本文摘要：[摘要]目的識別冠心病(CHD)的差異表達(dá)基因(DEGs)，通過分析DEGs參與的生物學(xué)途徑闡明CHD疾病發(fā)生涉及的細(xì)胞內(nèi)通路。方法從GEO數(shù)據(jù)庫下載兩個已發(fā)表的CHD微陣列數(shù)據(jù)集中mRNA表達(dá)芯片的原始數(shù)據(jù)。篩選DEGs并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括Venn分析、基因本體(GO)注釋分析
[摘要]目的識別冠心病(CHD)的差異表達(dá)基因(DEGs)，通過分析DEGs參與的生物學(xué)途徑闡明CHD疾病發(fā)生涉及的細(xì)胞內(nèi)通路。方法從GEO數(shù)據(jù)庫下載兩個已發(fā)表的CHD微陣列數(shù)據(jù)集中mRNA表達(dá)芯片的原始數(shù)據(jù)。篩選DEGs并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括Venn分析、基因本體(GO)注釋分析、KEGG(KyotoEncy-clopediaofGenesandGenomes)細(xì)胞通路富集分析、蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)驗證CHD病例外周血中核心DEGs的表達(dá)水平。結(jié)果共篩選出122個CHD的DEGs。GO及KEGG分析顯示，這些DEGs參與了DNA轉(zhuǎn)錄和mRNA剪接調(diào)控。PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，表達(dá)下調(diào)基因LUC7L3、HNRNPA1、SF3B1、ARGLU1、SRSF5、SRSF11、SREK1、PNISR、DIDO1、ZRSR2和NKTR位于網(wǎng)絡(luò)中心，且這些基因均為DNA轉(zhuǎn)錄和RNA剪接相關(guān)基因。RT-qPCR檢測證實以上基因在CHD中均表達(dá)下降，與前期芯片結(jié)果一致。結(jié)論RNA剪接在CHD的發(fā)生過程中可能發(fā)揮了重要作用。
[關(guān)鍵詞]冠心病;基因表達(dá);計算生物學(xué);RNA剪接
心血管疾病是目前世界上人類死亡的主要原因之一。冠心病(CHD)是最常見的一種心血管疾病，在全球范圍內(nèi)每年導(dǎo)致超過700萬人死亡[1]。2014年的一項研究顯示，近1/5的男性和1/10的女性死于CHD[2-4]。據(jù)估計，未來20年CHD患病率將增加約10%[5]。CHD已成為威脅人類健康的重要疾病之一，對CHD發(fā)病機制及有效療法的研究和探索從未停止。CHD的主要危險因素包括血脂異常、糖尿病、動脈硬化、肥胖、吸煙、久坐的生活方式、壓力、年齡、男性和家族病史等[6]，但其具體發(fā)病機制尚不完全清楚。既往研究顯示，遺傳因素在心血管疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮了極大的作用[7]。
CHD發(fā)生的生物學(xué)機制有多種，其中研究較為清楚的為炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)失調(diào)是CHD發(fā)生的一種潛在的生物學(xué)機制[8]。相關(guān)研究表明，基因表達(dá)差異，尤其是炎癥調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)異常與CHD的發(fā)生緊密關(guān)聯(lián)[9]。除了炎癥異常調(diào)控外，還有其他因素的變化參與CHD的發(fā)生。本研究旨在通過對GEO數(shù)據(jù)庫中CHD發(fā)生的基因表達(dá)譜進(jìn)行生物信息學(xué)分析，揭示與CHD疾病發(fā)生相關(guān)的生物學(xué)過程及信號通路，為進(jìn)一步闡明CHD的發(fā)病機制提供有價值的信息，并為CHD的診斷、治療提供新的思路。
1資料和方法
1.1基因微陣列數(shù)據(jù)收集CHD樣本的基因表達(dá)芯片來自GEO數(shù)據(jù)庫[10-12]。以“CoronaryHeartDisease”為關(guān)鍵詞在GEO數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，最終在210個相關(guān)數(shù)據(jù)集中選取2個來自AffymetrixHumanGenomeU133Plus2.0Array分析平臺的基因集GSE71226及GSE19339，共包含7個CHD樣本和7個正常樣本的表達(dá)矩陣。
1.2原始數(shù)據(jù)預(yù)處理及差異表達(dá)基因(DEGs)鑒別
下載原始數(shù)據(jù)，采用R語言(affy，limma包)對其進(jìn)行噪聲去除、分位數(shù)歸一化等處理，然后篩選CHD組和正常對照組的DEGs。篩選DEGs的閾值設(shè)定為P值<0.05，且|log2(Foldchange)|≥1。最后，采用R語言(pheatmap包)對基于mRNA表達(dá)水平的組樣本進(jìn)行可視化層次聚類分析。
1.3GSE71226和GSE19339中共有差異表達(dá)基因
(co-DEGs)的Venn分析通過DrawVennDiagram線上數(shù)據(jù)庫對GSE71226和GSE19339數(shù)據(jù)集中的co-DEGs進(jìn)行分析[13-15]。將待分析基因列表上傳到數(shù)據(jù)庫，即可顯示維恩圖及相關(guān)共有基因列表。
1.4基因本體(GO)和基因通路富集分析
GO注釋分析通常用于大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的功能研究。KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)包含了多種生物化學(xué)通路。將待分析基因列表上傳至DAVID生物信息學(xué)資源6.8數(shù)據(jù)庫[16-17]，即可顯示GO及KEGG分析結(jié)果，將其下載為文本文件。最后，通過R語言(ggplot2包)可視化GO結(jié)果。
1.5基因集富集分析(GSEA)
將特定規(guī)格的矩陣表格加載到GSEA_4.0.2軟件，通過GSEAonline進(jìn)行可視化即可完成GSEA分析[18-19]。DEGs途徑富集的閾值為P值<0.01。1.6蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析
DEGs的蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析通過STRING在線分析軟件完成[19-20]。將基因列表上傳到多個蛋白質(zhì)分析菜單欄，稍后即可顯示PPI結(jié)果。最后用Cytoscape軟件將具體的網(wǎng)絡(luò)圖可視化。
1.7實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)驗證
CHD病人核心DEGs的表達(dá)水平取青島市市立醫(yī)院心臟外科10例50～80歲CHD病人和10例同齡健康人的外周血樣本，使用高效血液總RNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，Lot#DP443)提取總RNA。用Oligo(dT)引物(Takara，cat#3806，Lot#T2301AA)在65℃條件下退火5min得到mRNA，用RevertAid逆轉(zhuǎn)錄酶(ThermoScientific，#EP0441)和dNTP混合物(Takara，Cat#4019，Lot#AI11312A)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板。最后使用PowerTrackSYBRGreenMasterMix(ThermoScientific，#4367659)及基因特異性引物進(jìn)行RT-qPCR，檢測目的基因的相對mRNA水平。
2結(jié) 果
2.1CHDDEGs的篩選
從GEO數(shù)據(jù)庫中收集了7例CHD病人和7例正常對照者的mRNA表達(dá)譜。根據(jù)|log2(Foldchange)|≥1、P值<0.05的篩選條件，GSE71226數(shù)據(jù)集中共鑒定出2262個DEGs，其中包含上調(diào)基因694個及下調(diào)基因1568個;GSE19339數(shù)據(jù)集中共鑒定出537個DEGs，其中包含上調(diào)基因263個及下調(diào)基因274個。對這些DEGs進(jìn)行熱圖聚類分析結(jié)果顯示，CHD組和正常對照組的基因表達(dá)模式差異顯著。
由于樣本來源不同(GSE71226數(shù)據(jù)集中樣本來自CHD病人和正常人的外周血;GSE19339數(shù)據(jù)集中樣本分別來自經(jīng)皮冠狀動脈介入治療的CHD病人冠狀動脈閉塞部位的血管和正常人外周血)，兩個數(shù)據(jù)集中分析得到的DEGs具有一定差別。而且，兩個數(shù)據(jù)集中病人信息極少，故無法分析年齡、性別和病史對CHDDEGs的影響。
2.2co-DEGs的Venn分析
為了較為精確地研究CHD的DEGs，本研究分析了GSE71226和GSE19339兩個數(shù)據(jù)集中的co-DEGs。結(jié)果篩選得到兩個數(shù)據(jù)集中共同上調(diào)基因8個及共同下調(diào)基因114個，共計122個co-DEGs。兩個數(shù)據(jù)集中大部分co-DEGs均為表達(dá)下調(diào)基因，提示這些共同下調(diào)基因可能是CHD發(fā)病的關(guān)鍵基因。
2.3CHDco-DEGs的GO和KEGG分析
為了闡明DEGs的生物學(xué)功能，對以上122個co-DEGs進(jìn)行了GO富集分析。結(jié)果顯示，CHD中大多數(shù)的co-DEGs參與的生物學(xué)過程(biologicalprocess)為mRNA加工和剪接調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控;co-DEGs所屬的細(xì)胞成分(cellcompo- nents)為核質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì);其分子功能(molecularfunctions)主要為poly(A)RNA結(jié)合、蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合。KEGG富集分析顯示，大多數(shù)co-DEGs顯著富集的信號通路為剪接體。以上分析結(jié)果表明，CHD的發(fā)生與細(xì)胞整體蛋白質(zhì)表達(dá)調(diào)控紊亂或RNA剪接紊亂具有重要關(guān)聯(lián)。
2.4CHDDEGs的GSEA分析
為了進(jìn)一步分析CHDDEGs可能參與的信號通路，本研究對其進(jìn)行了GSEA分析。結(jié)果顯示，兩個GEO數(shù)據(jù)集中DEGs共同低表達(dá)的基因富集的信號通路為mRNA過程的調(diào)節(jié)及DNA損傷修復(fù)(DNAdamagerepair)。表明CHD發(fā)生過程中，涉及mRNA調(diào)節(jié)過程及DNA損傷修復(fù)途徑的相關(guān)基因表達(dá)水平下降。GSEA分析結(jié)果與GO分析結(jié)果相一致。
2.5CHDDEGs的蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析
為了篩選CHD的關(guān)鍵DEGs，本研究對122個co-DEGs進(jìn)行了PPI分析。結(jié)果顯示，兩個數(shù)據(jù)集共同下調(diào)的基因大部分處于PPI網(wǎng)絡(luò)中間，而共同上調(diào)的基因則處于網(wǎng)絡(luò)邊緣。其中，位于PPI網(wǎng)絡(luò)中心的基因分別為LUC7L3、HNRNPA1、SF3B1、ARGLU1、SRSF5、SRSF11、SREK1、PNISR、DIDO1、ZRSR2及NKTR。提示這些基因的異常低表達(dá)可能在CHD的發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用。2.6CHD關(guān)鍵DEGs分析篩選出的11個關(guān)鍵DEGs在CHD中均顯著低表達(dá)。GO分析結(jié)果顯示，這些關(guān)鍵DEGs涉及的生物學(xué)過程為DNA轉(zhuǎn)錄和RNA剪接體調(diào)控。表明CHD的發(fā)生與RNA剪接異常調(diào)控具有重要關(guān)系。
2.7RT-qPCR驗證
CHD關(guān)鍵DEGs的表達(dá)分別收集10例CHD病人及10例正常人的外周血，對篩選出的關(guān)鍵DEGs的表達(dá)水平進(jìn)行了RT-qPCR驗證。結(jié)果顯示，CHD病人外周血中這些DEGs的表達(dá)水平均較正常人顯著下調(diào)。
3討 論
盡管對CHD進(jìn)行了40多年的基礎(chǔ)和臨床研究，但其具體發(fā)病機制仍不完全清楚。通過分析CHD發(fā)生過程中涉及的生物學(xué)途徑，增加對CHD發(fā)病機制的了解，可為CHD的臨床治療及預(yù)后判斷提供新思路。剪接體被證明是一種蛋白質(zhì)定向金屬酶[21]。
作為真核細(xì)胞中最復(fù)雜的調(diào)控機制之一，剪接體從初級轉(zhuǎn)錄本中去除內(nèi)含子序列，生成功能性mRNA和長鏈非編碼RNA(lncRNA)[22]，這一過程稱為選擇性剪接。選擇性剪接是一個動態(tài)且受調(diào)控的生物學(xué)過程，受到一系列變量的影響，如順式調(diào)控序列和反式作用因子、轉(zhuǎn)錄過程和DNA/RNA的甲基化等[23-24]。多項研究表明，異�？勺兗艚优c人類疾病有關(guān)，它既可能是疾病的發(fā)生原因，也可能是疾病造成的結(jié)果[25]。
有研究結(jié)果表明，參與剪接體正常功能的基因突變被認(rèn)為是脊髓性肌萎縮、色素性視網(wǎng)膜炎和普瑞德-威利綜合征等的關(guān)鍵因素[26-28]。然而，剪接因子中導(dǎo)致人類心臟病變的突變并不多見。到目前為止，只有剪接因子RNA結(jié)合基序蛋白20(RBM20)的突變被證實與心臟病有因果關(guān)系[29-31]。此外，相關(guān)研究結(jié)果表明，與RNA剪接相關(guān)基因在心臟病中異常表達(dá)。例如，剪切因子SF3B1在患病的人和小鼠心臟中均表達(dá)上調(diào)[32]，Rbfox1基因在人類和小鼠心臟中表達(dá)下調(diào)[33]。然而，CHD病 人中DEGs一直未被明確闡述。
本研究分析了GEO數(shù)據(jù)庫的GSE71226和GSE19339數(shù)據(jù)集中CHD病人的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，擬篩選與CHD發(fā)生密切相關(guān)的DEGs，探討CHD基因水平的發(fā)病機制。結(jié)果顯示，1.118%～2.954%(GSE71226：2.954%;GSE19339：1.118%)的基因表達(dá)水平上調(diào)，同時有1.165%～6.667%(GSE71226：6.667%;GSE19339：1.165%)的基因表達(dá)水平下調(diào)，表明CHD的發(fā)生與細(xì)胞中基因表達(dá)的變化密切相關(guān)。
由于樣本來源和各微陣列平臺研究都存在差別，綜合分析各種微陣列數(shù)據(jù)集可以獲得更為準(zhǔn)確的結(jié)果，故選擇了兩個數(shù)據(jù)集中8個共同表達(dá)上調(diào)基因及114個共同表達(dá)下調(diào)基因進(jìn)行進(jìn)一步分析。GO注釋分析結(jié)果表明，這些DEGs參與了DNA轉(zhuǎn)錄和mRNA剪接調(diào)控，提示CHD的發(fā)生與細(xì)胞中RNA剪接紊亂有關(guān)。選擇性剪接是一種可實質(zhì)上改變基因表達(dá)模式的轉(zhuǎn)錄后機制。高達(dá)95%的人類基因具有多外顯子可變剪接形式，表明可變剪接是人類基因組功能復(fù)雜性的最重要組成部分之一。
本研究結(jié)果表明，大部分的CHDDEGs是可變剪接相關(guān)的基因，提示可變剪接調(diào)控在心臟病的研究中應(yīng)受到更多的重視。綜上所述，本文結(jié)果顯示，CHD病人RNA剪接相關(guān)基因的表達(dá)水平發(fā)生顯著改變，表明RNA剪接調(diào)控在CHD的發(fā)生過程中可能發(fā)揮了重要作用，但其在CHD中的具體作用機制仍有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果為CHD的進(jìn)一步研究及高危人群的篩查提供了新的思路。
[參考文獻(xiàn)]
[1]WONGND.EpidemiologicalstudiesofCHDandtheevolutionofpreventivecardiology[J].NatureReviewsCardiology，2014，11(5)：276-289.
[2]SHEPARDD，VANDERZANDENA，MORANA，etal.Is-chemicheartdiseaseworldwide，1990to2013：estimatesfromtheglobalburdenofdiseasestudy2013[J].CirculationCardio-vascularQualityandOutcomes，2015，8(4)：455-456.
[3]BENZIGERCP，ROTHGA，MORANAE.Theglobalbur-denofdiseasestudyandthepreventableburdenofNCD[J].GlobalHeart，2016，11(4)：393-397.
[4]FOLEYJRJ，PLEINS，GREENWOODJP.Assessmentofstablecoronaryarterydiseasebycardiovascularmagneticreso-nanceimaging：Currentandemergingtechniques[J].WorldJournalofCardiology，2017，9(2)：92-108.
作者：李召水1，王光靜2，喬友進(jìn)2，生偉2，黃強2，池一凡1
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