本文摘要：【摘 要】 目的對亞洲帶絳蟲膜聯(lián)蛋白B2(Annexins B2)進行克隆表達及免疫學初步研究。方法利用在線生物信息學工具從亞洲帶絳蟲成蟲cDNA文庫中篩選出Annexins B2基因，并將該基因克隆到原核表達質(zhì)粒pET-28a(+)中，在大腸埃希菌BL21/DE3中誘導表達，表達產(chǎn)物通
【摘 要】 目的對亞洲帶絳蟲膜聯(lián)蛋白B2(Annexins B2)進行克隆表達及免疫學初步研究。方法利用在線生物信息學工具從亞洲帶絳蟲成蟲cDNA文庫中篩選出Annexins B2基因，并將該基因克隆到原核表達質(zhì)粒pET-28a(+)中，在大腸埃希菌BL21/DE3中誘導表達，表達產(chǎn)物通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定，重組后的蛋白用His-鎳蛋白純化柱純化，純化的重組蛋白用Western blotting進行免疫學分析。結果PCR、雙酶切及重組質(zhì)粒DNA測序均顯示重組體構建成功，并得到高純度的蛋白，且該重組蛋白可被亞洲帶絳蟲、豬帶絳蟲及牛帶絳蟲患者的血清識別。結論亞洲帶絳蟲成蟲Annexins B2基因可在原核表達系統(tǒng)中獲得具有免疫活性的高效表達。
【關鍵詞】 亞洲帶絳蟲;膜聯(lián)蛋白B2;基因克隆;免疫反應性
鑒于亞洲帶絳蟲與豬帶絳蟲及牛帶絳蟲在起源、分類學地位存在的差異[1-2]，本課題組率先構建亞洲帶絳蟲成蟲全長cDNA質(zhì)粒文庫，并對該蟲進行功能基因組的研究工作[3]。本文利用生物信息學工具從文庫中篩選到了一個膜聯(lián)蛋白B2(Annexins B2)的同源基因，構建了原核表達載體，并對其原核表達產(chǎn)物進行免疫學方面的初步研究。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1血清、載體與菌株3種人體帶絳蟲患者血清取自糞檢陽性的帶絳蟲患者。原核表達質(zhì)粒pET-28a(+)及大腸埃希菌BL-21/DE3由中山大學熱帶病防治教育部重點實驗室惠贈。
1.1.2主要試劑和工具酶Ex Taq酶(含dNTP)，BamHⅠ，XhoⅠ，T4 DNA連接酶 (大連寶生物工程公司);異丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)(美國Promega公司);質(zhì)粒純化試劑盒(廣州東盛科技公司);辣根過氧化物酶標記的山羊抗豬IgG二抗、兔抗人二抗、3，3二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);氯化鈣、氯化鈉等為國產(chǎn)分析純試劑。
1.2方法
1.2.1Annexins B2基因的識別及擴增將獲得的亞洲帶絳蟲Annexins B2基因進行BLASTX分析。并根據(jù)已獲得的該基因全長編碼序列的開放閱讀框，利用軟件設計引物(引物由上海聯(lián)合基因公司合成)，分別帶上BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位點進行PCR反應。
1.2.2重組原核表達質(zhì)粒的構建及鑒定PCR產(chǎn)物和pET-28a(+)載體分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收、連接后轉入大腸埃希菌BL-21/DE3感受態(tài)細胞，對陽性克隆依次進行質(zhì)粒的提取、雙酶切和PCR鑒定，并進行重組質(zhì)粒DNA測序鑒定(測序由英俊科技股份有限公司完成)。
1.2.3重組蛋白的表達及純化按照常規(guī)方法進行蛋白誘導表達，考馬斯亮蘭蛋白染色液染色觀察蛋白表達情況。確定蛋白表達后，進行大量的誘導表達，并判斷重組蛋白的可溶性，再將樣品加入預先處理好的Ni-IDA His.Bind樹脂親和層析純化柱中，最后再用PBS 24h透析以去掉過柱時留下的咪唑。
1.2.4Western blotting分析重組蛋白的免疫反應性用3種人體帶絳蟲患者及正常人血清與辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗人IgG進行Western blotting鑒定。
2結果
2.1Annexins B2基因的識別和序列分析該基因全長922bp，編碼區(qū)為224～686bp。其最大ORF為其完整編碼區(qū)。
2.2原核重組質(zhì)粒的鑒定將重組質(zhì)粒進行PCR和雙酶切鑒定，產(chǎn)物行0.8g/L瓊脂糖凝膠電泳。結果顯示在500bp左右有一清晰條帶，與目的基因大小基本相符。此外，重組質(zhì)粒的測序報告表明插入序列與理論序列一致，證明重組質(zhì)粒構建成功(圖1)。
2.2蛋白表達及純化結果將構建好的重組質(zhì)粒轉化到E.coli BL/DE3中，超聲裂解后SDS-PAGE電泳分析結果顯示在大約25ku處出現(xiàn)高效表達條帶(圖2)，與目的蛋白基本相符。測得純化產(chǎn)物的蛋白濃度為0.526g/L。
2.3Western blotting鑒定純化蛋白的免疫反應性
用感染亞洲帶絳蟲、豬帶絳蟲、感染牛帶絳蟲的患者血清以及亞洲帶絳蟲感染豬的血清與純化蛋白反應的結果均顯示出較清晰的條帶，而陰性對照血清在相應位置未識別出該蛋白條帶(圖3)，表明該表達產(chǎn)物具有良好的免疫反應性。圖1重組質(zhì)粒的PCR和雙酶切鑒定 Fig.1 The identification of the pET-28a(+)-Ta Annexins B2 by PCR amplification and digestion with restriction enzymesM1：DNA標準(DL2000);1：PCR產(chǎn)物;2：pET-28a(+)質(zhì)粒雙酶切;3：pET-28a(+)-Annexins B2重組質(zhì)粒雙酶切;M2：DNA標準(DL 15000)。圖2100g/L SDS-PAGE分析pET-28a(+)-Ta Annexins B2在大腸埃希菌中的表達產(chǎn)物及其純化產(chǎn)物Fig.2 100g/L SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression product and purified product M：蛋白Marker;1：pET-28a(+)IPTG未誘導;2：pET-28a(+)IPTG誘導;3：pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG未誘導;4：pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG誘導;5：pET-28a(+)-Annexins B2上清;6：pET-28a(+)-Annexins B2沉淀;7：pET-28a(+)-Annexins B2純化蛋白。
3討論
帶絳蟲病的流行在我國西部一直是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。每年由帶絳蟲病造成的健康和畜牧業(yè)經(jīng)濟損失上百億，嚴重影響西部欠發(fā)達地區(qū)的社會發(fā)展。目前，亞洲帶絳蟲病的防治研究的重點集中在診斷和疫苗候選抗原、藥物靶標、致病的分子機制研究。圖3重組蛋白的Western blotting 鑒定Fig.3 Western blotting analysis of the recombinantsM：蛋白Marker;1：純化蛋白與亞洲帶絳蟲患者血清的反應結果;2：純化蛋白與牛帶絳蟲患者血清的反應結果;3：純化蛋白與豬帶患者血清的反應結果;4：純化蛋白與亞洲帶絳蟲感染豬血清的反應結果;5：純化蛋白與正常人血清的反應結果。
本實驗通過生物信息學方法從已經(jīng)構建好的亞洲帶絳蟲成蟲cDNA質(zhì)粒文庫中篩選出了一個膜聯(lián)蛋白(Annexins B2)的同源基因，并且預測出該基因位于胞漿，無跨膜區(qū)，二級結構基本上是以α螺旋為主。這些都符合膜聯(lián)蛋白家族的共同特征[4]。根據(jù)膜聯(lián)蛋白家族分布廣泛，表達豐富且穩(wěn)定的特性，可以推測其在絳蟲的生理活動中可能起著重要的作用。
膜聯(lián)蛋白是一個廣泛存在的蛋白家族，在所有真核基因組中廣泛表達。具有內(nèi)部重復單位和“G-X-G-T-(38residues)-D/E”基序[5]，即Ca2+結合區(qū)域的特征，用以結合帶有負電的脂質(zhì)。雖然它為鈣結合蛋白，但是在結構上卻沒有EF手，而且在和Ca2+結合后，還可以與磷脂再次結合而發(fā)揮生物學效應。例如，細胞的胞吞胞吐，離子通道的形成，調(diào)節(jié)磷脂酶A2的活性及細胞內(nèi)外Ca2+濃度、抗炎癥反應等。在長期的生物進化過程中，膜聯(lián)蛋白家族各成員在生物學特性和生理功能方面表現(xiàn)出非常復雜的關系，且在研究過程中發(fā)現(xiàn)，annexins沒有信號肽，沒有跨膜結構，是一個典型的細胞內(nèi)蛋白。但是，卻有學者發(fā)現(xiàn)它可以與細胞外基質(zhì)發(fā)生作用。例如，抗炎[6]、抗凝[7]、抑制腫瘤[8]等。最新的研究報道，當將其作為疫苗的候選因子時，可以消除一些寄生于哺乳動物體內(nèi)的寄生蟲。此外，學者們認為膜聯(lián)蛋白是維持細胞膜表面結構和信號轉導功能的重要蛋白。并可能具有激活纖維蛋白酶原的功能，有助于破壞宿主的結締組織，使蟲體抗原更加容易進入宿主機體，誘發(fā)免疫應答。因此，對該基因的研究有助于進一步了解它的生物學功能及開辟預防治療寄生蟲病的新途徑[9-10]。
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