藜麥體外模擬消化過程中酚類物質含量及抗氧化活性的變化

　　摘要對3種品系藜麥(黑藜麥、紅藜麥和黃藜麥)進行體外模擬消化，研究多酚類物質和黃酮類物質及其抗氧化性的變化情況。結果表明：總多酚含量為黑藜麥>紅藜麥>黃藜麥(<0.05>黑藜麥>黃藜麥(<0.05)。經體外模擬消化后，口腔、胃和小腸能顯著促進多酚類物質和黃酮類物質的釋放(<0.05frapabts>小腸>胃>大腸(<0.05)，且藜麥消化液抗氧化性與多酚類和黃酮類物質釋放量呈顯著正相關。經體外消化后藜麥中結合型多酚類化合物(沒食子酸、阿魏酸等)被顯著釋放，表現(xiàn)出較高的生物活性，使藜麥具有較高的營養(yǎng)健康價值。

　　關鍵詞藜麥;體外消化;多酚;黃酮;抗氧化性

　　藜麥原產于南美洲安第斯山區(qū)秘魯和波利亞境內的“喀喀湖”沿岸，為一年生草本植物，其籽粒作為當?shù)鼐用駛鹘y(tǒng)的主食，有著“糧食之母”之稱，目前主要種植在秘魯、智利、厄瓜多爾等高海拔地區(qū)[1]，而我國山西、青海等地也已進行種植推廣[2]。藜麥籽顏色多樣，主要有紅、白、黃、黑等，營養(yǎng)學研究發(fā)現(xiàn)顏色的差異與其內部的營養(yǎng)成分密切相關，即顏色越深其營養(yǎng)價值越高[3-4]。

　　藜麥籽粒中蛋白質、必需氨基酸、膳食纖維、礦物質等營養(yǎng)成分高于一般類谷物[5]，同時富含多酚類化合物和黃酮類等活性物質，其中酚類化合物主要為酚酸(如沒食子酸、阿魏酸)、槲皮素和蘆丁，而常見谷物小麥、燕麥、黑麥中均不含黃酮類化合物[6-8]。多酚類化合物具有提高人體免疫力、抗癌、預防心血管病等功效;黃酮類能夠降血糖、降血脂、抗病毒等，因此藜麥具有較高的營養(yǎng)保健價值[9]�；�于藜麥中多酚類化合物種類多且含量高，大量研究者對藜麥的生物活性進行了測定。Abderrahim等[10]發(fā)現(xiàn)秘魯有色藜麥中總多酚(1.23～3.24mg/g)和總黃酮(0.47～2.55mg/g)含量較高，表現(xiàn)出較強的抗氧化能力(119.8～335.9mmol/kg)。

　　Tang等[11]發(fā)現(xiàn)藜麥中酚類化合物十分豐富，并且深色藜麥種子中酚類物質含量高且具有較強的抗氧化性。盡管目前藜麥被大量的研究證實具有較強的體外抗氧化性等生物活性，還不能因此直接預測其對人體健康的影響。Rein等[12]提出應當對其活性成分的生物可達性進行評估，因為活性成分只有經消化過程中各階段的釋放吸收才能發(fā)揮益處。目前對藜麥的研究多集中在優(yōu)化活性成分的提取及體外生物活性的研究上，對于其體外模擬消化過程中活性物質的變化情況未有詳細報道。本文以黑藜麥、白藜麥以及黃藜麥為研究對象，體外模擬消化研究各消化階段(口腔、胃、小腸和大腸)藜麥消化液中多酚類與黃酮類活性成分的變化情況以及抗氧化活性，探討藜麥對于人體的營養(yǎng)貢獻，為不同品種藜麥加工副產物的綜合利用提供理論依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1材料與試劑

　　1.1.1試驗材料

　　黑藜麥、紅藜麥和黃藜麥：2018年9月采收于西藏自治區(qū)農牧科學院農業(yè)研究所現(xiàn)代農業(yè)示范園區(qū)，品系分別為30號、ZL-06和ZL-05。將藜麥粉碎后過60目篩，分別密封于自封袋中，置干燥箱中備用。

　　1.1.2試劑甲酸、福林-酚試劑、三氯化鋁、三氯化鈣、乙醇、鹽酸、氯化鉀(分析純)，成都市科龍化工試劑廠(分析純);乙腈、甲醇(色譜純)，美國Mreda公司;水溶性VE、胃蛋白酶、α-淀粉酶、胰蛋白酶、膽汁、戊聚糖復合酶，sigma公司;沒食子酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素(純度98%)、2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽、菲洛嗪，北京索萊寶科技有限公司。

　　1.2設備與儀器FW-100高速萬能粉碎機，北京科偉永興儀器有限公司;TD-4Z型臺式低速離心機，四川蜀科儀器有限公司;KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;Gentrifuge5180R型冷凍干燥機，德國Eppendorf公司;SynergyHTX型酶標儀，美國伯騰儀器有限公司;UV-6100型紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司;1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

　　1.3試驗方法

　　1.3.1模擬體外消化試驗

　　體外消化試驗參照Qin等[13]的方法略作修改。稱取2.0g藜麥粉末置于離心管中，加入20mL蒸餾水，用檸檬酸調節(jié)pH值至6.5，加入1mLα-淀粉酶溶液(酶活75U/mL)后置于37℃水浴震蕩10min，8000r/min離心10min，將上清液(S1)倒出，備用。

　　向殘渣中加入20mL蒸餾水，用6mol/LHCl調節(jié)pH值至=2，隨后加入105.6mg胃蛋白酶，置于37℃水浴震蕩2h后8000r/min離心10min，將上清液(S2)倒出，備用。繼續(xù)向殘渣中加入18mL蒸餾水，用2mol/LNaHCO3調節(jié)pH值至7.4，加入1mL胰蛋白酶(10mg/mL)與1mL膽酸鹽溶液(65mg/mL)，置于37℃水浴震蕩2h后8000r/min離心10min，將上清液(S3)倒出，備用。向殘渣中繼續(xù)加入20mL蒸餾水，用6mol/LHCl調節(jié)pH值至=4.0，加入80µL纖維素酶，置37℃水浴震蕩16h后8000r/min離心10min，將上清液(S4)倒出，備用。

　　1.3.2藜麥中多酚和黃酮提取液[14]稱取1g藜麥樣品，加入8mL85%甲醇(含1%甲酸)，40℃超聲提取30min，8000r/min離心15min，倒出上清液，備用。重復提取2次，合并3次提取液，定容25mL。

　　1.3.3總多酚的檢測總多酚測定采用Folin-Ciocalteu法[15]。向20μL藜麥消化液或提取液中加入20μL福林酚試劑，搖勻后靜置5min，加入160μL5%Na2CO3溶液，室溫下避光反應60min，在波長765nm處測定吸光度。總多酚含量以沒食子酸當量計算，單位為mg/g。

　　1.3.4總黃酮的檢測

　　總黃酮采用氯化鋁-亞硝酸鈉比色法[16]測定。向20μL藜麥消化液或提取液中加入80μL蒸餾水和10μL25%NaNO2，反應6min后加入10μL10%AlCl3∙6H2O，反應5min后加入30μL(1mol/L)NaOH和100μL蒸餾水，于波長510nm處測定吸光值。總黃酮含量以兒茶素當量計算，單位為mg/g。

　　1.3.5抗氧化活性分析

　　1)ABTS+清除能力[17]將20µL藜麥消化液用蒸餾水稀釋1倍，加入160µLABTS溶液混勻，避光反應6min，于波長734nm處測定吸光值。以水溶性VE質量濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光值為縱坐標，制作標準曲線，得到回歸方程：=12.895x+0.0363，²=0.998，線性范圍為0.0～19.5µg/mL，測定結果以µg/mL表示。2)FRAP抗氧化能力[18]取30µL藜麥消化液，加入140µL蒸餾水，20µL2.1675mmol/LFeCl2，40µL5mmol/L菲洛嗪水溶液，混合避光反應20min，于波長562nm處測定吸光值。以水溶性VE質量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，制作標準曲線，得到回歸方程：=0.0082x-0.0406，²=0.999，線性范圍為14.15～107.46µg/mL，測定結果以µg/mL表示。

　　1.3.6多酚類化合物的分析[19]

　　將3mL藜麥消化液冷凍干燥后加入1mL甲醇溶解，經0.22µm微孔濾膜過濾后進樣分析。色譜柱：Poroshell120PFP柱(4.6mm×100mm，2.7µm);DAD檢測器，檢測波長：280，320nm和350nm;柱溫：30℃;流量：0.8mL/min;進樣量5L;流動相：0.1%的甲酸水溶液(A)+乙腈(B)。梯度洗脫：0~10min，B5%~10%;10~20min，B10%~20%;20~35min，B20%~40%。

　　標準品溶液制備：將沒食子酸、阿魏酸、蘆丁和槲皮素4個標準品20mg分別用甲醇溶解并定容10mL作為標準品母液。利用梯度稀釋法將母液配制成一系列濃度梯度的標準品溶液，備用。以沒食子酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素質量濃度(µg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。樣品中多酚單體的含量計算公式如下：多酚單體含量(µg/g)=待測液中多酚單體濃度×稀釋倍數(shù)×樣品定容體積/提取質量。

　　1.3.7數(shù)據(jù)分析

　　所有試驗重復3次，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，通過單因素方差分析(ANOVA)進行顯著性分析，P<0.05為差異顯著。

　　2結果與分析

　　2.1總多酚含量的變化

　　藜麥富含多酚類物質和黃酮類物質，其良好的生理功能與之密切有關。利用模擬體外消化模型來評估消化過程中總多酚和總黃酮的釋放情況，能間接反映藜麥的健康效應。顯示體外模擬消化前、后總多酚的釋放量。不同藜麥總多酚釋放量大致具有相同的趨勢，即經4階段消化后，藜麥中總多酚均被顯著釋放，大致為口腔>小腸≥胃>大腸。其中，經口腔消化后，黒藜麥、紅藜麥和黃藜麥總多酚釋放量分別為4.16，3.82mg/g和2.67mg/g�？谇幌�化時間較短，而此階段總多酚的釋放量均較大，這與目前較多研究發(fā)現(xiàn)經口腔消化后僅有小部分多酚類物質被釋放的結論不一致[20-21]。

　　然而，Zheng等[22]同樣發(fā)現(xiàn)山楂中總酚類物質和黃酮類物質在模擬口腔消化過程中釋放量超過65%。這些活性成分釋放量的差異可能是由于生物活性和性質的不同所引起的。隨著消化的繼續(xù)，模擬胃消化后總多酚釋放量分別為1.40，1.01mg/g和0.60mg/g，均顯著低于口腔中的釋放量。在低pH值環(huán)境中和胃蛋白酶的作用下能夠釋放一些與碳水化合物結合的酚類物質，從而使這些活性物質更具生物活性，然而，除黑藜麥外，胃消化后總多酚釋放量均顯著低于小腸釋放量。這樣的結果與Bohn等[23]相似，他們發(fā)現(xiàn)某些酚類物質可能在胃液中損失，導致許多酚類化合物在小腸消化過程中釋放[24]。

　　經大腸消化后，由于大腸中普遍存在的腸道微生物所產生的酶進一步催化多酚類物質釋放[25]，因此仍有少量的多酚類物質被釋放。此外，不同品種藜麥消化略有差異，黑藜麥各消化階段(除大腸消化液外)總多酚釋放量顯著高于黃藜麥和紅藜麥，這是由于不同基因型的藜麥(黑色、紅色和黃色)具有不同形式的酚類化合物，且總多酚含量與種子的顏色有關，即顏色越深，總多酚含量越高且抗氧化活性將更高[11]。

　　2.2總黃酮含量的變化

　　藜麥模擬體外消化過程中總黃酮釋放量的變化趨勢與總多酚相似。黒藜麥、紅藜麥和黃藜麥中總黃酮含量分別為2.61，2.95mg/g和2.08mg/g，模擬消化后總黃酮被顯著釋放，釋放量約為口腔>胃≥小腸≥大腸。經口腔消化后，黒藜麥、紅藜麥和黃藜麥釋放量分別為0.82，0.73mg/g和0.33mg/g，除黃藜麥外，總黃酮的釋放均達到藜麥提取物的30%。此外，僅黒藜麥經胃消化后總黃酮量釋放量顯著高于小腸，其余均無顯著差異，這可能是不同品種藜麥的活性成分的生物活性差異造成的;而小腸消化后總黃酮釋放量降低的原因可能是藜麥中黃酮類化合物在堿性條件下不穩(wěn)定，較容易降解為其它小分子化合物[26]。小腸消化液中總黃酮釋放量與大腸并無顯著差異，而隨著消化的繼續(xù)整體呈下降趨勢，這與Qin等[13]的研究結果一致。

　　2.3抗氧化性的變化

　　為研究藜麥消化過程中可溶性組分的抗氧化能力，建立了2種抗氧化模型，即ABTS+自由基清除和FRAP抗氧化能力進行分析。從圖4A可以看出，不同品種藜麥間抗氧化能力存在一定差異，其中黑藜麥在各消化階段均表現(xiàn)出較高的ABTS+自由基清除能力，其次為黃藜麥。除小腸消化液外，藜麥消化液抗氧化能力表現(xiàn)出減弱的趨勢，其ABTS+自由基的清除能力表現(xiàn)為口腔>小腸>胃>大腸。

　　這與大量體外消化試驗發(fā)現(xiàn)胃和小腸階段抗氧化能力最高的結論相反，而在蘋果或山楂果實的體外消化試驗研究中同樣發(fā)現(xiàn)其抗氧化化合物主要在口腔釋放[22,27]。這可能是因為食物中酚類化合物以不同形式(游離酚或結合酚)存在，而藜麥中游離酚在口腔消化過程中隨即溶出而釋放，結合酚則經酶的作用后釋放，因而口腔具有較高的抗氧化活性[28]。

　　此外，藜麥中豐富的多酚類化合物只有經腸內酶水解才能被消化吸收，這使得小腸消化液同樣表現(xiàn)出較強的抗氧化能力[29]。由于藜麥中80%的多酚類化合物在體外仍具有生物活性[30]，因此藜麥在整個體外消化過程中均表現(xiàn)出較高抗氧化能力。藜麥消化液對FRAP抗氧化能力與ABTS+自由基清除能力大致保持一致。消化液中酚類和黃酮類化合物等物質能螯合機體內金屬離子，抑制自由基酶活性[31]。黑藜麥同樣表現(xiàn)出較高的FRAP抗氧化能力，然而，3種藜麥隨著消化的繼續(xù)，F(xiàn)RAP抗氧化能力均出現(xiàn)減弱的趨勢，即口腔>小腸>胃>大腸�？寡趸�試驗表明藜麥在消化過程中抗氧化活性成分主要在模擬口腔和小腸中釋放，少量在模擬胃和大腸消化過程中釋放;相比之下，水果和多數(shù)谷類中抗氧化功能成分則主要在胃和小腸消化過程中釋放[20,32]。

　　2.4主要酚類化合物含量變化

　　藜麥中酚類化合物種類繁多，為進一步明確具體的酚類化合物在消化過程中含量的變化情況，本研究選取藜麥中具有代表性的4種酚類化合物，即沒食子酸、阿魏酸、蘆丁和槲皮素進行體外消化跟蹤研究。在藜麥提取物中未檢測到沒食子酸、槲皮素，而檢測到較高含量的蘆丁和少量的阿魏酸，這是由于藜麥中多酚類化合物以結合型為主，其常與木質素或多肽等結合，無法通過普通溶劑提取出來，且蘆丁溶于乙醇，因此檢測到較高含量的蘆丁[33]。藜麥經體外模擬消化后，4種酚類化合物均被顯著釋放，釋放量約為口腔>胃>小腸>大腸。

　　4種酚類化合物首先在口腔消化后被顯著釋放，這與總多酚含量變化情況相一致，其中蘆丁釋放量高于沒食子酸、阿魏酸和槲皮素。經胃消化后，沒食子酸、阿魏酸、蘆丁和槲皮素均顯著降低，這與李俶等[34]研究發(fā)現(xiàn)各酚酸類化合物含量在模擬胃液中無顯著變化的結論相反。而Kroon等[35]發(fā)現(xiàn)小麥種子在胃和小腸消化后僅有少量的阿魏酸(2.6%)釋放，這說明不同食品體系中活性成分具有不同的生物特性。藜麥經小腸消化后，沒食子酸和阿魏酸繼續(xù)釋放，而釋放量顯著低于口腔和胃;黃藜麥中槲皮素也被顯著釋放，釋放量達到13.84ug/g，這是由于腸道消化酶能夠促進復雜的食品體系中多酚類化合物從小腸中進一步釋放[36]。

　　消化末期，在大腸消化液中僅檢測到少量的阿魏酸和沒食子酸。大多的研究發(fā)現(xiàn)谷類中結合態(tài)多酚占總多酚的比例超過90%[37]，藜麥中高比例的結合型多酚在體外經酶水解、酸水解等方式破壞酯鍵、醚鍵等得以釋放[33]，使其表現(xiàn)出較高的生物活性(抗氧化性)，因此消化后具有較高的保健價值。

　　食品論文投稿刊物：《食品科學》(FoodScience)創(chuàng)刊于1980年，由中國商業(yè)聯(lián)合會主管，北京市食品研究所主辦，《食品科學》編輯部編輯出版的國內外公開發(fā)行的食品專業(yè)技術性期刊。國際標準刊號：1002-6630，國內統(tǒng)一刊號：11-2206/TS，復合影響因子：1.093，綜合影響因子：0.717，郵發(fā)代號：2-439。

　　3結論

　　3種藜麥富含多酚類物質和黃酮類物質，將其體外消化后顯著釋放出多酚類和黃酮類物質并表現(xiàn)出較高的抗氧化性。3種藜麥經口腔消化后釋放出大量的多酚類物質和黃酮類物質，其次為小腸，在胃和大腸中少量釋放，并且釋放量與藜麥抗氧化性呈顯著正相關。通過對幾類多酚類化合物進行跟蹤，發(fā)現(xiàn)蘆丁在口腔和胃中持續(xù)顯著釋放，沒食子酸在口腔、胃、小腸中持續(xù)釋放，阿魏酸在口腔、胃、小腸和大腸中持續(xù)釋放。不同品系的藜麥中槲皮素釋放量差異較大。綜上所述，體外模擬消化能較好地評價藜麥中活性成分的生物利用度。基于藜麥品系中各活性成分的差異，未來可系統(tǒng)研究不同品系藜麥中多酚化合物及黃酮類物質的代謝路徑及其活性成分多酚單體。

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　　作者：1向卓亞1，鄧俊琳1，陳建1，朱永清1，夏陳1，林長彬1，楊開俊2，劉廷輝

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