針葉樹種再生及遺傳轉(zhuǎn)化研究進展

　　摘要針葉樹種是中國主要用材和綠化樹種，由于針葉樹種基因組復雜且龐大、生長周期長、生根率低、移栽成活率低等諸多因素導致其再生及遺傳改良困難。本文針對目前針葉樹種無性繁殖能力弱，遺傳改良困難等問題，查閱國內(nèi)外文獻，總結(jié)了針葉樹種再生和遺傳轉(zhuǎn)化的研究進展，對影響針葉樹再生和遺傳轉(zhuǎn)化的因素進行討論，以期為針葉樹的苗木培育、遺傳改良和基因工程育種提供參考。

　　關(guān)鍵詞針葉樹種;再生;遺傳轉(zhuǎn)化;研究進展

　　我國針葉樹從南到北分布極廣，占森林資源總面積的50%以上鄭武林,2014)，是裸子植物的2/3(WangandRan,2014)。針葉樹是天然林和人工林建設的重要樹種，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟價值。建立針葉樹種高效、穩(wěn)定的再生體系是針葉樹快速擴繁培育苗木及成功進行遺產(chǎn)轉(zhuǎn)化的前提。本研究對針葉樹再生及遺傳轉(zhuǎn)化研究現(xiàn)狀進行了綜述，以期為針葉樹再生和轉(zhuǎn)化提供高效的技術(shù)和新的研究方向。

　　現(xiàn)有的針葉樹種再生及遺傳轉(zhuǎn)化研究中存在不定芽誘導率低、生根難、移栽成活率低、體胚發(fā)生時間長、畸形率高、發(fā)生不同步與轉(zhuǎn)化體系難建立、對抗生素敏感、難以分化、轉(zhuǎn)化率低等諸多問題。盡管針葉樹種的再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系并不完善，但也有學者嘗試在松科Pinaceae)、柏科Cupressaceae)、杉科Taxodiacea)等幾十種針葉樹種通過體細胞胚胎發(fā)生途徑和農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化成功獲得了轉(zhuǎn)化體系朱彩虹,2011)，為具有特殊優(yōu)良性狀的基因轉(zhuǎn)入針葉樹種提供技術(shù)支持和可能，為針葉樹種的快速繁育、良種選育和抗逆性研究提供了技術(shù)支撐和實踐依據(jù)。針葉樹種離體再生建立植物再生體系主要有兩種途徑，分別是器官發(fā)生和體細胞胚胎發(fā)生。

　　其中器官發(fā)生包括直接和間接發(fā)生鄭武林,2014，直接器官發(fā)生是指直接誘導產(chǎn)生不定芽、不定根的過程;間接器官發(fā)生是指外植體先形成愈傷組織，經(jīng)過愈傷組織再分化成不定芽、不定根的過程。而體細胞胚胎發(fā)生也分為直接途徑和間接途徑，其中外植體經(jīng)過胚性細胞分化之后直接形成胚狀體的過程是直接途徑;先產(chǎn)生愈傷組織，之后在愈傷組織表面分化形成體細胞胚的過程是間接途徑李坤坤和徐昌杰,2017。影響針葉樹種再生的主要因素有培養(yǎng)條件、外植體的選擇與消毒、培養(yǎng)基的類型、植物生長調(diào)節(jié)劑等。

　　1.1外植體的選擇

　　針葉樹種的合子胚未成熟胚,成熟胚、針葉、莖段、愈傷組織胚性,非胚性等均可作為外植體。自Hakman等(1985)首次成功報道挪威云杉Piceaabies體細胞胚胎發(fā)生植株再生以來，在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)，用成熟合子胚或未成熟合子胚進行針葉樹種繁殖是目前最具潛力的手段張宇,2006)。已報道的針葉樹種使用體細胞胚作為外植體的研究較多，劉寶光等(2010)以紅皮云杉Piceakoraiensis的未成熟胚為材料進行不定芽誘導，愈傷組織誘導率可達96.7%。張文泉和閆偉(2013)以樟子松Pinussylvestris成熟胚為外植體，愈傷組織誘導率為91.6%。張建偉等(2014)使用云杉Piceaasperata的未成熟胚為外植體，愈傷組織誘導率100%。

　　高芳等(2017)選擇紅松Pinuskoraiensis完整種仁及不同部位為外植體，進行誘導胚性愈傷組織建立了再生體系，其中未成熟種仁實現(xiàn)體胚發(fā)生與植株再生，植株成活率為46.6%。除了體胚作為外植體以外，也有部分研究通過培養(yǎng)下胚軸、莖段、鱗葉得到了再生植株。謝忠利等(2019)以北美紅杉Sequoiasempervirens帶芽莖段為受體材料，個外植體通過繁芽平均可產(chǎn)生21.5個叢生芽，誘導芽率高達2153.3%。王晨等(2020)采用柳杉Cryptomeriafortunei的莖段為外植體誘導不定芽，有效解決柳杉叢芽分化能力強而芽伸長不足的問題。周成城等(2020)以福建柏Fokienhodginsii的鱗葉和莖段受體材料誘導愈傷組織，試驗顯示，莖段出愈率比鱗葉出愈率低。

　　1.2外植體消毒

　　消毒是再生體系建立的首要步驟，外植體有效消毒是實現(xiàn)后期正常生長及分化的先決條件。根據(jù)外植體選取的不同時間及不同部位，消毒劑的選擇，消毒時間的控制有較大的差異。在目前針葉樹種外植體常用的消毒劑70%～75%乙醇(COH)、升汞(HgCl、次氯酸鈉(NaClO)中，HgCl的消毒效果最佳，NaClO次之。盡管HgCl的消毒效果顯著，考慮到它對人體產(chǎn)生極大的毒性，近年來被嚴格管控使用，而NaClO毒性低于HgCl，被廣泛使用高春智等,2013;費昭雪等,2020)。

　　謝忠利等(2019)在對北美紅杉莖段進行消毒時，對比之后發(fā)現(xiàn)選用75%COH和0.1%HgCl具有較好的消毒效果。此外，殳曉強(2017)先采用70%OH對馬尾松Pinusmassoniana種子消毒1min，再用0.1%HgCl處理10min，消毒效果較好，成活率達90%。在杉木Cunninghamialanceolata針葉消毒中，0.1%HgCl添加30mg/LVc獲得最佳消毒效果魏文桃等,2021)。

　　1.3初代培養(yǎng)

　　選擇合適的培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑對針葉樹種初代培養(yǎng)至關(guān)重要，目前最常用的基本培養(yǎng)基有MS、DCR、LM、1/2LM、SH、LP以及改良MS培養(yǎng)基等李清清等,2012)。研究顯示LM、1/2LM培養(yǎng)基適用于云杉屬植物胚性愈傷及體胚的誘導(Chenetal.,2010;代金玲等,2016)。植物生長調(diào)節(jié)劑使用的細胞分裂素一般選擇芐氨基嘌呤(6BA)、二氯苯氧乙酸(2,4D)、噻苯隆(TDZ)3種，細胞生長素選擇的類型有α萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)等。目前研究者已對BA與NAA兩種植物激素的最適濃度和比例進行了深入研究。祝晨辰等(2015)以柳杉不同無性系當年生莖段為外植體，結(jié)果表明在DCR培養(yǎng)基上添加0.1mg/L6BA和0.05mg/LNAA誘導率最高，達81.7%。

　　王可佳等(2021)嘗試以落葉松Larixolgensis針葉為材料進行再生試驗，以DCR+2mg/LBA+0.2mg/LNAA為不定芽誘導的較佳配方，不定芽誘導率為66.33%，平均芽數(shù)80個外植體，說明以針葉為外植體，也能獲得較高的再生率。鄭武林(2014)以馬尾松下胚軸為外植體，馬尾松下胚軸愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基為DCR+2.0mg/L6BA+0.2mg/LNAA，愈傷組織誘導頻率為98.8%。在部分針葉樹種再生體系中顯示，僅添加BA也可以誘導不定芽發(fā)生，且不定芽系數(shù)達69%(于大德等,2011)，這與唐婷婷015)在馬尾松頂芽誘導不定芽時單獨使用的BA實驗結(jié)果相吻合。

　　此外，適當比例的BA和2,4較易誘導胚性愈傷組織，且和激動素KT組合使用能明顯提高誘導率孫敬爽和賈桂霞,2010;白玉娥等,2015)�？傮w而言，在初代培養(yǎng)中較低濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑對外植體的啟動有較好的響應，細胞分裂素和植物生長素的組合使用比它們分別使用對外植體的誘導效果理想，通常NAA濃度低于BA濃度，在直接誘導不定芽時，BA選擇0.5～2.0mg/L、NAA選擇0.05～0.2mg/L較適宜。在體胚發(fā)生途徑2,4選擇0.5～1.0mg/L、BA選擇0.1～2.0mg/L較適宜。

　　1.4增殖培養(yǎng)

　　在針葉樹種的繼代增殖培養(yǎng)階段，影響叢生芽繼代增殖的關(guān)鍵因素是不同生長調(diào)節(jié)劑的配比，增殖培養(yǎng)使用的生長調(diào)節(jié)劑主要有AA、BA和2,4等，偶爾也使用KT。在GD培養(yǎng)基中，當BA濃度為0.5～2mg/L和NAA濃度為0.5mg/L、2,4濃度為0.5～2mg/L組合使用時，馬尾松嫩莖愈傷組織的增殖能力最強，增殖系數(shù)最大楊模華等,2009)。在MS培養(yǎng)基中，檉柳Tamarixchinensis芽增殖時BA和NAA比值0.1～1.5mg/L時導致產(chǎn)生變態(tài)芽，比值調(diào)為0.2～0.5mg/L時，出芽率明顯變少，MS+6BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L為最佳的繼代增殖組合，增殖率達到100%(魏海霞等,2020)。

　　許建秀等(2017)在對赤松Pinusdensiflora胚性愈傷組織進行試驗中發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用1.0mg/L2,4、1.0mg/L6BA和4.0mg/LNAA，增殖率達215.10%，愈傷組織呈白色透明，有典型絲狀結(jié)構(gòu)，但出現(xiàn)水漬化，而在2.0mg/L6BA和4.0mg/LNAA的組合中，增殖率達211.93%，愈傷組織呈白色透明，有典型絲狀結(jié)構(gòu)，無水漬化現(xiàn)象出現(xiàn)，確定為最佳激素組合。對于針葉樹器官性愈傷組織來說，繼代過程中褐化現(xiàn)象比較嚴重，這可能與細胞在增殖過程中衰老死亡有關(guān)。在濕地松愈傷組織增殖過程中添加抗氧化劑PVP或Vc均未能有效的抑制褐化，為此在今后的研究中，應探索適宜的抗氧化劑以降低組織褐化現(xiàn)象吳麗君,2008)。

　　1.5生根培養(yǎng)

　　對于針葉樹種來說，雖在初代培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)階段能獲得無菌苗，但是多數(shù)無菌苗仍存在生根率低、不定根數(shù)少和移栽成活率低等問題。目前針葉樹生根多以WPM、DCR或1/2BM作為基本培養(yǎng)基張莉,016;謝忠利等,019;王晨等,2020;周小雪等,020)，其最終生根率約為20%～90%。

　　這些結(jié)果說明，在生根培養(yǎng)階段，培養(yǎng)基的無機鹽質(zhì)量濃度降低能有效提高根系的生長�，F(xiàn)階段針葉樹生根培養(yǎng)所使用的主流植物激素有IBA、NAA和IAA，研究表明蔣時姣等,014)，一定濃度的IBA和NAA或IAA配合使用，誘導生根效果較好，但也有研究顯示劉寶光等,010;李哲馨等2017;王晨等,020)，培養(yǎng)基中僅添加IBA或IAA時也能誘導根的形成且存活率較高。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加0.05%活性炭(AC)會提高墨西哥落羽杉Taxodiummucronatum不定根的誘導率許秀玉等2007)，這種結(jié)果可能是由于活性炭在吸附培養(yǎng)基有害物質(zhì)的過程中為根的形成提供了黑暗的生長環(huán)境有關(guān)。

　　2針葉樹種遺傳轉(zhuǎn)化

　　由于針葉樹種再生體系的建立存在一定難度，因此其遺傳轉(zhuǎn)化體系起步也較晚，但近年來得到的相應科研成果也很多。早在1976年，DeCleene和DeLey首次報道根癌農(nóng)桿菌菌株BB6(LMG187)也能感染裸子植物受傷組織并產(chǎn)生冠癭瘤后，關(guān)于針葉樹種遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究有了很好的開展張利,2012)。

　　1991年，美國學者Huang等(1991)以農(nóng)桿菌介導的方法將11325菌株在歐洲落葉松Larixdecidua中有效表達，首次建立了歐洲落葉松的遺傳轉(zhuǎn)化體系。目前針葉樹種遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)研究在國內(nèi)外均有報道，主要為培育抗病蟲害新品種、選育優(yōu)良種質(zhì)、提高樹種品質(zhì)等幾個方面BishopHurleyetal.,2001;Pavingerováetal.,2011;řízaetal.,2013;Maetal.,2020)。目前，農(nóng)桿菌介導法在針葉樹種遺傳轉(zhuǎn)化過程中廣泛使用。

　　農(nóng)桿菌的類型有發(fā)根農(nóng)桿菌Agrobacteriumrhizogenes和根癌農(nóng)桿菌Agrobacteriumtumefaciens兩種，均可將外源基因?qū)�入植物細胞。發(fā)根農(nóng)桿菌含Ri質(zhì)粒，可以誘導被侵染的植物細胞形成發(fā)狀根;根癌農(nóng)桿菌含Ti質(zhì)粒，可以誘導被侵染的植物細胞長成腫瘤。農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化由于效率高、可重復性好而成為植物中最常規(guī)、最廣泛的遺傳轉(zhuǎn)化途徑王亮,2015;王棟鑫等,2018。

　　3展望

　　2000年以來，在松科類樹種中，針葉樹種再生及轉(zhuǎn)基因研究取得了顯著的成果。但總體而言，但總體而言，擁有穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系的樹種不多，且轉(zhuǎn)化效率不高，有很多針葉樹種的再生仍存在些許問題，問題如下：(1)再生體系建立方面，外植體褐化不能伸長或發(fā)生壞死，污染率高，增殖率低Sarmast,2016)形態(tài)變異，玻璃化，生根、再生率低;(2)針葉樹種體細胞無性系變異難，降低生物多樣性;(3)常規(guī)育種與分子育種之間結(jié)合不緊密，系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植株推廣及應用成果不多，應對獲得的轉(zhuǎn)基因株系生長、生理指標、生化指標、抗性、木材性狀等多性狀進行綜合評價潘艷艷等,2016)。今后的工作需要重點對以上問題進行研究并逐步攻克。

　　樹種論文范例： 果樹種植病蟲害防治中存在的問題及解決對策

　　(1)建立高效穩(wěn)定的針葉樹種再生體系并廣泛應用于遺傳轉(zhuǎn)化，從而為針葉樹種基因功能研究和分子育種研究等基礎(chǔ)工作提供有力的技術(shù)平臺;(2)借助高通量測序和生物信息學，包括蛋白互作、代謝通路等新技術(shù)，挖掘針葉樹種中優(yōu)良基因，為培育抗性能力強、速生、高產(chǎn)新品種奠定基礎(chǔ)，以便加快對針葉樹種分子生物學研究的進程;(3)將分子生物學技術(shù)與傳統(tǒng)育種方法有效結(jié)合，Sarmast(2016)再加上利用其他前沿方法，獲得轉(zhuǎn)基因針葉樹種，如基因編輯技術(shù)，其應用仍具有很大的發(fā)展空間。

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　　作者：1哈斯圖雅代金玲吉仁花白玉娥

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