本文摘要：【摘要】 目的：通過硝酸鎵對卵巢癌HO-8910細(xì)胞作用，分析誘導(dǎo)凋亡中對Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)的情況。方法：通過對卵巢癌HO-8910細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)，Western印跡檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果：硝酸鎵組、順鉑組及聯(lián)合治療組HO-8910細(xì)胞Bcl-
【摘要】 目的：通過硝酸鎵對卵巢癌HO-8910細(xì)胞作用，分析誘導(dǎo)凋亡中對Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)的情況。方法：通過對卵巢癌HO-8910細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)，Western印跡檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果：硝酸鎵組、順鉑組及聯(lián)合治療組HO-8910細(xì)胞Bcl-2的水平明顯低于空白對照組，硝酸鎵組、聯(lián)合治療組Bax、Caspase-3的水平明顯高于空白對照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：硝酸鎵對卵巢癌細(xì)胞的作用，可能與Bcl-2的表達(dá)水平下調(diào)，Bax、Caspase上調(diào)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】 硝酸鎵; 卵巢癌細(xì)胞; 蛋白表達(dá)
卵巢癌是婦科常見腫瘤之一，術(shù)后化療是常用方法，鎵是繼鉑金屬類藥物之后第二個(gè)用于腫瘤治療的藥物。雖然在骨質(zhì)疏松方面有應(yīng)用[1-5]，但在腫瘤方面尚未廣泛應(yīng)用于臨床，國內(nèi)外少見報(bào)道。本研究通過硝酸鎵、順鉑單藥及聯(lián)合用藥組分別以不同濃度體外作用卵巢癌HO-8910細(xì)胞，探討硝酸鎵作用機(jī)制，為腫瘤治療及制備抗腫瘤藥物提供新的途徑。
1 材料與方法
1.1 材料 硝酸鎵(Betapharma有限公司，上海，中國);順鉑注射液(齊魯制藥有限公司)。人卵巢癌HO-8910細(xì)胞株(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所)。
1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將卵巢癌HO-8910細(xì)胞株復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng)，選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞應(yīng)用。
1.3 實(shí)驗(yàn)分組 分成空白對照組、硝酸鎵組、順鉑組及硝酸鎵與順鉑聯(lián)合治療組。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，0.25%胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為1×105/mL，接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔接種100 μL。
1.4 蛋白的表達(dá)檢測 Western印跡法：將空白對照組和處理組(終濃度為：10 μg/mL的硝酸鎵，
10 μg/mL的順鉑，5 μg硝酸鎵+10 μg順鉑/mL的聯(lián)合組作用72 h后，空白對照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。)的細(xì)胞PBS清洗3次，加入裂解液(β巰基乙醇)，冰上冷卻后，12 000 rpm離心2 min，取上清液，以Bradford方法在595 nm波長下測定。SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜切膠：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要按照蛋白的分子量，以Marker為對照進(jìn)行切膠。將切好的膠置于轉(zhuǎn)膠緩沖液中室溫?fù)u晃平衡30 min。備膜：裁剪硝酸纖維素膜和濾紙，與膠的大小相當(dāng)?shù)源蟆４魇痔浊袨V紙和膜。將切好的硝酸纖維素膜置于甲醇中放置15 s，使之從不透明變透明，然后放入超純水中2 min，最后將處理好的硝酸纖維素膜放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15 min。裝膜：將轉(zhuǎn)膜用的夾子打開使黑的一面(負(fù)極)保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。浸泡好的濾紙，隨后按照凝膠→硝酸纖維素膜→濾紙→海綿墊的順序依次疊放，注意每一層都不能有氣泡(如有氣泡可用玻璃棒輕輕搟壓)。最后將白色板(正極)蓋好裝入轉(zhuǎn)膜槽中。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。轉(zhuǎn)膜：將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的周圍放置冰來降溫。本實(shí)驗(yàn)室使用220 mA轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)完后將膜取下硝酸纖維素膜，標(biāo)記一角。封閉(將膜用TBST中漂洗3次，每次5 min。漂洗后將硝酸纖維素膜放入加有BSA封閉液的平皿中，室溫下?lián)u床2 h)。加一抗：將封閉后的硝酸纖維素膜放至含有TBST的洗缸中，搖床上漂洗3次，每次5 min。洗完后分別加入Bax抗體(1∶300)、Caspases-3(1∶150)、Bcl-2(1∶300)抗體及β-actin抗體(1∶1000)，放入平皿中在側(cè)擺搖床上，室溫低速孵育2 h;加二抗：回收一抗，將硝酸纖維素膜在TBST洗缸中室溫?fù)u床漂洗3次，每次5 min，然后將漂洗過的硝酸纖維素膜放至加有辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶800)的平皿中，室溫避光孵育1 h。孵育后將硝酸纖維素膜在TBST洗缸中漂洗3次，每次5 min;化學(xué)發(fā)光，顯影，定影;凝膠圖像分析，采用Image J軟件分析處理。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用(x±s)表示，兩組比較采用作獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
Western結(jié)果進(jìn)行計(jì)算機(jī)圖像分析，見表1、圖1。硝酸鎵組、順鉑組及聯(lián)合治療組HO-8910細(xì)胞Bcl-2的水平明顯低于空白對照組;Bax、Caspase-3的水平硝酸鎵組、聯(lián)合治療組明顯高于空白對照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而順鉑作用細(xì)胞Bax、Caspase表達(dá)變化不顯著。
3 討論
早期，人們將放射性鎵用于對腫瘤的定位及檢測腫瘤細(xì)胞生長代謝的活性。2004年美國FDA已審批硝酸鎵注射液作為non.Hodgkin的淋巴癌治療的Ⅱ期臨床。鎵是繼鉑金屬類藥物之后第二個(gè)用于腫瘤治療的藥物，但它比順鉑類藥物療效顯著且毒性小[6-9]，能有效地治療某些癌癥[10-11]。人們逐漸認(rèn)識(shí)到鎵的化療作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出鎵對腫瘤的定位。且相關(guān)藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床研究。
目前認(rèn)為鎵可能抗癌機(jī)制主要包括轉(zhuǎn)鐵蛋白受體途徑，研究發(fā)現(xiàn)在部分惡性淋巴瘤和膀胱癌中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)增高，硝酸鎵對于這種類型的腫瘤的治療效果明顯可能是通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體途徑抑制了轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的活性，阻止鐵進(jìn)入細(xì)胞，致細(xì)胞內(nèi)鐵缺乏而導(dǎo)致核糖核苷酸還原酶鐵依賴M2亞單位活性降低，抑制了細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)[12-13]。
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《中國針灸》雜志為國家級大型綜合性針灸學(xué)術(shù)期刊，創(chuàng)刊于1981年8月，由中國科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)主管，中國針灸學(xué)會(huì)、中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所主辦，《中國針灸》編輯部編輯出版。國內(nèi)外公開發(fā)行，為國際標(biāo)準(zhǔn)大16開，月刊，96頁，采用輕涂紙全彩色印刷。
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