本文摘要：摘 要:目的 觀察復(fù)方中藥佳蓉片(JRP)與乙烯雌酚(DES)對(duì)生殖系統(tǒng)的不同作用. 方法 用JRP低(JRP-L，6g kg-1 )、JRP中(JRP-M，12g kg-1 )、JRP高(JRP-H，24g kg-1 )三個(gè)不同劑量、DES(0.17mg kg-1 )和生理鹽水(Con-trol0.5mL)每日分別灌胃處理70只未成年(17d)昆
摘 要:目的 觀察復(fù)方中藥佳蓉片(JRP)與乙烯雌酚(DES)對(duì)生殖系統(tǒng)的不同作用. 方法 用JRP低(JRP-L，6g kg-1 )、JRP中(JRP-M，12g kg-1 )、JRP高(JRP-H，24g kg-1 )三個(gè)不同劑量、DES(0.17mg kg-1 )和生理鹽水(Con-trol0.5mL)每日分別灌胃處理70只未成年(17d)昆明小鼠3d和50只去卵巢成年(60d)昆明小鼠28d，成年小鼠實(shí)驗(yàn)中另設(shè)灌服生理鹽水的假去卵巢組(Sham)和去卵巢組(OVX)，觀察對(duì)子宮質(zhì)量/體質(zhì)量百分比(PUM)、陰道上皮細(xì)胞角化百分比(VKEC)、血清17β雌二素(E2)水平的變化. 結(jié)果 (1)PUM值JRP不同劑量處理未成年小鼠3d后，JRP-M組的PUM值高于Control組(12.52.3，vs8.21.4，P<0.01)，但明顯低于DES組(37.03.8，P<0.01).JRP處理成年去卵巢小鼠28d后，OVX+JRP三個(gè)組的PUM值顯著高于OVX組(分別為10.91.9，11.33.3，14.67.8，vs8.41.4，P<0.05)，但明顯低于OVX+DES組(29.511.7，P<0.01)和Sham組(33.612.1P<0.01);(2)VKEC值OVX+JRP三個(gè)不同劑量組的VKEC值與OVX比較明顯增加(分別為7.12.5，11.03.5，9.45.4，vs1.80.8，P<0.05)，但增加值顯著低于DES組(5.71.4，P<0.05);(3)血清E2值OVX+JRP組和OVX+DES組的血清E2水平與OVX組比較無(wú)差異. 結(jié)論 JRP對(duì)小鼠子宮、陰道有弱雌激素樣作用，但作用強(qiáng)度遠(yuǎn)低于DES，這種作用可能不是通過提高內(nèi)源性E2水平而實(shí)現(xiàn)的.
關(guān)鍵詞: 中成藥;卵巢切除術(shù);子宮;小鼠;陰道
0 引言
激素替代治療在治療更年期綜合征，預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松和心血管疾病等方面有很好的療效，但用藥后患者陰道不規(guī)則出血、增加患子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌的危險(xiǎn)等副作用，使激素替代治療的可接受性較差[1-3] .研究發(fā)現(xiàn)中藥佳蓉片(JRP)對(duì)治療更年期綜合征，防治骨質(zhì)疏松等疾患有很好的療效，其臨床效果與雌激素相似[4，5] .但JRP是否也具有雌激素樣的作用，特別是對(duì)生殖系統(tǒng)的副作用值得研究.我們通過觀察藥物對(duì)未成年和成年卵巢摘除小鼠子宮體質(zhì)量百分比、陰道細(xì)胞涂片和血清雌激素等變化，比較了JRP與合成雌激素乙烯雌酚(diethyl-stilbestrol，DES)對(duì)生殖器官的雌激素樣作用.
1 材料和方法
1.1 實(shí)驗(yàn)藥品
DES(diethylstilbestrol)購(gòu)自Sigma公司.JRP(由西安博愛制藥廠提供)每片含生藥1.0g，臨用前用生理鹽水配制成所需濃度的混懸液.
1.2 動(dòng)物飼養(yǎng)條件
雌性昆明小鼠購(gòu)于本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)溫度22℃，12h光照，12h黑暗，容許自由飲水及攝食.未成年雌性昆明小鼠70只，出生后17d，體質(zhì)量(15±2)g.隨機(jī)分為7組，每組10只，立即開始實(shí)驗(yàn).成年雌性昆明小鼠50只，出生后60d，體質(zhì)量(37±2)g，隨機(jī)分為5組，每組10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)5d后開始實(shí)驗(yàn).
1.3 未成年雌性小鼠實(shí)驗(yàn)
分組及用藥劑量:對(duì)照組(control，生理鹽水0.5mL d-1 )，DES組(0.17mg kg-1 )，JRP組根據(jù)劑量又分為JRP-L(6g kg-1 )，JRP-M(12g kg-1 )，JRP-H(24g kg
-1 )等3個(gè)組，共處理3d.
1.4 成年雌性小鼠實(shí)驗(yàn)
1.4.1 模型復(fù)制及分組處理
�、倌Ｐ蛷�(fù)制:全部動(dòng)物在戊巴比妥鈉(10g L-1 )麻醉下行手術(shù).假手術(shù)組僅在開腹后去除卵巢周圍的脂肪組織后關(guān)腹;其余各組去除雙側(cè)卵巢.術(shù)后連續(xù)觀察陰道涂片4d，去卵巢后小鼠表現(xiàn)為動(dòng)情間期表現(xiàn)，證實(shí)手術(shù)成功;②分組處理:根據(jù)每日藥物處理劑量分為4組:OVX組(生理鹽水0.5mL d-1 )，假手術(shù)組(Sham，生理鹽水0.5mL d-1 )，OVX+DES組(0.17mg kg-1 )和OVX+JRP組.JRP根據(jù)處理劑量不同又分為JRP-L(6g kg-1 )、JRP-M(12g kg-1 )、JRP-H(24g kg-1 )等3組.術(shù)后第5d開始藥物灌胃，每只0.5mL，每日1次，連續(xù)28d.
1.4.2 陰道細(xì)胞涂片
成年小鼠灌胃第14日開始進(jìn)行陰道涂片觀察:以左手背位固定小鼠，右手取一預(yù)先吸有生理鹽水0.1～0.2mL的鈍頭吸管，小心插入小鼠陰道內(nèi)2～3cm反復(fù)抽吸2～3次，吸出1滴液體于載玻片上，均勻涂開，放入950mL L-1 乙醇中固定15min，取出晾干，用伊紅(5g L-1 )染色，顯微鏡下觀察并記數(shù)陰道上皮角化細(xì)胞(VKEC)百分率，每日涂片1次，連續(xù)觀察7d.
1.5 動(dòng)物處理
未成年和成年小鼠均在最后一次喂藥后24h稱體質(zhì)量，眼球取血0.8mL，然后以頸椎脫臼處死動(dòng)物，剖腹取出子宮，迅速用電子天平稱子宮濕質(zhì)量，計(jì)算子宮質(zhì)量百分比(PUM，%).成年小鼠的血清17β雌二醇水平(E2)用放射免疫法測(cè)定.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)采用x ±s表示，用t檢驗(yàn)比較組間差異.
2 結(jié)果
2.1 JRP對(duì)未成熟小鼠體質(zhì)量和子宮濕質(zhì)量的影響
與對(duì)照組比較，未成年雌性小鼠在JRP3個(gè)不同劑量組灌胃處理3d后，體質(zhì)量增加值和子宮濕質(zhì)量與對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.01)，但增加值顯著低于DES組(P<0.01).JRP-M組處理3d后，小鼠體質(zhì)量和子宮濕質(zhì)量較其它各JRP組增加明顯(P<0.01，Tab1). 表1 佳蓉片和雌激素對(duì)未成熟雌性小鼠子宮及體質(zhì)量的影響(略)
2.2 JRP對(duì)成年去卵巢小鼠的影響
去卵巢4wk后，OVX組的PUM明顯低于Sham組(P<0.01);DES組的PUM與Sham組無(wú)顯著差異;與OVX對(duì)照組比較，JRP-L，JRP-M，JRP-H3個(gè)組的PUM增加(P<0.05)，但顯著低于Sham組與OVX+DES組(P<0.05).小鼠去卵巢后，陰道細(xì)胞學(xué)檢查無(wú)動(dòng)情周期的變化，角化細(xì)胞數(shù)量極少;OVX+DES的角化細(xì)胞數(shù)量顯著上升，與OVX對(duì)照組有顯著的差異(P<0.05);JRP各組的陰道角化細(xì)胞數(shù)量與OVX組相比較有顯著性增加，但遠(yuǎn)低于OVX+DES組.OVX小鼠血清雌激素水平降低，與Sham組有顯著差異(P<0.01)，JRP-L，JRP-M，JRP-H和OVX+DES與OVX組的血清E2水平相似(Tab2).表2 佳蓉片對(duì)去卵巢小鼠子宮質(zhì)量百分比、陰道角化上皮細(xì)胞、血清E2水平的影響(略)
3 討論
更年期綜合征和絕經(jīng)相關(guān)疾病的發(fā)生與更年期婦女卵巢功能低下、雌激素水平降低密切相關(guān).隨著人口老齡化社會(huì)的到來(lái)，更年期綜合征及相關(guān)疾病的患者越來(lái)越多，由此而引起的家庭和社會(huì)雙重負(fù)擔(dān)日益加重.目前，激素替代治療是防治絕經(jīng)期綜合征及絕經(jīng)相關(guān)疾病的主要措施，但長(zhǎng)期應(yīng)用有增加子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌發(fā)病率的危險(xiǎn)，使絕經(jīng)后婦女對(duì)應(yīng)用激素替代治療的順從性不高[6-10] .因此，尋求 副作用小的更有效的治療方法具有十分重要的意義.我們多年的臨床實(shí)踐和基礎(chǔ)研究證明，主要成分為倒卵五葉加、熟地黃、菟絲子、肉蓯蓉、女貞子補(bǔ)腎中藥復(fù)方JRP具有補(bǔ)腎、滋陰壯陽(yáng)和扶正固本的功效，對(duì)更年期綜合征及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松等有很好的療效，臨床效果與雌激素類似[4，5] .現(xiàn)代研究表明，部分植物藥材中包含一類具有雌激素活性的化學(xué)物質(zhì)，統(tǒng)稱為植物雌激素(phytoestrogens)，它們的結(jié)構(gòu)可能與雌激素相似，可能存在與雌激素受體結(jié)合的基團(tuán)，也可能以其他方式與機(jī)體作用而表現(xiàn)為雌激素樣效應(yīng)[11，12] .植物雌激素有防治絕經(jīng)期綜合征，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的功效[7-11] ，而無(wú)刺激子宮內(nèi)膜和乳腺增生的副作用.有學(xué)者[13-15] 提出植物雌激素可作為激素替代治療的選擇之一.植物雌激素的深入研究為補(bǔ)腎中藥防治絕經(jīng)相關(guān)疾病提供了強(qiáng)有力的證據(jù).有關(guān)JRP作用機(jī)制的研究也表明，JRP對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)和性腺軸激素的調(diào)節(jié)作用[4，5] 與雌激素作用類似.因此，證實(shí)JRP是否具有雌激素樣作用及對(duì)生殖系統(tǒng)的副作用是本實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容.
未成熟雌性小鼠是公認(rèn)的研究外源性雌激素對(duì)生殖器官作用的理想模型，采用子宮濕質(zhì)量與體質(zhì)量之比的百分?jǐn)?shù)作為評(píng)價(jià)雌激素活性指標(biāo).該法簡(jiǎn)便快速，靈敏度高，植物藥中的多種化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)體內(nèi)轉(zhuǎn)化后才有雌激素活性的物質(zhì)和中間代謝產(chǎn)物特別適用于本方法檢測(cè).本實(shí)驗(yàn)中，用合成雌激素DES處理未成熟小鼠3d后體質(zhì)量和子宮濕質(zhì)量顯著增加，子宮體質(zhì)量百分比值升高，證實(shí)了本模型的可靠性.JRP3個(gè)不同劑量組處理未成年小鼠3d后，子宮體和體質(zhì)量顯著高于對(duì)照組.使去卵巢小鼠子宮體質(zhì)量百分比值顯著增加，并成劑量依賴性關(guān)系.結(jié)果提示中藥JRP有促進(jìn)機(jī)體合成代謝和弱雌激素樣作用.去卵巢小鼠的陰道細(xì)胞涂片可作為檢測(cè)植物雌激素活性的敏感指標(biāo).有正常動(dòng)情周期的小鼠摘除卵巢后，陰道上皮角化細(xì)胞率明顯減少至1.8%，而用DES后陰道上皮細(xì)胞率值達(dá)到95.7%.在本實(shí)驗(yàn)中，JRP3個(gè)劑量組的陰道細(xì)胞涂片中角化細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于DES組對(duì)陰道上皮細(xì)胞的影響，JRP的作用僅為DES的九分之一.血清雌激素水平測(cè)定發(fā)現(xiàn)，去卵巢小鼠雌激素水平低落，用JRP后雌激素水平無(wú)明顯變化，間接提示JRP弱雌激素樣作用并不是通過提高內(nèi)源性雌激素水平而實(shí)現(xiàn)的.近年來(lái)的研究提示部分中藥，包括佳蓉片組方中的中藥含有植物雌激素，JRP的弱雌激素樣活性有可能是JRP組方中的植物雌激素發(fā)揮的作用，這也為JRP治療更年期綜合征，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松等疾病，提供了藥理學(xué)證據(jù).中藥的藥理作用表現(xiàn)為多靶點(diǎn)、多途徑的綜合效應(yīng)，這與中藥，特別是中藥復(fù)方中含有眾多的化學(xué)物質(zhì)有關(guān).我們的研究?jī)H從一個(gè)側(cè)面，一個(gè)角度探討了JRP與雌激素作用的差異，補(bǔ)腎中藥的復(fù)雜作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究.
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