對(duì)照提取物用于金銀花藥材的質(zhì)量控制方法

　　本篇中藥材論文通過采用對(duì)照提取物辦法研究金銀花藥材的質(zhì)量控制方法。一般情況下，對(duì)中藥材進(jìn)行多指標(biāo)含量測(cè)定，需要采用純度較高(98%以上)的對(duì)照品，由于對(duì)照品分離純化過程較為復(fù)雜，所以價(jià)格較高，給中藥生產(chǎn)企業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，不利于多批次中藥材的質(zhì)量控制，本文提出的采用對(duì)照提取物作為對(duì)照，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可實(shí)現(xiàn)對(duì)金銀花藥材的多指標(biāo)含量測(cè)定。

　　《天然產(chǎn)物研究與開發(fā)》(月刊)創(chuàng)刊于1989年，是由中國科學(xué)院主管、中國科學(xué)院成都文獻(xiàn)情報(bào)中心主辦的我國最早報(bào)道天然產(chǎn)物研究與開發(fā)的專業(yè)性學(xué)術(shù)刊物。辦刊宗旨：報(bào)道天然產(chǎn)物研究的最新成果，開發(fā)天然產(chǎn)物研究的廣泛用途，促進(jìn)國內(nèi)外學(xué)術(shù)交流，加強(qiáng)科研、開發(fā)、生產(chǎn)的進(jìn)程，傳播具有戰(zhàn)略性、前瞻性和創(chuàng)新性的科技成果，以促進(jìn)我國科技與經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

　　[摘要] 為解決中藥材色譜分析中對(duì)照品價(jià)格較高的問題，該文以金銀花藥材為例，提出采用對(duì)照提取物作為參考物質(zhì)，對(duì)藥材進(jìn)行常規(guī)分析的方法。采用對(duì)照品對(duì)對(duì)照提取物進(jìn)行了標(biāo)定，測(cè)定出其中6種有機(jī)酸類化合物的含量，并考察了對(duì)照提取物的長期穩(wěn)定性。利用對(duì)照提取物配制不同濃度的溶液，建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)11批次金銀花藥材進(jìn)行分析，采用t檢驗(yàn)方法對(duì)分別利用對(duì)照品和對(duì)照提取物測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明二者之間不存在顯著性差異。該方法可用于金銀花藥材的質(zhì)量控制，并對(duì)解決類似問題有借鑒意義。

　　[關(guān)鍵詞] 對(duì)照提取物;金銀花;質(zhì)量控制;有機(jī)酸

　　多指標(biāo)含量測(cè)定及指紋圖譜技術(shù)是對(duì)中藥材進(jìn)行質(zhì)量控制的有效手段，但面臨著對(duì)照品價(jià)格昂貴、不易獲得，從而導(dǎo)致分析成本較高的問題，加之目前藥典中規(guī)定的中藥材含量測(cè)定指標(biāo)較少，中藥生產(chǎn)企業(yè)不愿在中藥原料藥材的多指標(biāo)含量測(cè)定上投入更多資金，限制了該技術(shù)在中藥生產(chǎn)企業(yè)的推廣使用，難以實(shí)現(xiàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高。為解決這一問題，近年來出現(xiàn)了“一測(cè)多評(píng)”的新型中藥材多指標(biāo)含量測(cè)定方法，并被錄入藥典[1]，該技術(shù)不僅在很大程度上解決了上述問題，而且引導(dǎo)了相關(guān)的科研工作者探索新的中藥材質(zhì)量控制方法，采用對(duì)照提取物對(duì)中藥材進(jìn)行多指標(biāo)質(zhì)量控制就是一種新的思路。

　　金銀花Lonicera japonica Thunb.是中醫(yī)臨床常用的藥材，其中的主要化學(xué)成分包括揮發(fā)油、有機(jī)酸類化合物、黃酮類化合物和三萜皂苷類化合物[2-3]。李萍等對(duì)該藥材進(jìn)行了系列研究，從中分離出多種對(duì)照品，并利用分離出的對(duì)照品建立了多個(gè)多指標(biāo)含量測(cè)定方法，用于對(duì)金銀花藥材進(jìn)行質(zhì)量控制[4-7]。藥理實(shí)驗(yàn)表明，有機(jī)酸類化合物是主要的藥效物質(zhì)，主要包括綠原酸(chlorogenic acid， CA)、咖啡酸(caffeic acid， CfA)、新綠原酸(neochlorogenic acid， NCA)以及異綠原酸等，其中異綠原酸是二咖啡�？鼘幩�(dicaffeoylquinic acid， DCA)的一組同分異構(gòu)體，主要包括3，4-二咖啡�？鼘幩�(3，4-DCA)、3，5-二咖啡�？鼘幩�(3，5-DCA)和4，5-二咖啡�？鼘幩�(4，5-DCA)等[8-9]，但以上化合物的純品由于制備困難，所以成本較高，不適于工廠多批次藥材的常規(guī)分析。

　　對(duì)照提取物是指化學(xué)成分及其含量較為明確、穩(wěn)定性較好且純度較高的中藥提取物。其中的化學(xué)成分及其含量已經(jīng)采用對(duì)照品進(jìn)行標(biāo)定，可配制成不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于原料藥材中多種化學(xué)成分的含量測(cè)定[10-11]。本文利用“對(duì)照提取物”作為參考物質(zhì)，對(duì)金銀花藥材進(jìn)行多指標(biāo)含量測(cè)定，效果滿意，進(jìn)一步證實(shí)了該方法用于中藥材質(zhì)量控制具有可行性。

　　1 材料

　　Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司); MILLIPORE超純水器(美國Millipore公司);KQ-250B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);METTLER AE240型1/1萬電子天平(梅特勒-托利多公司);FL-027高速臺(tái)式離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

　　實(shí)驗(yàn)用乙腈、甲酸均為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。CA、CfA對(duì)照品購自中國食品藥品檢定研究院，NCA，3， 4-DCA，3， 5-DCA，4， 5-DCA由本實(shí)驗(yàn)室自制，純度均大于95%(采用色譜峰面積歸一化方法計(jì)算而得)。金銀花對(duì)照提取物樣品由上海凱寶藥業(yè)有限公司提供。金銀花藥材購自亳州中藥材市場(chǎng)，經(jīng)浙江大學(xué)藥學(xué)院陳柳蓉副教授鑒定為忍冬科植物忍冬L. japonica的干燥花蕾。

　　2 方法與結(jié)果

　　2.1 對(duì)照提取物的標(biāo)定 所用的對(duì)照提取物由上海凱寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，為金銀花藥材經(jīng)過煎煮、濃縮、醇沉、萃取等一系列的分離純化步驟后得到，6種目標(biāo)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)加和值在 60%以上。在用其作為標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)之前，先采用作者所在實(shí)驗(yàn)室自建的HPLC進(jìn)行標(biāo)定[12]，該方法采用6種有機(jī)酸對(duì)照品建立工作曲線，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，所用色譜條件如下。Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液(A)，0.1%甲酸-乙腈(B);采用二元梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?～25 min， 8%～8% B;25～30 min， 8%～19%B;30～60 min， 19%B;流速 1 mL·min-1;檢測(cè)波長 280 nm;柱溫 25 ℃;進(jìn)樣量 10 μL。在此色譜條件下，所得混合對(duì)照品和對(duì)照提取物的色譜圖見圖1。

　　對(duì)照提取物中的6種目標(biāo)成分得到了基線分離且峰形良好，可進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。利用DAD檢測(cè)器得到的化合物光譜進(jìn)行各目標(biāo)成分色譜峰的純度分析，NCA，CA，CfA，3，4-DCA，3，5-DCA，4，5-DCA的純度分別為 99.86%，97.89%，98.95%，99.69%，99.29%，98.79%。 對(duì)批號(hào)為081207的提取物進(jìn)行了標(biāo)定，NCA，CA，CfA，3，4-DCA，3，5-DCA，4，5-DCA等6種有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 3.81%，11.29%，20.99%，4.63%，7.04%，17.02%。

　　2.2 對(duì)照提取物穩(wěn)定性考察 采用提取物作為標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)，要求其具有滿意的穩(wěn)定性，能夠在較長的時(shí)間內(nèi)使用，所用的提取物第1次標(biāo)定后密封，置于冰箱內(nèi)冷藏，2年中共進(jìn)行3次標(biāo)定，結(jié)果見表1，RSD均小于3%，表明該提取物在3年內(nèi)具有較為滿意的穩(wěn)定性。

　　2.3 供試品溶液制備 稱取1 g金銀花藥材粉末置于25 mL量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，超聲提取2 h后，重新定容至25 mL，取提取液1 mL，1萬 r·min-1下離心10 min，取10 μL上清液用于HPLC分析，藥材提取液與提取物HPLC分析方法相同。

　　2.4 線性關(guān)系考察 標(biāo)定后的對(duì)照提取物實(shí)際上相當(dāng)于一種“混合對(duì)照品”，可用其配制成一系列不同濃度的溶液，制定工作曲線，擬合出回歸方程，實(shí)現(xiàn)對(duì)藥材樣品的測(cè)定。精密稱取 50 mg對(duì)照提取物，溶解于50%甲醇中，并定容至10 mL，作為儲(chǔ)備液，然后逐級(jí)稀釋，制成不同濃度的溶液，按照2.1項(xiàng)下條件進(jìn)行液相分析，并制定出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，6種有效成分的回歸方程見表2。

　　所建標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)(R2)符合定量分析的要求，可用于供試品中6種有機(jī)酸類化合物的含量測(cè)定。

　　2.5 精密度 日內(nèi)精密度，按照2.3項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，精密量取同1份供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算6種有機(jī)酸的峰面積的RSD，見表3。日間精密度，按照2.3項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，精密量取同1份供試品溶液，6日內(nèi)每日進(jìn)樣1次，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算6種有機(jī)酸的峰面積的RSD，見表3。

　　2.6 穩(wěn)定性 按照2.3項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，分別在0， 2， 4， 8， 16， 24 h精密量取同1份供試品溶液10 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算6種有機(jī)酸的峰面積的RSD，見表3。

　　2.7 重復(fù)性 按照2.3項(xiàng)下供試品制備方法，用同1批次藥材制備6份供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算6種有機(jī)酸的峰面積的RSD，見表3。

　　2.8 加樣回收率 采用加樣回收法，精密稱取已知含量的金銀花藥材1 g，加入5 mg的對(duì)照提取物，按照2.3項(xiàng)下供試品制備方法，制備6份平行供試品溶液。按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算6種有機(jī)酸的回收率，NCA，CA，CfA，3，4-DCA，3，5-DCA，4，5-DCA對(duì)應(yīng)的回收率分別為 99.81%，95.34%，102.9%，100.6%，98.02%，96.79%，RSD分別為 3.0%，2.1%，4.2%，1.8%，2.9%。

　　2.9 金銀花藥材分析結(jié)果 以上結(jié)果表明，利用對(duì)照提取物所建立的分析方法，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率可滿足定量分析的要求，可用于金銀花藥材樣品的定量分析。分別采用對(duì)照品和對(duì)照提取物建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，測(cè)定了購自亳州中藥材市場(chǎng)的11個(gè)批次的金銀花藥材，測(cè)定結(jié)果見表4。

　　采用配對(duì)t檢驗(yàn)的方法對(duì)2種方法測(cè)得的含量進(jìn)行比較，NCA，CA，CfA，3，4-DCA，3，5-DCA，4，5-DCA對(duì)應(yīng)的P分別為 0.180，0.817，0.587，0.329，0.017，0.871，均大于0.05，表明二者之間不存在顯著性差異。采用OriginPro 8統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)2種方法測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，NCA，CA，CfA，3，4-DCA，3，5-DCA，4，5-DCA對(duì)應(yīng)的相關(guān)系數(shù)分別為 0.999 5， 0.999 3， 0.990 9， 0.958 1， 0.999 0， 0.996 1，均在0.95以上。以上結(jié)果表明可采用對(duì)照提取物對(duì)金銀花藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。

　　作者認(rèn)為，符合對(duì)照提取物條件的物質(zhì)必須具備以下3個(gè)條件：一是來源于需要進(jìn)行質(zhì)量控制的藥材，具有較強(qiáng)的針對(duì)性;二是純度較高，可知目標(biāo)成分總量要占較高比例;三是穩(wěn)定性較好，可供長期使用。本文對(duì)這一方法進(jìn)行了初步探索，真正實(shí)現(xiàn)在生產(chǎn)企業(yè)中應(yīng)用還需要相關(guān)工作者進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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