超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定小麥粉及面粉中次磷酸鹽

　　摘要：采用高分辨質譜儀(TOF-MS/MS)及超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀建立了小麥粉及面粉中次磷酸鹽的定性及定量的檢測方法。樣品經水提取后，加入甲醇萃取凈化方法，提取液離心，直接過濾后，進樣測定，WatersIC-PakTMAnionHR(4.6×75mm)色譜柱進行分離，乙腈：65mmol/L甲酸銨水溶液=70∶30為流動相等度洗脫，電噴霧負離子多反應監(jiān)測掃描(MRM)模式下進行測定，外標法定量。次磷酸鹽的線性范圍0.02～2.00μg/mL，相關系數(shù)(r2)0.9910～0.9993之間，定量限為0.2mg/kg，于1倍定量限(0.2mg/kg)、2倍定量限(0.4mg/kg)、10倍定量限(2mg/kg)3個添加水平下進行加標回收試驗，次磷酸鹽平均回收率在79.60%～98.55%之間，相對偏差在1.62%～4.00%之間。結論：該方法操作方便、簡單、快捷、清潔、靈敏度高、重復性好，解決了次磷酸鹽在食品中無相關液相質譜檢測方法的問題，可為小麥粉及面粉中次磷酸鹽的檢測提供更方便、更快捷的檢測方法支持。

　　關鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質譜;高分辨質譜儀(TOF-MS/MS);次磷酸鹽;方法支持

　　次磷酸鹽有次磷酸鈉、次磷酸鈣、次磷酸銨、次磷酸鎳、次磷酸鈷、次磷酸鐵等。其中次磷酸鈉、次磷酸鈣、次磷酸銨使用較多[1]。次磷酸鈉是一種理想的還原劑，主要用于化學鍍、電鍍、有機合成工業(yè)，也可用于食品添加劑和動物營養(yǎng)劑、制造醫(yī)藥品[2]。目前，次磷酸鹽主要應用于工業(yè)生產，國內外研究主要集中于次磷酸鹽的生產監(jiān)測[3-4]。我國是世界上最大的小麥生產國，面粉是面制品加工最重要原料，其質量的好壞直接影響到面制品的質量。我國關于食品添加劑的安全衛(wèi)生標準GB2760-2014，該標準提出了可用于食品生產的添加劑，并規(guī)定限量。

　　次磷酸鈉等次磷酸鹽并未列入該標準中，市場上銷售的次磷酸鹽主要以次磷酸鈉和次磷酸鈣為主，我國國家食品藥品監(jiān)督管理局關于進一步加強小麥粉質量安全監(jiān)管的公告(2017年第132號)中提出嚴禁生產企業(yè)在小麥粉中添加過氧化苯甲酰、次磷酸鈉、硫脲、間苯二酚、過硫酸鹽、噻二唑、曲酸等非食品原料。然而我國目前還沒有食品中次磷酸鹽快速測定的方法，次磷酸鈉的分析測定方法只有離子交換色譜法，這些方法耗時長，不利于快速測定，也不能滿足小麥粉及面粉質量的監(jiān)測。超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法，操作簡便，常用于非法添加的化合物測定。因此開發(fā)出小麥粉及面粉中次磷酸鹽的含量的測定方法，可為監(jiān)管部門監(jiān)管面粉生產和加工生產提供技術支撐。

　　1材料與方法

　　1.1材料與試劑

　　次磷酸鈉標準品：采用具有證書的標準品或高純試劑，純度>99%，英文名稱：Sodiumhypophosphitemonohydrate;CAS號：10039-56-2;分子式：H2NaO2P·H2O，相對分子量：105.99;乙腈(CH3CN)、甲醇(CH3OH)均為色譜級，購自美國Fisher公司;甲酸銨(HCOONH4)為色譜級，購自麥克林公司;微孔濾膜：0.22µm，有機系;水為GB/T6682中規(guī)定的水。

　　1.2儀器與設備

　　ABSciex4500超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀(美國應用生物公司);Talboys渦旋儀;Elma超聲儀;Milli-Q超純水儀;XS204電子天平(感量0.0001g，梅特勒-托利多國際貿易上海有限公司);ME2002E電子天平(感量0.01g梅特勒-托利多國際貿易上海有限公司);AllegraX-15R離心機(美國貝克曼庫爾特有限公司)。

　　1.3方法

　　1.3.1標準溶液的配制

　　標準儲備液：準確稱取標準品，折算成H2PO2-20.0mg(精確至0.0001g)，置于10mL容量瓶中，用水溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為2mg/mL標準儲備液，4℃保存，有效期1個月。標準中間液：準確移取100μL標準儲備液(1.3.1)，置于100mL容量瓶中，用水溶稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為2μg/mL的標準中間液，4℃保存，有效期1個月。標準工作液：準確吸取標準中間液適量，用水稀釋，系列標準工作液濃度依次為：0.00μg/mL、0.02μg/mL、0.04μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.30μg/mL、0.40μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

　　1.3.2樣品前處理

　　準確稱取1g(精確至0.01g)試樣，置于10mL容量瓶中，準確加入3mL水，渦旋1min后超聲15min，取出，放至室溫，用甲醇定容至刻度，渦旋1min后超聲15min，取出，放至室溫，用甲醇補足至刻度，提取液轉移至15mL聚四氟乙烯離心管中，于離心機上以4000r/min的速率離心5min，取上清液，經0.22µm濾膜過濾后供高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定。

　　1.3.3色譜條件

　　1.3.3.1液相色譜條件

　　a)色譜柱：WatersIC-PakTMAnionHR(4.6×75mm)色譜柱;b)流動相：乙腈：65mmol/L甲酸銨水溶液=70∶30;c)流速：0.7mL/min;d)柱溫：35℃;e)進樣量：5μL。1.3.3.2質譜條件a)離子源：電噴霧離子源(ESI源);b)檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM);c)掃描方式：負離子模式;d)電噴霧電壓：-4500V;e)離子源溫度：600℃;f)監(jiān)測離子對和定量離子對為64.9/62.9;去簇電壓(DP)：-80V、碰撞能量(CE)：-30V。

　　2結果與分析

　　2.1提取溶液的選擇

　　次磷酸鈉是一種無機鹽，極易溶于水，在參考氯酸鹽和高氯酸鹽測定補充檢驗方法及其它文獻中提取溶劑的基礎上，本研究比較考察了①水∶甲醇=3∶7;②水∶乙腈=3∶7;③水∶甲醇=3∶7(含1%甲酸);④水∶無水乙醇=3∶7;⑤純水;⑥水∶甲醇=9∶1;⑦水∶甲醇=7∶3;⑧水∶甲醇=5∶5;⑨純甲醇，9種提取溶液，以次磷酸鹽加標回收率為指標，選擇最佳提取液。

　　其中水和甲醇的比例與水和乙腈的比例相同情況下提取時，次磷酸鹽的回收率相差不大，但甲醇相對比較經濟且毒性低，最后選擇有機相為甲醇;水∶無水乙醇=3∶7條件下提取時，次磷酸鹽的回收率偏高，超過130%，可能無水乙醇溶解性較強，提取了更多的雜質，基質增強，使得回收率偏高;隨著提取液中有機相(甲醇)的比例提高，次磷酸鹽的回收率變化無規(guī)律，雖然用純水提取時回收率在85%左右，但提取時，提取液高速離心后仍較渾濁，不易過濾膜，最后舍棄;最后確定最佳提取液比例為水∶甲醇=3∶7。

　　2.2提取方式的選擇

　　在提取時，也比較了2種提取方式，方式一：先加入3mL水超聲15min后再加入7mL甲醇，再超聲15min，混勻，離心;方式二：直接加入混合好的水∶甲醇=3∶7溶液，超聲15min提取，混勻，離心。同樣以次磷酸鹽的回收率為考察指標，結果表明在提取液最后甲醇含量相同的條件下，分開加入水和甲醇和直接加入混合好的溶液提取，目標化合物的回收率方式一比方式二高，這可能是由于次磷酸鹽在水中的溶解性比甲醇中好。因此，確定先加入3mL水超聲提取，再加入7mL甲醇超聲，混勻，離心。

　　2.3樣品凈化方式的選擇

　　參照文獻中一些無機鹽的檢測，樣品前處理多采用固相萃取技術進行凈化。次磷酸鹽極易溶于水且及性較強，而小麥粉中含有一些其他的非極性的雜質，只能通過萃取柱吸附雜質的方式來凈化樣品，最后選擇C18萃取柱、氧化鋁萃取柱、PRIMEHLB萃取柱進行考察。由于提取溶液中有機相比例較高，當上樣液上完后，無需淋洗步驟，直接棄去流出液約1mL，續(xù)濾液直接過有機膜上機測定。

　　以目標化合物的回收率為指標，結果表明，樣品經過三種萃取柱凈化后目標化合物的回收率與未經萃取柱凈化直接過膜上機的凈化方式的回收率相差不大，均在90%左右。后考慮到固相萃取小柱成本較高，操作過程繁瑣，對于某些提取液較渾濁的樣品，過柱速度慢，且易發(fā)生小柱堵塞的現(xiàn)象，從而影響回收率以及方法的重現(xiàn)性，本文采用提取溶液對樣品直接提取。

　　2.4色譜條件的優(yōu)化

　　2.4.1色譜柱的選擇

　　次磷酸鹽是一種含有強陰離子次磷酸根(H2P02-)的鹽類，常規(guī)高效液相色譜柱不適用于分析次磷酸根離子，需選擇特殊的陰離子交換色譜柱。WatersIC-PakTMAnionHR(4.6×75mm)柱是由陰離子交換填料組成，提供高分離度，高靈敏度的陰離子分析。因此選擇專一性較強的WatersIC-PakTMAnionHR色譜柱來進行分析實驗。

　　2.4.2流動相的選擇

　　根據(jù)次磷酸鹽的化學性質，及WatersICPakTMAnionHR色譜柱的特性，在分析實驗時，需要在流動相中加入揮發(fā)性鹽，才能保證次磷酸鹽有良好的峰形和適當?shù)谋Ａ魰r間。因此考慮了兩種常用的揮發(fā)性鹽甲酸銨和乙酸銨，分別考察了20mmol/L的甲酸銨水溶液、65mmol/L的甲酸銨水溶液、100mmol/L的甲酸銨水溶液;20mmol/L的乙酸銨水溶液、65mmol/L的乙酸銨水溶液、100mmol/L的乙酸銨水溶液，甲酸銨和乙酸銨在濃度相同及流動相比例相同的情況下，次磷酸鹽出峰時間及色譜峰形無明顯差別，而根據(jù)本實驗室實際情況，甲酸銨比較常用于質譜，最后選擇甲酸銨。

　　隨著甲酸銨濃度的增加，次磷酸鹽的保留時間會提前并且峰形會變窄更易積分，但當甲酸銨為100mmol/L，鹽濃度較高，且流動相中乙腈的比例也較高，在大量分析樣品時，鹽容易在色譜柱上析出，堵住色譜柱，使用不當，甚至堵住質譜，因此，處于安全及延長色譜柱壽命，最后選擇甲酸銨濃度為65mmol/L。WatersIC-PakTMAnionHR(4.6×75mm)色譜柱粒徑為6μm，需要高流速才能提高柱效，流速過高，出峰時間過早，且色譜柱壓較高，同時質譜部分允許最大流速為1mL/min，高流速需要更高的霧化氣和更高的霧化溫度，最后通過實驗，0.7mL/min，滿足分析要求，因此最后確定流速為0.7mL/min。

　　3結論

　　加強小麥粉及面粉中次磷酸鹽的非法添加的風險監(jiān)測，對保障食品安全，促進國民健康及社會經濟發(fā)展都具有重大意義。目前，雖然國內對小麥粉中次磷酸鹽的添加情況進行了明確的規(guī)定：嚴禁小麥粉中添加次磷酸鹽等非食用物質，但缺少及相關技術方法支撐。本方法采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定小麥粉中的次磷酸鹽。選擇直接提取處理步驟，使得實驗操作更加綠色環(huán)保、簡便快捷。通過優(yōu)化液相及質譜條件，建立了快速、高效檢測小麥粉中次磷酸鹽的方法，該方法操作方便、簡單、快捷、清潔、靈敏度高、重復性好，可在大多數(shù)分析實驗室推廣應用，同時，也為食品安全監(jiān)管提供了有利的技術支撐。

　　參考文獻：

　　[1]周海，廖艷芳，莫友彬.次磷酸鈉及其相關物質的離子色譜分析[J].化工技術與開發(fā)，2018，47(9)：46-47.

　　[2]鐘本和，王辛龍，張志業(yè)，歐慶祝.次磷酸鹽和亞磷酸鹽介紹[J].無機鹽工業(yè)，2015，47(9)：1-4.

　　[3]袁宇，蘇子奇，李宇涵，普會文，胡紅.次亞磷酸鹽還原—碘量法測砷方法的改進[J].農村實用技術，2017(1)：51-52.

　　化工論文投稿刊物：《化工技術與開發(fā)》(月刊)創(chuàng)刊于1972年，由廣西化工研究院主辦。是面向石油化工行業(yè)科技、技術工作者的省級技術刊物。旨在推廣石油化工行業(yè)生產新技術、科技新理念，交流生產新經驗，為廣大科研工作者和一線生產人員提供技術交流平臺，推動石油化工行業(yè)技術進步。

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