本文摘要：【摘 要】 【目的】 優(yōu)化雙向凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)步驟，總結(jié)出一套適用于原發(fā)性肝癌組織的雙向凝膠電泳技術(shù)。【方法】 對(duì)雙向電泳實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：樣本處理、上樣方法、聚焦條件等進(jìn)行研究與優(yōu)化，考馬斯亮藍(lán)染色后進(jìn)行凝膠圖像比較。 【結(jié)果】 采用7 mmol /L尿
【摘 要】 【目的】 優(yōu)化雙向凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)步驟，總結(jié)出一套適用于原發(fā)性肝癌組織的雙向凝膠電泳技術(shù)。【方法】 對(duì)雙向電泳實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：樣本處理、上樣方法、聚焦條件等進(jìn)行研究與優(yōu)化，考馬斯亮藍(lán)染色后進(jìn)行凝膠圖像比較。 【結(jié)果】 采用7 mmol /L尿素、2 mol /L硫脲、40 g/L CHAPS、100 mmol /L DTT、5 g/L (pH 3-10) IPG buffer，1 mmol /L PMSF作為裂解液，丙酮沉淀蛋白，主動(dòng)水化上樣法，聚焦電壓達(dá)到140 kV可以得到分辨率高、重復(fù)性好的結(jié)果。 【結(jié)論】 上述改良提高了2-D圖譜中蛋白位點(diǎn)的分辨率和重復(fù)性，為原發(fā)性肝癌組織的蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】 原發(fā)性肝癌; 蛋白質(zhì)組學(xué); 雙向電泳
原發(fā)性肝癌(以下簡(jiǎn)稱肝癌)是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率在我國(guó)惡性腫瘤中位居第二[1]。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究腫瘤發(fā)生機(jī)制[2]，尋找腫瘤標(biāo)志物的重要工具，對(duì)于肝癌發(fā)生機(jī)制和治療作用靶點(diǎn)的研究具有重要意義[3]。我國(guó)早在2003年就啟動(dòng)了人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃(HUPO)，并取得了一定的研究成果。但關(guān)于肝癌組織雙向電泳的技術(shù)卻少完整系統(tǒng)的報(bào)道，為了建立高分辨率可重復(fù)的肝癌組織雙向凝膠電泳技術(shù)，我們對(duì)人肝癌組織的雙向電泳技術(shù)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行了研究對(duì)比，優(yōu)選出一套適合肝癌組織的雙向凝膠電泳方法，供從事肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳的技術(shù)人員參考。
1 材料與方法
1.1 材 料
1.1.1 標(biāo)本采集
原發(fā)性肝癌組織來(lái)自我院肝癌切除術(shù)患者。組織離體后立即以預(yù)冷PBS沖洗，在冰上分裝置入凍存管，液氮中速凍，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｋ胁±?jīng)術(shù)后病理證實(shí)為原發(fā)性肝細(xì)胞癌。
1.1.2 試 劑
丙烯酰胺、甲叉雙丙稀酰胺、過(guò)硫酸胺、四甲基乙二胺(TEMED)、三羥甲基氨基甲烷 (Tris)、尿素、十二烷基硫酸鈉(SDS)、3-[3-(膽酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸鹽(CHAPS)、二硫蘇糖醇(DTT)、甘氨酸、IPG緩沖液(pH 3 ～ 10)、蛋白酶抑制劑、碘乙酰氨(IAA)、硫脲、18 cm 膠條(pH 3 ～ 10 NL)均為Amersham公司產(chǎn)品。TCA、丙酮為Sigma公司產(chǎn)品。無(wú)水乙醇為國(guó)產(chǎn)分析純(廣州化學(xué)試劑廠)，所有溶液均用去離子水配制。
1.1.2 主要設(shè)備
Immobiline Dry Strip，Ettan IPG 3等電聚焦電泳儀，Ettan DALT six 600 垂直電泳槽，Imagescanner高密度掃描儀，ImageMaster軟件均購(gòu)自Amersham公司。
1.2 方 法
1.2.1 蛋白質(zhì)樣品制備
粗樣本制備：取肝癌組織100 mg，液氮冷凍研磨，加入0.5 mL裂解液(含10 g/L PMSF蛋白酶抑制劑)，裂解液(7 mmol/L尿素、2 mol/L硫脲、40 g/L CHAPS、100 mmol/L DTT、50 g/L(pH 3 ～ 10) IPG buffer，1 mmol /L PMSF)，超聲裂解，15 ℃，離心10 min，取上清液，4 ℃，超速離心50 min，避開(kāi)漂浮的脂質(zhì)層，吸取離心上清4 ℃，再次離心50 min;取上清。Bradford法定量，分裝后置-80 ℃保存。為充分去除樣本中含有的雜質(zhì)對(duì)等電聚焦的影響，我們采用了常用的三種蛋白沉淀方法，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。①丙酮沉淀蛋白：加入4倍體積的冰丙酮使蛋白在-20 ℃沉淀至少2 h，4 ℃，離心15 min，用裂解液重溶。 ②三氯乙酸/丙酮沉淀：將三氯乙酸加到提取組織液中，終質(zhì)量濃度為100 g/L，再加入4倍體積的冰丙酮使蛋白在-20 ℃沉淀至少2 h， 4 ℃離心15 min，最后再用冰丙酮清洗沉淀 ，去除三氯乙酸，用裂解液重溶。③Cleaning-up試劑盒沉淀蛋白：按Amersham公司的試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用裂解液重溶。
1.2.2 等電聚焦電泳
分別采取目前常用兩種上樣方法：標(biāo)準(zhǔn)膠條槽上樣(主動(dòng)水化)及杯上樣(被動(dòng)水化)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析。聚焦程序參考聚焦系統(tǒng)操作指南，同時(shí)利用軟件對(duì)聚焦電壓，電流進(jìn)行檢測(cè)，指導(dǎo)聚焦程序的調(diào)整，對(duì)不同聚焦方法進(jìn)行比較分析(表1)。
1.2.3 第二向 SDS 電泳
(SDS-PAGE) 等電聚焦后的膠條分別以SDS平衡緩沖液(第一次加入100 mg/10 mL DTT，第二次加入250 mg/10 mL 碘乙酰胺)平衡兩次，每次15 min。平衡后IPG膠條轉(zhuǎn)移至電泳系統(tǒng)，用125 g/L的膠進(jìn)行二向電泳，每塊膠2 W，電泳50 min后改為每塊膠15 W，電泳至溴酚藍(lán)跑到凝膠底部。凝膠進(jìn)行熱考馬斯亮蘭染色。
1.2.4 凝膠圖像采集與分析
染色后凝膠以Image scanner高密度掃描儀獲取圖像，利用ImageMaster軟件對(duì)圖像進(jìn)行蛋白質(zhì)斑點(diǎn)自動(dòng)檢測(cè)，然后手工刪除假點(diǎn)，添加未檢出的斑點(diǎn)，最后進(jìn)行斑點(diǎn)匹配，分析。
2 結(jié) 果
2.1 蛋白沉淀方法對(duì)電泳結(jié)果的影響
從圖1可見(jiàn)，未經(jīng)處理的樣本蛋白點(diǎn)雖然很多(1 920點(diǎn))，但分辨率很差。丙酮，TCA-丙酮，Cleaning-up 試劑盒沉淀后的樣本與原始樣本相比均有很多改善，但TCA-丙酮丟失的蛋白較多(1 644點(diǎn))，丙酮(1 856點(diǎn))，和Cleaning-up(1 713點(diǎn))丟失的蛋白較少。圖 1B中，經(jīng)TCA-丙酮沉淀后，酸性蛋白大量丟失。圖1C中，丙酮沉淀蛋白點(diǎn)數(shù)多且清楚，無(wú)明顯拖帶和條紋，背景干凈清晰，說(shuō)明蛋白質(zhì)富集和純化的效果都比較好。
2.2 不同聚焦條件對(duì)電泳結(jié)果的影響
圖2中，A聚焦電壓是80 kV，B聚焦電壓140 kV。由于聚焦時(shí)電流較高，將500 V延長(zhǎng)2 h，1 kV延長(zhǎng)了1 h，從圖中可見(jiàn)B的聚焦效果比A有很大改善。圖C是我們監(jiān)測(cè)的延長(zhǎng)低壓聚焦后(圖B)的IEF電壓走勢(shì)圖，從圖中可見(jiàn)電壓升至設(shè)定的80 kV進(jìn)行聚焦。圖2 B蛋白點(diǎn)數(shù)較A明顯增多，特別是酸性端，說(shuō)明B聚焦效果明顯好于A。
2.3 主動(dòng)水化與被動(dòng)水化上樣的電泳結(jié)果
從圖3中可看出，圖A中的蛋白點(diǎn)數(shù)明顯增多，點(diǎn)也更圓 ，而且沒(méi)有圖B中的橫條紋。說(shuō)明主動(dòng)水化比被動(dòng)水化的聚焦效果更好。
3 討 論
雙向凝膠電泳(2-DE)由于其在展示全部蛋白質(zhì)表達(dá)改變并鑒定特異性蛋白方面的優(yōu)勢(shì)，成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究首選的分離技術(shù)[4]，近年來(lái)得到了較大的發(fā)展與改善，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性仍有待提高[5]。我國(guó)關(guān)于肝癌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究越來(lái)越多，由于肝癌組織成分復(fù)雜，干擾成分多，個(gè)體差異大使其雙向電泳實(shí)驗(yàn)條件難以嚴(yán)格控制[6]，目前尚沒(méi)有針對(duì)該組織的雙向電泳技術(shù)的方法學(xué)的系統(tǒng)報(bào)道，為此，我們對(duì)肝癌組織蛋白的制備、一向聚焦程序、上樣方法等關(guān)鍵步驟進(jìn)行研究對(duì)比，優(yōu)化總結(jié)出一套可行的，重復(fù)性好的雙向電泳方法，供大家參考。
3.1 樣品制備
蛋白質(zhì)樣品的制備是的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，關(guān)系到蛋白質(zhì)組研究結(jié)果的準(zhǔn)確性[7]。樣本制備主要包括蛋白提取與沉淀兩個(gè)步驟。蛋白提取過(guò)程需盡可能地溶解和解聚蛋白質(zhì)[8]。通常采用分級(jí)提取蛋白的方法，但是繁瑣的樣品制備步驟容易造成樣品中蛋白質(zhì)組分的丟失[9]。為了盡可能減少蛋白丟失，我們采用液氮冷凍研磨的方法提取蛋白。另外，裂解液的選擇也非常關(guān)鍵[10]。目前常用的裂解液配方有兩種：第一種，7 mmol /L尿素，4%(CHAPS)，0.5%的IPG，0.1 mmol/L DTT;第二種，將8 mmol/L 尿素改為7 mmol/L尿素，2 mmol/L硫脲[11]。后者添加了硫脲，它可以增強(qiáng)蛋白的溶解，特別是溶解疏水蛋白。Fialka在對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白提取中，添加了硫脲，獲得一系列的亞細(xì)胞器膜蛋白的如跨膜蛋白Ecadherin等[12]。為了盡可能得到肝癌組織的全蛋白，我們采用了含硫脲的裂解液。
蛋白沉淀，目前還有許多問(wèn)題沒(méi)有解決，如沉淀后蛋白的溶解，特別是一些疏水蛋白、低豐度蛋白等不容易重溶，而它們可能是藥物的靶向位點(diǎn)，或是腫瘤細(xì)胞的表面抗原，在疾病發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[13]。肝癌樣本中含有的脂肪、核酸和大量的鹽分，影響等電聚焦。鹽離子在水化過(guò)程中容易滲入膠條，使凝膠內(nèi)產(chǎn)生不均一的電流分布，導(dǎo)致雙向電泳結(jié)果出現(xiàn)條紋和不均一背景[14]。因此，必須采用蛋白沉淀的方法去除這些雜質(zhì)，才能順利地完成聚焦。目前， 已有不少有關(guān)樣本沉淀的報(bào)道，最常使用丙酮沉淀法，TCA-丙酮沉淀法，和商業(yè)化的Cleaning-up kit來(lái)沉淀蛋白，但沉淀的效果如何，卻沒(méi)人做過(guò)系統(tǒng)的比較分析。本文將這三種沉淀方法都進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，TCA-丙酮沉淀法蛋白丟失較多，與它的作用原理有關(guān)。蛋白質(zhì)在 pH 值小于等電點(diǎn)的環(huán)境中帶上正電荷，與TCA的酸根結(jié)合生成不溶鹽而沉淀，再用丙酮將酸根完全抽提，獲得較純的蛋白質(zhì)樣品[15]。因此它對(duì)堿性蛋白的富集效果較好，但對(duì)等電點(diǎn)小于溶液 pH 值的酸性蛋白富集效果差，有機(jī)溶劑的多次作用造成了蛋白質(zhì)溶解性變差也加劇了蛋白質(zhì)的丟失。圖1B中用TCA-丙酮沉淀后酸端蛋白丟失很明顯。
丙酮沉淀法是通過(guò)降低水的介電常數(shù)，破壞蛋白質(zhì)膠體的水化層，形成沉淀析出[16]。但是， 蛋白質(zhì)分子在常溫或升溫時(shí)立體結(jié)構(gòu)展開(kāi)，丙酮極容易與其中的色氨酸、酪氨酸等氨基酸進(jìn)行疏水結(jié)合導(dǎo)致蛋白變性，因此整個(gè)沉淀過(guò)程應(yīng)使用預(yù)冷的丙酮[17]。Cleaning-up 試劑盒是商家進(jìn)行改良后的沉淀法，也獲得了很好的電泳圖譜，但相比之下，丙酮具有經(jīng)濟(jì)方便等優(yōu)點(diǎn)，所以我們推薦使用丙酮沉淀法。
3.2 聚焦程序
一向聚焦是雙向電泳成功的關(guān)鍵，但好的聚焦程序是怎樣摸索出來(lái)的呢?我們的經(jīng)驗(yàn)是首先根據(jù)IEF的原則編排基礎(chǔ)聚焦程序;再根據(jù)樣本是否除鹽決定低壓聚焦的步驟及時(shí)間;最終的聚焦電壓以5 ～ 8 kV為適，聚焦時(shí)間以10 h為基礎(chǔ)進(jìn)行調(diào)整。為了確保實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，最終聚焦要選擇千伏結(jié)束。此外，在IEF過(guò)程中，利用軟件對(duì)聚焦時(shí)的電壓，電流進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，指導(dǎo)低壓聚焦時(shí)間及步驟的調(diào)整。如電流過(guò)高，可在低電壓處延長(zhǎng)聚焦時(shí)間，利用低壓達(dá)到除鹽的效果。
3.3 上樣方法
一向等電聚焦最常用的上樣方法包括主動(dòng)水化和被動(dòng)水化。主動(dòng)水化中，由于施加低電壓有利于大分子蛋白的進(jìn)入膠條[18]，可避免杯上樣所產(chǎn)生的滲漏問(wèn)題。被動(dòng)水化法可任意調(diào)節(jié)上樣位置，所以特別適合偏酸或偏堿蛋白的聚焦;最高電流可達(dá)75 ?滋A，因此對(duì)鹽的耐受能力較強(qiáng);同時(shí)具有避免蛋白在長(zhǎng)時(shí)間的低電壓水化過(guò)程中丟失等優(yōu)點(diǎn)。但有些蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)靠近上樣處，遷移率及溶解性降低，易沉淀在上樣杯處，在二相電泳中表現(xiàn)為在上樣處形成條紋狀。實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)當(dāng)根據(jù)樣本類型和實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇。本實(shí)驗(yàn)中，肝癌組織蛋白主要在pH 3 ～ 10之間，通過(guò)比較，我們選擇主動(dòng)水化。
蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)涉及的步驟很多，除了上述關(guān)鍵步驟，還有凝膠濃度，染色方法的選擇等。實(shí)驗(yàn)時(shí)要根據(jù)感興趣的蛋白的分子量選擇凝膠濃度，常規(guī)選擇125 g/L的凝聚;如果大分子質(zhì)量的蛋白較多可以選擇100 g/L的凝膠，相反，如果小分子質(zhì)量的蛋白多，則選擇150 g/L的凝膠。常用的染色方法有考染、膠體考染、銀染、熒光染色等。一般上樣量大于300 μg時(shí)可選擇考染或膠體考染;上樣量在100 ～ 300 μg選擇銀染;小于100 μg選擇熒光染色。
我國(guó)肝癌組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究已有很多報(bào)道，但沒(méi)有系統(tǒng)的總結(jié)雙向電泳的方案。本研究充分結(jié)合肝癌組織成分特點(diǎn)及雙向電泳的具體要求，從雙向電泳的全過(guò)程進(jìn)行探討，通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得理想的雙向電泳圖譜，形成了一套用于肝癌蛋白質(zhì)組學(xué)研究的穩(wěn)定可靠的雙向電泳技術(shù)方案，供從事肝癌蛋白質(zhì)組學(xué)研究人員參考，為進(jìn)一步的蛋白質(zhì)組學(xué)分析奠定基礎(chǔ)。
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