超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定小麥粉及面粉中次磷酸鹽

　　摘要：采用高分辨質(zhì)譜儀(TOF-MS/MS)及超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀建立了小麥粉及面粉中次磷酸鹽的定性及定量的檢測(cè)方法。樣品經(jīng)水提取后，加入甲醇萃取凈化方法，提取液離心，直接過濾后，進(jìn)樣測(cè)定，WatersIC-PakTMAnionHR(4.6×75mm)色譜柱進(jìn)行分離，乙腈：65mmol/L甲酸銨水溶液=70∶30為流動(dòng)相等度洗脫，電噴霧負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描(MRM)模式下進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量。次磷酸鹽的線性范圍0.02～2.00μg/mL，相關(guān)系數(shù)(r2)0.9910～0.9993之間，定量限為0.2mg/kg，于1倍定量限(0.2mg/kg)、2倍定量限(0.4mg/kg)、10倍定量限(2mg/kg)3個(gè)添加水平下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，次磷酸鹽平均回收率在79.60%～98.55%之間，相對(duì)偏差在1.62%～4.00%之間。結(jié)論：該方法操作方便、簡(jiǎn)單、快捷、清潔、靈敏度高、重復(fù)性好，解決了次磷酸鹽在食品中無相關(guān)液相質(zhì)譜檢測(cè)方法的問題，可為小麥粉及面粉中次磷酸鹽的檢測(cè)提供更方便、更快捷的檢測(cè)方法支持。

　　關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;高分辨質(zhì)譜儀(TOF-MS/MS);次磷酸鹽;方法支持

　　次磷酸鹽有次磷酸鈉、次磷酸鈣、次磷酸銨、次磷酸鎳、次磷酸鈷、次磷酸鐵等。其中次磷酸鈉、次磷酸鈣、次磷酸銨使用較多[1]。次磷酸鈉是一種理想的還原劑，主要用于化學(xué)鍍、電鍍、有機(jī)合成工業(yè)，也可用于食品添加劑和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)劑、制造醫(yī)藥品[2]。目前，次磷酸鹽主要應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，國內(nèi)外研究主要集中于次磷酸鹽的生產(chǎn)監(jiān)測(cè)[3-4]。我國是世界上最大的小麥生產(chǎn)國，面粉是面制品加工最重要原料，其質(zhì)量的好壞直接影響到面制品的質(zhì)量。我國關(guān)于食品添加劑的安全衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB2760-2014，該標(biāo)準(zhǔn)提出了可用于食品生產(chǎn)的添加劑，并規(guī)定限量。

　　次磷酸鈉等次磷酸鹽并未列入該標(biāo)準(zhǔn)中，市場(chǎng)上銷售的次磷酸鹽主要以次磷酸鈉和次磷酸鈣為主，我國國家食品藥品監(jiān)督管理局關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)小麥粉質(zhì)量安全監(jiān)管的公告(2017年第132號(hào))中提出嚴(yán)禁生產(chǎn)企業(yè)在小麥粉中添加過氧化苯甲酰、次磷酸鈉、硫脲、間苯二酚、過硫酸鹽、噻二唑、曲酸等非食品原料。然而我國目前還沒有食品中次磷酸鹽快速測(cè)定的方法，次磷酸鈉的分析測(cè)定方法只有離子交換色譜法，這些方法耗時(shí)長(zhǎng)，不利于快速測(cè)定，也不能滿足小麥粉及面粉質(zhì)量的監(jiān)測(cè)。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，操作簡(jiǎn)便，常用于非法添加的化合物測(cè)定。因此開發(fā)出小麥粉及面粉中次磷酸鹽的含量的測(cè)定方法，可為監(jiān)管部門監(jiān)管面粉生產(chǎn)和加工生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

　　1材料與方法

　　1.1材料與試劑

　　次磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品：采用具有證書的標(biāo)準(zhǔn)品或高純?cè)噭�，純�?gt;99%，英文名稱：Sodiumhypophosphitemonohydrate;CAS號(hào)：10039-56-2;分子式：H2NaO2P·H2O，相對(duì)分子量：105.99;乙腈(CH3CN)、甲醇(CH3OH)均為色譜級(jí)，購自美國Fisher公司;甲酸銨(HCOONH4)為色譜級(jí)，購自麥克林公司;微孔濾膜：0.22µm，有機(jī)系;水為GB/T6682中規(guī)定的水。

　　1.2儀器與設(shè)備

　　ABSciex4500超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國應(yīng)用生物公司);Talboys渦旋儀;Elma超聲儀;Milli-Q超純水儀;XS204電子天平(感量0.0001g，梅特勒-托利多國際貿(mào)易上海有限公司);ME2002E電子天平(感量0.01g梅特勒-托利多國際貿(mào)易上海有限公司);AllegraX-15R離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特有限公司)。

　　1.3方法

　　1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

　　標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品，折算成H2PO2-20.0mg(精確至0.0001g)，置于10mL容量瓶中，用水溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為2mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃保存，有效期1個(gè)月。標(biāo)準(zhǔn)中間液：準(zhǔn)確移取100μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.3.1)，置于100mL容量瓶中，用水溶稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為2μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，4℃保存，有效期1個(gè)月。標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)中間液適量，用水稀釋，系列標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度依次為：0.00μg/mL、0.02μg/mL、0.04μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.30μg/mL、0.40μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

　　1.3.2樣品前處理

　　準(zhǔn)確稱取1g(精確至0.01g)試樣，置于10mL容量瓶中，準(zhǔn)確加入3mL水，渦旋1min后超聲15min，取出，放至室溫，用甲醇定容至刻度，渦旋1min后超聲15min，取出，放至室溫，用甲醇補(bǔ)足至刻度，提取液轉(zhuǎn)移至15mL聚四氟乙烯離心管中，于離心機(jī)上以4000r/min的速率離心5min，取上清液，經(jīng)0.22µm濾膜過濾后供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

　　1.3.3色譜條件

　　1.3.3.1液相色譜條件

　　a)色譜柱：WatersIC-PakTMAnionHR(4.6×75mm)色譜柱;b)流動(dòng)相：乙腈：65mmol/L甲酸銨水溶液=70∶30;c)流速：0.7mL/min;d)柱溫：35℃;e)進(jìn)樣量：5μL。1.3.3.2質(zhì)譜條件a)離子源：電噴霧離子源(ESI源);b)檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);c)掃描方式：負(fù)離子模式;d)電噴霧電壓：-4500V;e)離子源溫度：600℃;f)監(jiān)測(cè)離子對(duì)和定量離子對(duì)為64.9/62.9;去簇電壓(DP)：-80V、碰撞能量(CE)：-30V。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1提取溶液的選擇

　　次磷酸鈉是一種無機(jī)鹽，極易溶于水，在參考氯酸鹽和高氯酸鹽測(cè)定補(bǔ)充檢驗(yàn)方法及其它文獻(xiàn)中提取溶劑的基礎(chǔ)上，本研究比較考察了①水∶甲醇=3∶7;②水∶乙腈=3∶7;③水∶甲醇=3∶7(含1%甲酸);④水∶無水乙醇=3∶7;⑤純水;⑥水∶甲醇=9∶1;⑦水∶甲醇=7∶3;⑧水∶甲醇=5∶5;⑨純甲醇，9種提取溶液，以次磷酸鹽加標(biāo)回收率為指標(biāo)，選擇最佳提取液。

　　其中水和甲醇的比例與水和乙腈的比例相同情況下提取時(shí)，次磷酸鹽的回收率相差不大，但甲醇相對(duì)比較經(jīng)濟(jì)且毒性低，最后選擇有機(jī)相為甲醇;水∶無水乙醇=3∶7條件下提取時(shí)，次磷酸鹽的回收率偏高，超過130%，可能無水乙醇溶解性較強(qiáng)，提取了更多的雜質(zhì)，基質(zhì)增強(qiáng)，使得回收率偏高;隨著提取液中有機(jī)相(甲醇)的比例提高，次磷酸鹽的回收率變化無規(guī)律，雖然用純水提取時(shí)回收率在85%左右，但提取時(shí)，提取液高速離心后仍較渾濁，不易過濾膜，最后舍棄;最后確定最佳提取液比例為水∶甲醇=3∶7。

　　2.2提取方式的選擇

　　在提取時(shí)，也比較了2種提取方式，方式一：先加入3mL水超聲15min后再加入7mL甲醇，再超聲15min，混勻，離心;方式二：直接加入混合好的水∶甲醇=3∶7溶液，超聲15min提取，混勻，離心。同樣以次磷酸鹽的回收率為考察指標(biāo)，結(jié)果表明在提取液最后甲醇含量相同的條件下，分開加入水和甲醇和直接加入混合好的溶液提取，目標(biāo)化合物的回收率方式一比方式二高，這可能是由于次磷酸鹽在水中的溶解性比甲醇中好。因此，確定先加入3mL水超聲提取，再加入7mL甲醇超聲，混勻，離心。

　　2.3樣品凈化方式的選擇

　　參照文獻(xiàn)中一些無機(jī)鹽的檢測(cè)，樣品前處理多采用固相萃取技術(shù)進(jìn)行凈化。次磷酸鹽極易溶于水且及性較強(qiáng)，而小麥粉中含有一些其他的非極性的雜質(zhì)，只能通過萃取柱吸附雜質(zhì)的方式來凈化樣品，最后選擇C18萃取柱、氧化鋁萃取柱、PRIMEHLB萃取柱進(jìn)行考察。由于提取溶液中有機(jī)相比例較高，當(dāng)上樣液上完后，無需淋洗步驟，直接棄去流出液約1mL，續(xù)濾液直接過有機(jī)膜上機(jī)測(cè)定。

　　以目標(biāo)化合物的回收率為指標(biāo)，結(jié)果表明，樣品經(jīng)過三種萃取柱凈化后目標(biāo)化合物的回收率與未經(jīng)萃取柱凈化直接過膜上機(jī)的凈化方式的回收率相差不大，均在90%左右。后考慮到固相萃取小柱成本較高，操作過程繁瑣，對(duì)于某些提取液較渾濁的樣品，過柱速度慢，且易發(fā)生小柱堵塞的現(xiàn)象，從而影響回收率以及方法的重現(xiàn)性，本文采用提取溶液對(duì)樣品直接提取。

　　2.4色譜條件的優(yōu)化

　　2.4.1色譜柱的選擇

　　次磷酸鹽是一種含有強(qiáng)陰離子次磷酸根(H2P02-)的鹽類，常規(guī)高效液相色譜柱不適用于分析次磷酸根離子，需選擇特殊的陰離子交換色譜柱。WatersIC-PakTMAnionHR(4.6×75mm)柱是由陰離子交換填料組成，提供高分離度，高靈敏度的陰離子分析。因此選擇專一性較強(qiáng)的WatersIC-PakTMAnionHR色譜柱來進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)。

　　2.4.2流動(dòng)相的選擇

　　根據(jù)次磷酸鹽的化學(xué)性質(zhì)，及WatersICPakTMAnionHR色譜柱的特性，在分析實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要在流動(dòng)相中加入揮發(fā)性鹽，才能保證次磷酸鹽有良好的峰形和適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間。因此考慮了兩種常用的揮發(fā)性鹽甲酸銨和乙酸銨，分別考察了20mmol/L的甲酸銨水溶液、65mmol/L的甲酸銨水溶液、100mmol/L的甲酸銨水溶液;20mmol/L的乙酸銨水溶液、65mmol/L的乙酸銨水溶液、100mmol/L的乙酸銨水溶液，甲酸銨和乙酸銨在濃度相同及流動(dòng)相比例相同的情況下，次磷酸鹽出峰時(shí)間及色譜峰形無明顯差別，而根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，甲酸銨比較常用于質(zhì)譜，最后選擇甲酸銨。

　　隨著甲酸銨濃度的增加，次磷酸鹽的保留時(shí)間會(huì)提前并且峰形會(huì)變窄更易積分，但當(dāng)甲酸銨為100mmol/L，鹽濃度較高，且流動(dòng)相中乙腈的比例也較高，在大量分析樣品時(shí)，鹽容易在色譜柱上析出，堵住色譜柱，使用不當(dāng)，甚至堵住質(zhì)譜，因此，處于安全及延長(zhǎng)色譜柱壽命，最后選擇甲酸銨濃度為65mmol/L。WatersIC-PakTMAnionHR(4.6×75mm)色譜柱粒徑為6μm，需要高流速才能提高柱效，流速過高，出峰時(shí)間過早，且色譜柱壓較高，同時(shí)質(zhì)譜部分允許最大流速為1mL/min，高流速需要更高的霧化氣和更高的霧化溫度，最后通過實(shí)驗(yàn)，0.7mL/min，滿足分析要求，因此最后確定流速為0.7mL/min。

　　3結(jié)論

　　加強(qiáng)小麥粉及面粉中次磷酸鹽的非法添加的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)，對(duì)保障食品安全，促進(jìn)國民健康及社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展都具有重大意義。目前，雖然國內(nèi)對(duì)小麥粉中次磷酸鹽的添加情況進(jìn)行了明確的規(guī)定：嚴(yán)禁小麥粉中添加次磷酸鹽等非食用物質(zhì)，但缺少及相關(guān)技術(shù)方法支撐。本方法采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定小麥粉中的次磷酸鹽。選擇直接提取處理步驟，使得實(shí)驗(yàn)操作更加綠色環(huán)保、簡(jiǎn)便快捷。通過優(yōu)化液相及質(zhì)譜條件，建立了快速、高效檢測(cè)小麥粉中次磷酸鹽的方法，該方法操作方便、簡(jiǎn)單、快捷、清潔、靈敏度高、重復(fù)性好，可在大多數(shù)分析實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用，同時(shí)，也為食品安全監(jiān)管提供了有利的技術(shù)支撐。

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　　化工論文投稿刊物：《化工技術(shù)與開發(fā)》(月刊)創(chuàng)刊于1972年，由廣西化工研究院主辦。是面向石油化工行業(yè)科技、技術(shù)工作者的省級(jí)技術(shù)刊物。旨在推廣石油化工行業(yè)生產(chǎn)新技術(shù)、科技新理念，交流生產(chǎn)新經(jīng)驗(yàn)，為廣大科研工作者和一線生產(chǎn)人員提供技術(shù)交流平臺(tái)，推動(dòng)石油化工行業(yè)技術(shù)進(jìn)步。

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