本文摘要：【摘 要】 目的對(duì)亞洲帶絳蟲(chóng)膜聯(lián)蛋白B2(Annexins B2)進(jìn)行克隆表達(dá)及免疫學(xué)初步研究。方法利用在線生物信息學(xué)工具從亞洲帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)中篩選出Annexins B2基因，并將該基因克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)中，在大腸埃希菌BL21/DE3中誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通
【摘 要】 目的對(duì)亞洲帶絳蟲(chóng)膜聯(lián)蛋白B2(Annexins B2)進(jìn)行克隆表達(dá)及免疫學(xué)初步研究。方法利用在線生物信息學(xué)工具從亞洲帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)中篩選出Annexins B2基因，并將該基因克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)中，在大腸埃希菌BL21/DE3中誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定，重組后的蛋白用His-鎳蛋白純化柱純化，純化的重組蛋白用Western blotting進(jìn)行免疫學(xué)分析。結(jié)果PCR、雙酶切及重組質(zhì)粒DNA測(cè)序均顯示重組體構(gòu)建成功，并得到高純度的蛋白，且該重組蛋白可被亞洲帶絳蟲(chóng)、豬帶絳蟲(chóng)及牛帶絳蟲(chóng)患者的血清識(shí)別。結(jié)論亞洲帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)Annexins B2基因可在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得具有免疫活性的高效表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】 亞洲帶絳蟲(chóng);膜聯(lián)蛋白B2;基因克隆;免疫反應(yīng)性
鑒于亞洲帶絳蟲(chóng)與豬帶絳蟲(chóng)及牛帶絳蟲(chóng)在起源、分類(lèi)學(xué)地位存在的差異[1-2]，本課題組率先構(gòu)建亞洲帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒文庫(kù)，并對(duì)該蟲(chóng)進(jìn)行功能基因組的研究工作[3]。本文利用生物信息學(xué)工具從文庫(kù)中篩選到了一個(gè)膜聯(lián)蛋白B2(Annexins B2)的同源基因，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并對(duì)其原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫學(xué)方面的初步研究。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1血清、載體與菌株3種人體帶絳蟲(chóng)患者血清取自糞檢陽(yáng)性的帶絳蟲(chóng)患者。原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)及大腸埃希菌BL-21/DE3由中山大學(xué)熱帶病防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。
1.1.2主要試劑和工具酶Ex Taq酶(含dNTP)，BamHⅠ，XhoⅠ，T4 DNA連接酶 (大連寶生物工程公司);異丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)(美國(guó)Promega公司);質(zhì)粒純化試劑盒(廣州東盛科技公司);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗豬IgG二抗、兔抗人二抗、3，3二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);氯化鈣、氯化鈉等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>
1.2方法
1.2.1Annexins B2基因的識(shí)別及擴(kuò)增將獲得的亞洲帶絳蟲(chóng)Annexins B2基因進(jìn)行BLASTX分析。并根據(jù)已獲得的該基因全長(zhǎng)編碼序列的開(kāi)放閱讀框，利用軟件設(shè)計(jì)引物(引物由上海聯(lián)合基因公司合成)，分別帶上BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)進(jìn)行PCR反應(yīng)。
1.2.2重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定PCR產(chǎn)物和pET-28a(+)載體分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收、連接后轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL-21/DE3感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)陽(yáng)性克隆依次進(jìn)行質(zhì)粒的提取、雙酶切和PCR鑒定，并進(jìn)行重組質(zhì)粒DNA測(cè)序鑒定(測(cè)序由英俊科技股份有限公司完成)。
1.2.3重組蛋白的表達(dá)及純化按照常規(guī)方法進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，考馬斯亮蘭蛋白染色液染色觀察蛋白表達(dá)情況。確定蛋白表達(dá)后，進(jìn)行大量的誘導(dǎo)表達(dá)，并判斷重組蛋白的可溶性，再將樣品加入預(yù)先處理好的Ni-IDA His.Bind樹(shù)脂親和層析純化柱中，最后再用PBS 24h透析以去掉過(guò)柱時(shí)留下的咪唑。
1.2.4Western blotting分析重組蛋白的免疫反應(yīng)性用3種人體帶絳蟲(chóng)患者及正常人血清與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗人IgG進(jìn)行Western blotting鑒定。
2結(jié)果
2.1Annexins B2基因的識(shí)別和序列分析該基因全長(zhǎng)922bp，編碼區(qū)為224～686bp。其最大ORF為其完整編碼區(qū)。
2.2原核重組質(zhì)粒的鑒定將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，產(chǎn)物行0.8g/L瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示在500bp左右有一清晰條帶，與目的基因大小基本相符。此外，重組質(zhì)粒的測(cè)序報(bào)告表明插入序列與理論序列一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1)。
2.2蛋白表達(dá)及純化結(jié)果將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL/DE3中，超聲裂解后SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示在大約25ku處出現(xiàn)高效表達(dá)條帶(圖2)，與目的蛋白基本相符。測(cè)得純化產(chǎn)物的蛋白濃度為0.526g/L。
2.3Western blotting鑒定純化蛋白的免疫反應(yīng)性
用感染亞洲帶絳蟲(chóng)、豬帶絳蟲(chóng)、感染牛帶絳蟲(chóng)的患者血清以及亞洲帶絳蟲(chóng)感染豬的血清與純化蛋白反應(yīng)的結(jié)果均顯示出較清晰的條帶，而陰性對(duì)照血清在相應(yīng)位置未識(shí)別出該蛋白條帶(圖3)，表明該表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫反應(yīng)性。圖1重組質(zhì)粒的PCR和雙酶切鑒定 Fig.1 The identification of the pET-28a(+)-Ta Annexins B2 by PCR amplification and digestion with restriction enzymesM1：DNA標(biāo)準(zhǔn)(DL2000);1：PCR產(chǎn)物;2：pET-28a(+)質(zhì)粒雙酶切;3：pET-28a(+)-Annexins B2重組質(zhì)粒雙酶切;M2：DNA標(biāo)準(zhǔn)(DL 15000)。圖2100g/L SDS-PAGE分析pET-28a(+)-Ta Annexins B2在大腸埃希菌中的表達(dá)產(chǎn)物及其純化產(chǎn)物Fig.2 100g/L SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression product and purified product M：蛋白Marker;1：pET-28a(+)IPTG未誘導(dǎo);2：pET-28a(+)IPTG誘導(dǎo);3：pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG未誘導(dǎo);4：pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG誘導(dǎo);5：pET-28a(+)-Annexins B2上清;6：pET-28a(+)-Annexins B2沉淀;7：pET-28a(+)-Annexins B2純化蛋白。
3討論
帶絳蟲(chóng)病的流行在我國(guó)西部一直是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。每年由帶絳蟲(chóng)病造成的健康和畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)損失上百億，嚴(yán)重影響西部欠發(fā)達(dá)地區(qū)的社會(huì)發(fā)展。目前，亞洲帶絳蟲(chóng)病的防治研究的重點(diǎn)集中在診斷和疫苗候選抗原、藥物靶標(biāo)、致病的分子機(jī)制研究。圖3重組蛋白的Western blotting 鑒定Fig.3 Western blotting analysis of the recombinantsM：蛋白Marker;1：純化蛋白與亞洲帶絳蟲(chóng)患者血清的反應(yīng)結(jié)果;2：純化蛋白與牛帶絳蟲(chóng)患者血清的反應(yīng)結(jié)果;3：純化蛋白與豬帶患者血清的反應(yīng)結(jié)果;4：純化蛋白與亞洲帶絳蟲(chóng)感染豬血清的反應(yīng)結(jié)果;5：純化蛋白與正常人血清的反應(yīng)結(jié)果。
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)方法從已經(jīng)構(gòu)建好的亞洲帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA質(zhì)粒文庫(kù)中篩選出了一個(gè)膜聯(lián)蛋白(Annexins B2)的同源基因，并且預(yù)測(cè)出該基因位于胞漿，無(wú)跨膜區(qū)，二級(jí)結(jié)構(gòu)基本上是以α螺旋為主。這些都符合膜聯(lián)蛋白家族的共同特征[4]。根據(jù)膜聯(lián)蛋白家族分布廣泛，表達(dá)豐富且穩(wěn)定的特性，可以推測(cè)其在絳蟲(chóng)的生理活動(dòng)中可能起著重要的作用。
膜聯(lián)蛋白是一個(gè)廣泛存在的蛋白家族，在所有真核基因組中廣泛表達(dá)。具有內(nèi)部重復(fù)單位和“G-X-G-T-(38residues)-D/E”基序[5]，即Ca2+結(jié)合區(qū)域的特征，用以結(jié)合帶有負(fù)電的脂質(zhì)。雖然它為鈣結(jié)合蛋白，但是在結(jié)構(gòu)上卻沒(méi)有EF手，而且在和Ca2+結(jié)合后，還可以與磷脂再次結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。例如，細(xì)胞的胞吞胞吐，離子通道的形成，調(diào)節(jié)磷脂酶A2的活性及細(xì)胞內(nèi)外Ca2+濃度、抗炎癥反應(yīng)等。在長(zhǎng)期的生物進(jìn)化過(guò)程中，膜聯(lián)蛋白家族各成員在生物學(xué)特性和生理功能方面表現(xiàn)出非常復(fù)雜的關(guān)系，且在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，annexins沒(méi)有信號(hào)肽，沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)，是一個(gè)典型的細(xì)胞內(nèi)蛋白。但是，卻有學(xué)者發(fā)現(xiàn)它可以與細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生作用。例如，抗炎[6]、抗凝[7]、抑制腫瘤[8]等。最新的研究報(bào)道，當(dāng)將其作為疫苗的候選因子時(shí)，可以消除一些寄生于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的寄生蟲(chóng)。此外，學(xué)者們認(rèn)為膜聯(lián)蛋白是維持細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的重要蛋白。并可能具有激活纖維蛋白酶原的功能，有助于破壞宿主的結(jié)締組織，使蟲(chóng)體抗原更加容易進(jìn)入宿主機(jī)體，誘發(fā)免疫應(yīng)答。因此，對(duì)該基因的研究有助于進(jìn)一步了解它的生物學(xué)功能及開(kāi)辟預(yù)防治療寄生蟲(chóng)病的新途徑[9-10]。
小編推薦優(yōu)秀醫(yī)學(xué)期刊 山西醫(yī)藥 醫(yī)學(xué)期刊征稿
《山西醫(yī)藥》在“黨的路線方針政策指引下，堅(jiān)持普及與提高相結(jié)合，側(cè)重普及;堅(jiān)持理論與實(shí)用相結(jié)合，注重實(shí)用;堅(jiān)持百花齊放，百家爭(zhēng)鳴，立足山西，面向全國(guó)，為山西能源重化工基地建設(shè)股務(wù)，為全國(guó)股務(wù)”的辦宗旨引導(dǎo)下，為宣傳和政府的科技方針政策，傳遞醫(yī)學(xué)信息，開(kāi)展學(xué)術(shù)交流，促進(jìn)醫(yī)學(xué)科技成果轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力做出了一定的貢獻(xiàn)主要欄目：專(zhuān)論、論著、實(shí)驗(yàn)研究、活血化化瘀、調(diào)查研究、影像診斷、綜述講座、臨床研究。
轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明來(lái)自發(fā)表學(xué)術(shù)論文網(wǎng)：http:///yxlw/3353.html
