本文摘要：摘 要:目的 重組合異種骨(RBX)作為一種新型植骨材料在臨床治療骨缺損、骨不連等病例中取得了顯著療效.需進一步研究重組合異種骨中誘骨活性蛋白的相對分子質量范圍. 方法 采用肝素親和層析技術純化RBX中誘骨活性蛋白即骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)，利用小鼠肌袋實驗
摘 要:目的 重組合異種骨(RBX)作為一種新型植骨材料在臨床治療骨缺損、骨不連等病例中取得了顯著療效.需進一步研究重組合異種骨中誘骨活性蛋白的相對分子質量范圍. 方法 采用肝素親和層析技術純化RBX中誘骨活性蛋白即骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)，利用小鼠肌袋實驗檢測其骨誘導活性，再用聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)測量RBX中誘骨活性蛋白純化后的相對分子質量. 結果 在純化近20倍后，獲得8.23mg高度純化的蛋白質，組織學觀察其活性發(fā)現(xiàn)植入小鼠股部第10日，有大量軟骨細胞及軟骨島的出現(xiàn)，在局部區(qū)域還可見到條索狀骨小梁出現(xiàn)，SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)這種蛋白質的相對分子質量為35×10 3 ，經(jīng)還原后單體的相對分子質量為22×10 3 . 結論 重組合異種骨(RBX)中35×103 的蛋白質經(jīng)還原后為22×103 ，其單獨使用具有異位成骨活性，為RBX的臨床應用提供了理論依據(jù).
關鍵詞: 骨折愈合;蛋白質類/分離和提純
0 引言
骨移植在治療骨折不連接或延遲連接等多種原因造成的骨質缺損中應用廣泛，但異種骨移植的臨床應用尚未完全解決.重組合異種骨(RBX)的發(fā)明為骨移植的臨床應用開辟了新的領域，它是將具有誘骨活性的牛BMP與無抗原性的松質骨復合，臨床修復骨缺損、骨不連取得了良好的效果.但RBX中具有誘骨活性的BMP是從牛骨中初步提取的，我們還不確切知道RBX中誘骨活性成份(BMP粗提物)的分子質量，及它與RBX活性的關系.對其中起決定作用的誘骨成份尚不清楚.我們將天然提取的蛋白進一步分離、純化與分析，探討其中誘骨成份的作用機制，為重組合異種骨的臨床應用提供可靠的理論依據(jù).
1 材料和方法
1.1 重組合異種骨的制備
參考Urist等[1] 的報道，各個過程持續(xù)時間與試劑用量因初始骨粒不同而做了調整.選取新鮮小牛四肢骨骨干制成骨粉，經(jīng)脫脂、脫鈣及去除低分子量蛋白多糖等成份后，將其形成的骨基質明膠溶于提取液(6mol・L-1 脲/0.5mol・L-1 GaCl/1mmol・L-1 NEMI)24h，提取上清，經(jīng)透析、離心后得到粗制BMP，將其復溶于純化液(4mol・L-1 鹽酸胍/0.5mol・L-1 GaCl/1mmol・L-1 NEMI)，上清再經(jīng)透析、離心后得到了部分純化的BMP.在0.08MPa負壓下將其與牛松質骨載體(本校西京醫(yī)院自制)按1∶5質量比復合，蒸餾水透析72h，凍干.
1.2 肝素親和層析純化
取160mg部分純化的蛋白復溶于10mL的平衡緩沖液中(Buffer A:6mol・L-1 脲/50mmol・L-1 Tris.HCl/0.1mol・L-1 NaCl pH7.0)，以20000g的速度離心30min，除去其中不溶的物質.用上清對160mm×10mm的肝素親和層析柱加樣(注意不要破壞凝膠表面).層析柱分別按次序用以下三種緩沖液洗脫，即含有0.1，0.15，0.5mol・L-1 NaCl的Buffer A溶液，分別收集洗脫下來的蛋白質，經(jīng)透析、離心、凍干后保存，測質量.
1.3 生物活性檢測
選用雄性BALB/c小鼠(第四軍醫(yī)大學實驗動物中心供給)10只，體質量(20±2)g，隨機分成2組，每組5只.將凍干后的蛋白分別植入小鼠右側股部肌袋中，其中A組植入0.4mg純化后的蛋白質，B組同時植入牛血清白蛋白作為對照.在術后第10日全部處死，取出植入物周圍2cm的軟組織.標本均經(jīng)組織學常規(guī)處理，切片行HE染色，鏡下觀察異位成骨的情況.
1.4 蛋白相對分子質量的測定
采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，它多用于蛋白質及核酸的Mr 測定.將純化后的蛋白質溶于含有二硫蘇糖醇(DTT)或不含有DTT的樣品緩沖液中，90℃加熱3～5min，離心后用上清加樣.電泳凝膠為50mL・L-1 的積層膠、125mL・L-1 的分離膠.電泳完畢后，用考馬斯亮藍R-250染色，再測其相對分子質量.
2 結果
將部分純化的蛋白質加入層析柱后，洗脫液以120cm・h-1 的速度洗脫(Fig1所示).用Buffer A洗脫時，未吸附的蛋白質基本都流出;改用Buffer B液(含有0.15mol・L-1 NaCl)，洗脫吸附較弱的蛋白，從Fig1可見此時pH值下降，離子濃度增加，且有較大量的雜蛋白流出，稱為B峰;用含有0.5mol・L-1 NaCl的Buffer C液洗脫時，獲得C峰，此峰為我們主要收集的目的蛋白.A段蛋白與肝素親和層析無親和力，故棄去不用，將B峰、C峰收集的蛋白對四蒸水進行透析約24h，其間換液3次.透析發(fā)現(xiàn)，C峰蛋白有白色絮狀沉積，表明不溶于水;而B峰蛋白透析液仍澄清透明，均溶于水.將C份蛋白真空凍干后，測其質量為8.23mg，純化近20倍.
手術后的動物均未出現(xiàn)感染，生長良好.小白鼠于術后第10日處死，切片經(jīng)HE染色后觀察發(fā)現(xiàn)，A組所有標本切片上均可見到明顯的軟骨島形成，軟骨細胞大而圓，非常明顯，在個別區(qū)域可看到條索狀骨小梁的出現(xiàn)(Fig2)，周圍有少量淋巴細胞浸潤;B組無任何變化.
重組合異種骨自1988年發(fā)明以來，至今已用于千余例植骨術中，主要治療骨不連、延遲連接和骨缺損等[2] .隨訪發(fā)現(xiàn)，治愈率達90%以上，引起國內外骨科專家關注.RBX中誘骨活性蛋白(即部分純化的BMP)來源于小牛四肢皮質骨，提取方法參考Urist等[1] 的傳統(tǒng)方法，經(jīng)十余年的摸索、總結，建立了一套特有的工藝程序[3] .
RBX的動物實驗與臨床應用都證實它具有較強的誘骨活性，但其中誘骨成份到底如何，目前尚不完全清楚;部分純化的BMP活性往往優(yōu)于高度純化的BMP[4] ，其原因是否是由于純化過程中丟失了某些具有較強活性作用的蛋白質，因而本實驗試圖探討RBX中具有較強活性的蛋白的相對分子質量范圍.BMP的純化多采用離子交換層析、羥基磷灰石層析、葡聚糖系列凝膠層析及高壓液相色譜等方法.其中親和層析由于具有操作方便、重復性高及純化的蛋白純度高、在透析后仍具有較高的生物活性，得到許多學者的認同，在BMP的純化中取得了良好的結果
[5，6] .本實驗采用肝素親和層析，依靠離子間作用力洗脫.實驗操作分為2步，首先用含有0.15mol・L-1 NaCl的洗脫液洗脫，將一些與肝素非特異性結合的蛋白質先洗脫下來，再用高濃度液進行洗脫，將肝素高親合的BMP洗脫下來，獲得較高的純度.對160 mg的部分純化BMP進行純化，獲得與肝素具有高親和力的蛋白8.23mg，它在水中呈白色絮狀沉淀，溶解度較低.體內實驗中，將0.4mg純化后的蛋白質植入小鼠股部肌肉內后，第10日發(fā)現(xiàn)有大量軟骨細胞、軟骨島形成，軟骨細胞大而圓，非常明顯，并可見有條索狀骨小梁形成，此高度純化的蛋白質可以誘導未分化的間充質細胞分化為軟骨與骨，是具有異位成骨的能力.
在SDS-PAGE電泳中(Fig4)，純化后的蛋白Mr 為35×103 ，如在樣品緩沖液中加入二硫蘇糖醇(DTT)，經(jīng)還原處理后，Mr 為22×103 .DTT作為一種變性劑，較十二烷基硫酸鈉(SDS)作用更強烈，它可將蛋白質各鏈間的二硫鍵斷開，這樣具有空間結構的蛋白質就變成線狀的蛋白鏈.所以這種經(jīng)高度純化、具有較好活性的蛋白質在體內是由同源二聚體構成的，單體Mr 為22×103 ，與文獻報道一致:Luyten FP[6] 采用肝素親和色譜、羥基磷灰石等層析后發(fā)現(xiàn)，其活性蛋白Mr 為(30～40)×103 之間，經(jīng)還原后Mr為22×103 .Sampath TK
[5] 等也得到相似的結論，他們稱此為成骨素(osteogenin).經(jīng)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)與BMP
-3 有較高的同源性，但它不象重組BMP-3 在體內只能誘導軟骨形成，它還可誘導成骨.
另外，Wang等[7] 及Urist等[8] 都提出牛BMP的Mr 為(18.0±0.5)×10
3 .他們在提取過程中主要采用Sephacryl或Sepharose系列層析柱及離子交換層析柱或羥基磷灰石柱等，得到了30×103 的蛋白，還原后為30×103 ，18×103 ，16×103 ，其中認為18×103 的蛋白為真正的BMP，而30×103 ，16×103 的蛋白對于18×103 的BMP活性是不可缺少的.1990年有學者Sampath TK [9] 對BMP活性部分繼續(xù)研究，碳端氨基酸序列分析18×103 ，16×103 蛋白分別與OP-1，BMP-2同源性達到42%，47%，他認為天然BMP是由異源二聚體組成，兩條單鏈與BMP-2，OP-1的同源性很高.
不同的學者對BMP采用不同的提取與純化方法，得出不同的結論.這可能是與使用肝素親和色譜有關，有文獻報道BMP-3分子上有與肝素結合的位點[5] ，故采用此方法純化，能夠得到與Urist等[8] 不同的結果，有學者認為這種蛋白類似于BMP-3.
重組合異種骨誘骨活性成份中高度純化的BMP的獲得，及Mr 的測定對于RBX的臨床應用、進一步推廣提供了可靠的理論依據(jù).但由于條件有限，蛋白質的氨基酸序列分析及與粗提BMP活性的比較等某些問題，尚需進一步實驗研究.
參考文獻:
[1]Urist MR，Mikulski A，Lietze A.Solubilized and insolubilized bone morphogen-etic protein [J].Proc Natl Acad Sci，1979;76(4):1828-1832.
[2]Luo ZJ，Hu YY，Wang Q.Antigen-extracted bovine cancellous bone block/bBMP composite graft in repairing segmental radial diaphysial defects in rabbits [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;1:48-52.
[3]Guo Z，Hu YY，Lv R，Wang J.The modulation of BMP on ex-pression of TNF-αand IL-6gene in the area of implanted xeno-geneic bone [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;1:41-45.
[4]Bessho K，Tagawa T，Murata M.Analysis of bone morpho-genetic protein(BMP)derived from human and bovine bone ma-trix [J].Clin Orthop，1991;268:226-234.
[5]Sampath TK，Muthukamaran N，Reddi AH.Isolation of os-teogenin，an extracellular matrix-associated，bone-inductive pro-tein by heparin affinity chromatography [J].Proc Natl Acad Sci USA，1987;84(10);7109-7113.
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