分之一電子分析天平(上海梅特勒儀器有限公司)，TGL-16B型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，HC-2062型高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)，MTN-2800D型氮吹濃縮裝置(天津奧特賽思斯儀器有限公司)，MX-S型渦旋混合機(jī)(美國(guó)SCILOGEX公司)，SK8200H型超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

　　1.2藥品與試劑PNS-BSA-MS-inj(實(shí)驗(yàn)室自制，平均粒徑為9.53±4.83μm，平均載藥量為6.87±0.03%)，注射用血塞通凍干粉(批號(hào):F807036a3，哈爾濱珍寶制藥有限公司)，人參皂苷Rb1對(duì)照品(批號(hào):110704-201625，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，地高辛對(duì)照品(批號(hào):133593，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，生理鹽水(貴州天地有限公司)，甲醇(色譜純，美國(guó)天地公司)，乙腈(色譜純，美國(guó)天地公司)，屈臣氏蒸餾水(屈臣氏集團(tuán)公司)，實(shí)驗(yàn)室自制蒸餾水，其他試劑均為分析純。

　　1.3動(dòng)物新西蘭大白兔，普通級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量2.5～3.0kg，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK-(黔)2018-0001。

　　2方法與結(jié)果

　　2.1溶液的配制

　　2.1.1對(duì)照品溶液的配制精密稱取人參皂苷Rb1對(duì)照品10.68mg，加甲醇溶解并定容至10mL，即得濃度1068μg/mL人參皂苷Rb1的對(duì)照品溶液，置于4℃冰箱保存，臨用時(shí)稀釋成適當(dāng)對(duì)照品溶液。

　　2.1.2內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱取地高辛對(duì)照品2.4mg，用甲醇溶解并定容至25mL，即得濃度為96μg/mL的地高辛對(duì)照品溶液，置于4℃冰箱保存，臨用時(shí)稀釋成適當(dāng)對(duì)照品溶液。

　　2.2血漿樣品的處理方法精密吸取地高辛對(duì)照品溶液10μL，加入到精密吸取的500μL血漿上清液中，渦旋混合1min，加入乙腈1490μL，渦旋混合3min，10000r/min離心15min，取全部上清液轉(zhuǎn)移至5mL一次性EP管，在50℃下N2吹干，用100μL的甲醇復(fù)溶，渦旋混合3min，超聲5min，10000r/min離心15min，取上清液用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾作為供試品溶液，進(jìn)樣5μL，進(jìn)行UPLC-MS/MS法檢測(cè)分析。

　　2.3色譜條件采用XBridge�LUPLCCSHTMC18色譜柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，以0.1%甲酸水溶液(A)-0.2%甲酸乙腈為流動(dòng)相(B)，采用梯度洗脫(0min，80%A;3min，75%A;5min，60%A;7min，30%A;8min，10%A;9min，80%A;10min，80%A)，流速為0.3mL/min，柱溫為30℃，樣品室溫度為10℃，進(jìn)樣體積為5μL。

　　2.4質(zhì)譜條件采用電噴霧電離源負(fù)離子(ESI負(fù)源)模式，多反應(yīng)檢測(cè)模式(MRM)。人參皂苷Rb1，地高辛的檢測(cè)離子對(duì)分別為m/z1107.6→179.1，825.4→825.3，毛細(xì)管電離電壓為3.0KV;離子源溫度為200℃;一級(jí)錐孔電壓為30V;脫溶劑氣體為N2，脫溶劑氣溫度為500℃;脫錐孔反吹氣流量為50L/h;溶劑氣流量為800L/h;碰撞氣體為Ar，碰撞氣流速為0.15mL/min。采用MRM模式，掃描范圍m/z100～1000;各個(gè)定量離子峰質(zhì)譜條件，即碰撞能量與錐孔電壓。

　　2.5方法學(xué)考察

　　2.5.1專(zhuān)屬性考察分別將空白血漿(陰性樣品)，含一定濃度人參皂苷Rb1對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)溶液(地高辛)的空白血漿(對(duì)照樣品)和關(guān)節(jié)腔注射PNS-BSA-MS-inj后的含藥血漿加入內(nèi)標(biāo)溶液的樣品(樣品)，按“2.2”項(xiàng)的血漿處理方法處理后分別得到陰性樣品供試液、混合對(duì)照品供試液以及樣品供試液，分別取各樣品進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，該方法專(zhuān)屬性良好，處理后供試液無(wú)雜質(zhì)干擾，血漿內(nèi)源性物質(zhì)和其他代謝物在人參皂苷Rb1和地高辛附近無(wú)干擾雜峰出現(xiàn)，可用于人參皂苷Rb1和地高辛體內(nèi)定量分析。

　　2.5.2線性關(guān)系的考察

　　分別精密吸取10μL不同濃度的人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液置于離心管中，每濃度點(diǎn)各取平行樣3份，在50℃下使用N2濃縮儀揮去甲醇，精密加入空白血漿500μL，按照“2.2”項(xiàng)下進(jìn)行處理，即得含人參皂苷Rb1當(dāng)量濃度分別為0.267、0.801、2.403、7.209、21.627、64.881μg/mL的血漿供試液。以人參皂苷Rb1的當(dāng)量濃度為自變量(X)，以人參皂苷Rb1的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為因變量(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸方程分析。得人參皂苷Rb1的回歸方程為Y=1.087X-0.037，(r=0.995)。結(jié)果表明，人參皂苷Rb1的當(dāng)量濃度分別在0.267-64.881μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，可用于人參皂苷Rb1體內(nèi)定量分析。

　　2.5.3精密度試驗(yàn)

　　分別精密吸取2組低、中、高3個(gè)濃度(8.01、72.09、519.05μg/mL)的人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液10μL，每個(gè)濃度平行樣5份，在50℃下于N2下?lián)]干甲醇置于離心管中備用。于備用的離心管中加入空白血漿500μL，其余按照“2.2”血漿樣品的處理方法處理后，作為質(zhì)量監(jiān)控樣品供試液，其中1組1d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣3次，計(jì)算日內(nèi)精密度;2組每天測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定3d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果顯示人參皂苷Rb1的日內(nèi)精密度RSD分別為18.36%、7.61%和6.87%，RSD均<20%;日間精密度RSD分別為19.40%、17.91%和7.61%，均<20%，基本滿足生物樣品體內(nèi)定量分析質(zhì)量規(guī)范要求。

　　2.5.4回收率試驗(yàn)

　　(1)提取回收率試驗(yàn):分別用精密吸取低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度(8.01、72.09、519.05μg/mL)工作液10μL，每個(gè)濃度平行樣5份，在50℃下N2下?lián)]干甲醇于離心管中備用。加入空白血漿500μL，其余按照“2.2”血漿樣品的處理方法處理后，轉(zhuǎn)移上清液至備用的5mL的離心管中，于N2下?lián)]干后同上復(fù)溶，作為A溶液;另用甲醇配制相應(yīng)濃度的人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液，不經(jīng)提取進(jìn)樣同量測(cè)定，并以此為標(biāo)準(zhǔn)，作為B溶液。

　　將A溶液和B溶液分別檢測(cè)分析，分別測(cè)定人參皂苷Rb1和地高辛的峰面積并計(jì)算兩種溶液的比值。結(jié)果顯示人參皂苷Rb1低、中、高3種濃度的提取回收率分別為(101.38±12.08)%、(88.82±13.97)%、(98.11±6.10)%，均>80%;RSD分別為11.92%、15.73%、6.21%，均<20%。(2)方法回收率:分別精密吸取低、中、高3個(gè)濃度(8.01、72.09、519.05μg/mL)的人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液10μL，每個(gè)濃度平行樣5份，在50℃下于N2下?lián)]干甲醇于離心管中備用，于備用的離心管中加入空白血漿500μL，其余按照“2.2”血漿樣品的處理方法處理，記錄人參皂苷Rb1和地高辛的峰面積，分別將人參皂苷Rb1和地高辛的比值，通過(guò)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算人參皂苷Rb1的濃度，與相應(yīng)的標(biāo)示濃度進(jìn)行比較，計(jì)算方法回收率。結(jié)果顯 示，人參皂苷Rb1的低、中、高濃度方法回收率分別為(91.65±13.53)%、(116.59±5.75)%、(81.47±1.83)%，均>80%;RSD分別14.76%、4.93%和2.25%，均<20%。

　　2.5.5穩(wěn)定性

　　分別用微量進(jìn)樣器取低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度(8.01、72.09、519.05μg/mL)工作液10μL，每個(gè)濃度平行樣5份，在50℃下于N2下?lián)]干甲醇于離心管中備用。于備用的離心管中加入空白血漿500μL，其余按照“2.2”血漿樣品的處理方法操作，配制成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品，分別放入-20℃條件下保存24h后反復(fù)凍融3次以及常溫下放置6h。每一濃度進(jìn)行5樣品分析，結(jié)果顯示人參皂苷Rb1低、中、高3種濃度冷凍1d凍融3次的RSD分別為2.78%、12.29%和13.71%，均<15%，常溫下放置6h的RSD分別為11.55%、6.16%和12.48%，均<15%。說(shuō)明樣品在常溫和-20℃條件下穩(wěn)定性良好。

　　2.6藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究

　　2.6.1血漿樣品的采集與處理

　　取健康新西蘭大白兔8只，雌雄各半，體質(zhì)量2.5～3.0kg，隨機(jī)分為兩組。分別于兔左關(guān)節(jié)腔注射1mLPNS濃度均為8.1mg/mL的PNS-BSA-MS-inj和血塞通注射液，給藥前禁食12h，自由飲水，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從耳緣靜脈取血2mL用于研究。第一組為對(duì)照組，注射血塞通注射液;第二組注射PNS-BSA-MS-inj。兩組分別于給藥后30min、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144h耳緣靜脈取血并放置于3mL預(yù)肝素化離心管中，搖勻，離心，4000r/min，15min，轉(zhuǎn)移上清液，置于-20℃冰箱保存待測(cè)。分別將兩組不同時(shí)間點(diǎn)的血漿按“2.2”項(xiàng)下方法操作，分別測(cè)定人參皂苷Rb1和地高辛的峰面積，帶入回歸方程，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度。

　　2.6.2藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析

　　關(guān)節(jié)腔注射血塞通注射液和PNS-BSA-MS-inj后，通過(guò)測(cè)定不同時(shí)間新西蘭大白兔血漿的藥物濃度，兩種制劑的藥物濃度與時(shí)間的關(guān)系曲線，采用DAS2.0藥物動(dòng)力學(xué)程序，分別對(duì)血藥濃度與時(shí)間的關(guān)系采用統(tǒng)計(jì)矩法求藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

　　2.6.3藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果

　　關(guān)節(jié)腔注射血塞通注射液和微球注射液后，血漿中人參皂苷Rb1濃度存在明顯差異。關(guān)節(jié)腔注射血塞通注射液，關(guān)節(jié)腔滲漏較多，血漿中人參皂苷Rb1濃度呈上升趨勢(shì)，1h達(dá)到最大值(Cmax=42.340μg/mL)6天后血漿中仍然存在人參皂苷Rb1(1.66μg/mL)，而關(guān)節(jié)腔注射微球注射液0.5h血漿中此時(shí)測(cè)不到血藥濃度;12h以后才達(dá)到最大值(Cmax=34.340μg/mL)，PNS-BSA-MS-inj比血塞通注射液的Cmax要小得多，說(shuō)明關(guān)節(jié)腔注射PNS-BSA-MS-inj，關(guān)節(jié)腔滲漏進(jìn)入血液循環(huán)的藥物量明顯減少，間接說(shuō)明滲漏進(jìn)入血液循環(huán)中的藥量少，在關(guān)節(jié)組織滯留時(shí)間長(zhǎng)，能維持較高的關(guān)節(jié)局部濃度，提高療效。

　　由兩組藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果顯示，PNS-BSA-MS-inj組半衰期和平均滯留時(shí)間都有延長(zhǎng)(P<0.05)，且達(dá)到藥物濃度峰的時(shí)間明顯推后;PNS-BSA-MS-inj組AUC0-∞是血塞通注射液組的1.16倍。說(shuō)明藥物經(jīng)過(guò)微球包封，能夠起到減少藥物滲漏，從而使藥物長(zhǎng)時(shí)間滯留于組織，維持局部的藥物濃度，提高藥物生物利用度。

　　3討論

　　本實(shí)驗(yàn)以新西蘭大白兔為模型動(dòng)物，以血塞通注射液為對(duì)照，地高辛為內(nèi)標(biāo)物，對(duì)PNS-BSA-MS-inj在家兔體內(nèi)的過(guò)程進(jìn)行了初步研究。在實(shí)驗(yàn)中參考多篇文獻(xiàn)[11，12]并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，最后確定流動(dòng)相為乙腈和水，為了改善其和內(nèi)標(biāo)的峰型，在乙腈中添加0.2%的甲酸，在純化水中添加0.1%的甲酸。在血漿樣品處理方法過(guò)程中，曾選用乙腈和甲醇直接沉淀蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿用量相同情況下，使用乙腈比甲醇的提取回收率提高近50%，故選擇乙腈作為蛋白沉淀劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

　　實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在30℃條件下N2吹干耗時(shí)約2h以上，故筆者考察了人參皂苷Rb1在30℃、40℃、50℃條件N2吹干耗時(shí)時(shí)長(zhǎng)，并通過(guò)UPLC-MS/MS法檢測(cè)其含量差異，發(fā)現(xiàn)50℃條件下N2吹干耗時(shí)只要1h左右，且含量與30℃、40℃條件下N2吹干相差不大，因此，在滿足生物樣品提取回收率的前提下，從經(jīng)濟(jì)效益最佳的角度上，最終選擇乙腈作為蛋白沉淀劑，并在50℃條件下N2吹干進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)PNS-BSA-MS-inj在家兔體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征，藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析結(jié)果顯示:PNS-BSA-MS-inj組和血塞通注射液組t1/2分別為59.350h和35.694h，延長(zhǎng)了1.66倍;平均滯留時(shí)間(MRT0-∞)分別為57.716h和52.210h，PNS-BSA-MS-inj組比血塞通注射劑組延長(zhǎng)了1.11倍;PNS-BSA-MS-inj組AUC0-∞為2265.702mg/(L·h-1)，是血塞通注射液組的1.16倍。說(shuō)明該制劑在家兔體內(nèi)具有一定的緩釋作用，同時(shí)將三七總皂苷制成白蛋白微球之后，藥物被包封于微球，減少了藥物從關(guān)節(jié)腔向體內(nèi)血液循環(huán)的滲漏，使藥物長(zhǎng)時(shí)間滯留在關(guān)節(jié)腔內(nèi)，提高了藥物的生物利用度，最終達(dá)到提高療效、提高患者順應(yīng)性的目的。

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　　作者：楊?yuàn)�，陳汝玲，吳靜瀾，田孟斌，楊光錦

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