肥桃流膠病病原鑒定

　　摘要:肥桃Prunuspersica‘Feicheng’是我國獨(dú)特的桃品種，肥桃流膠病近年來發(fā)生嚴(yán)重，對(duì)肥桃產(chǎn)業(yè)造成了重大損失。為探究肥桃流膠病病原，2016—2018年通過對(duì)山東肥城5個(gè)主要肥桃產(chǎn)區(qū)不同季節(jié)125個(gè)典型病斑進(jìn)行分離培養(yǎng)和鑒定，并經(jīng)病原菌的培養(yǎng)學(xué)、形態(tài)學(xué)、ITS序列及致病性測定，認(rèn)為肥桃流膠病主要由Botryosphaeriadothidea和Fusariumlateritium兩種病菌引起，為肥桃流膠病病原的首次系統(tǒng)鑒定。

　　關(guān)鍵詞:桃流膠病;病原鑒定;葡萄座腔菌;鐮孢菌

　　肥桃Prunuspersica‘Feicheng’是山東省肥城市乃至全國獨(dú)特的桃品種，是中國水果名優(yōu)特產(chǎn)之一。種植面積達(dá)到了近7000hm2，年產(chǎn)量1.6億公斤，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益顯著。近幾年來，肥桃流膠病發(fā)生嚴(yán)重，對(duì)肥桃的生產(chǎn)、銷售造成了極大影響。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為桃樹流膠病是生理現(xiàn)象，屬于非侵染性病害[1]。20世紀(jì)70年代，Weaver第1次分離出Botryosphaeriadothidea，人們才發(fā)現(xiàn)真菌可導(dǎo)致桃樹流膠病的發(fā)生[2]。

　　1863年葡萄座腔菌屬才被正式定義[2]。在上海、廣州、湖北等南方桃產(chǎn)區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)Physalosporapersicae[3]、Botryosphaeriadothidea[4]、Cucurbitaria[5]、Leptosphaeria[5]等屬真菌也導(dǎo)致桃流膠病。多種報(bào)道認(rèn)為葡萄座腔菌屬真菌Botryosphaeriaspp.可引起桃流膠病[6-9]。B.dothidea進(jìn)入寄主組織可通過皮孔，氣孔或樹皮上小的傷口途徑侵入[10]。

　　大量研究表明，溫度、濕度是影響桃流膠病發(fā)生的重要因素[11]，氣溫高、降雨量大是春夏桃流膠暴發(fā)的主要原因，入冬后，低溫、少雨等因素抑制病害發(fā)生[12-17]。筆者首次對(duì)肥城桃樹流膠病的發(fā)病情況進(jìn)行了全面調(diào)查，通過大量樣本采集和分離鑒定明確了肥桃流膠病病原的分類地位，以期為肥桃流膠病的科學(xué)防控提供參考依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1試驗(yàn)方法

　　1.1.1發(fā)病情況調(diào)查

　　2017年9月在肥城市的西尚里村、東尚里村、劉臺(tái)村景區(qū)、南尚里村和桃園鎮(zhèn)肥桃種植區(qū)5個(gè)主要肥桃產(chǎn)區(qū)中選取多年生桃樹，每個(gè)肥桃產(chǎn)區(qū)按照東南北四個(gè)方位分別選取4個(gè)桃園，每個(gè)方位的桃園選取15棵樹勢相似、栽培條件相同的桃樹進(jìn)行桃流膠病的發(fā)病率及發(fā)病程度的調(diào)查與統(tǒng)計(jì)。每次每個(gè)種植區(qū)調(diào)查60株，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。發(fā)病率(%)=發(fā)病總株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100病情指數(shù)=∑(各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)病級(jí)值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí)值)×100桃流膠病發(fā)病程度的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，參考羅江會(huì)[1]制定的桃流膠病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

　　1.2樣本采集

　　2016—2018年共6次在山東省肥城市的西尚里村、東尚里村、劉臺(tái)村景區(qū)和南尚里村、桃園鎮(zhèn)肥桃種植區(qū)5個(gè)主要肥桃產(chǎn)區(qū)，分別選取典型桃園內(nèi)5個(gè)采樣點(diǎn)的不同方位(東、南、西、北、中)，采用隨機(jī)取樣的方法，在每個(gè)桃園采集5組具有典型癥狀的病枝，共計(jì)125個(gè)病枝作為試驗(yàn)材料并編號(hào)。

　　1.3病原菌的分離與純化

　　采用組織分離法進(jìn)行病原菌分離[18]。每個(gè)病枝分離25個(gè)病健交界組織，放置于PDA平板放入28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)[19]。5d后，觀察病組織分離情況，統(tǒng)計(jì)微生物的種類和數(shù)量。將上述分離的微生物，按照不同類型進(jìn)行純化培養(yǎng)，獲得單一的微生物。

　　1.4病原菌的鑒定

　　1.4.1培養(yǎng)特性觀察

　　分離純化的菌株繼續(xù)在28℃下培養(yǎng)。觀察記錄菌絲形態(tài)、菌落邊緣特征、菌落顏色變化特征。

　　1.4.2形態(tài)學(xué)特性觀察

　　供試菌株在PDA培養(yǎng)基上觀察其子實(shí)體大小、顏色等形態(tài)，顯微鏡下觀察病菌分生孢子器和分生孢子大小、形狀和顏色等形態(tài)，分別測定100個(gè)分生孢子器和分生孢子。

　　1.4.3ITS序列鑒定

　　采用2×CTAB法進(jìn)行基因組的DNA提取，采用引物ITS1(5′-TCCGTAGGT￣GAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCT￣TATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[20]，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，將上述所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送公司測序，獲得的序列與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中相關(guān)菌株進(jìn)行比對(duì)，用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)ITS基因序列數(shù)據(jù)進(jìn)行NJ(NeighborJoin￣ing)分析，以啟發(fā)式搜索獲得系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定病原菌種類和分類地位。

　　1.5致病性測定

　　從7種類型的分離菌株中各挑選1個(gè)典型菌株分離純化后，選取3個(gè)菌株重復(fù)，按照柯赫氏法則，分別接種到與分離物來源一致的肥城紅里桃2a生健康枝條上，7d后確定分離物致病性。采用離體刺傷接種法。剪取紅里肥桃15cm長的2a生枝條，用清水沖洗后用75%酒精進(jìn)行表面消毒，無菌水漂洗3次后用吸水紙吸干水分;用無菌針在枝條中間部位針刺5針，將準(zhǔn)備好的菌絲塊接種于傷口處，以PDA瓊脂塊同樣處理接種為對(duì)照;于25℃條件下培養(yǎng)。測量7d時(shí)枝條病斑長度，比較不同分離菌株的致病力大小，根據(jù)柯赫氏法則，對(duì)枝條發(fā)病病斑進(jìn)行再分離，觀察分離得到的病菌是否與原接種菌株相同。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1肥桃流膠病發(fā)病情況

　　基于2017年對(duì)5個(gè)主要肥桃產(chǎn)區(qū)的肥桃流膠病田間癥狀調(diào)查，肥城市肥桃流膠病發(fā)生較為嚴(yán)重，肥城桃產(chǎn)區(qū)平均發(fā)病率為61.77%，最高發(fā)病率88.0%;平均病情指數(shù)為24.9，最高病情指數(shù)為26.9。

　　2.2肥桃流膠病病原鑒定

　　2.2.1采集分離純化獲得的病原菌株2016—2018年通過對(duì)125個(gè)病枝分離純化后共獲得160個(gè)菌株，根據(jù)培養(yǎng)特征分為7個(gè)類型，其分離純化結(jié)果。類型1和類型4是病斑上分離到的優(yōu)勢菌株，其他菌株是偶發(fā)的菌株。

　　2.2.2病斑分離物菌落培養(yǎng)特性

　　類型1菌株生長較為旺盛，菌落生長速度快，菌絲呈棉絮狀;中部菌絲較外緣菌絲旺盛，菌絲初為白色，后由中心向四周輻射狀變黑;最終整個(gè)菌落呈現(xiàn)墨黑色。類型2菌株菌絲生長相對(duì)平緩，菌落扁平;菌絲初為白色后顏色逐漸變深直至變?yōu)楹谏�。類�?菌株菌絲生長非常旺盛，后期菌絲可生長至培養(yǎng)皿頂端，整個(gè)菌落呈棉絮狀，菌絲顏色變化為先白后黑。類型4菌株菌絲生長平緩，呈絨毛狀，菌絲初為白色，后逐漸呈輻射狀變紅，直至整個(gè)菌落呈磚紅色。類型5菌株菌絲白色，生長平緩;外圍菌絲較內(nèi)部菌絲旺盛。類型6菌株菌絲白色，匍匐，中部菌絲比四周菌絲生長旺盛。類型7菌株菌絲疏松、生長旺盛，菌落外圍一圈菌絲生長旺盛，菌絲顏色初為白色，后逐漸變?yōu)闇\紅色。

　　2.2.4病原菌分子鑒定

　　從分離菌株的rDNA￣ITS的PCR擴(kuò)增、BLAST序列比對(duì)結(jié)果可以看出類型1(菌株T1、T9、T15、T16、T19、T22)與Botry￣osphaeriadothidea序列相似性100%;類型2(菌株L11)與Lasiodiplodiatheobromae的序列相似性98%;類型3(菌株T7)與B.obtusa(無性態(tài)為Diplo￣diaseriata)的序列相似性99%;類型4(菌株F27-2、F8-2)與Fusariumlateritium的序列相似性100%;類型5(菌株F11-3)與F.fujikuroi的序列相似性100%;類型6(菌株F3-3、F44-2、F13-2、F39-3)與F.proliferatum的序列相似性100%;類型7(菌株F38-2)與F.oxysporum序列相似度100%。

　　3討論與結(jié)論

　　綜合肥桃流膠病病斑分離物的培養(yǎng)學(xué)、形態(tài)學(xué)、ITS序列及致病力測定，明確了肥桃流膠病可由7種真菌引起，包括B.dothidea、B.obtusa、Lasiodip￣lodiatheobromae、F.proliferatum、F.fujikuroi、F.oxysporum與F.lateritium，其中B.dothidea和F.lateritium是優(yōu)勢種，其他均是偶發(fā)種，這7種病原菌間的互作及其與肥桃流膠病的關(guān)系，尚需繼續(xù)研究。

　　本研究中共分離出鐮孢菌類菌株4種，為F.proliferatum、F.fujikuroi、F.oxysporum與F.lateri￣tium，在肥桃流膠病病原研究中，這是首次發(fā)現(xiàn)鐮孢菌類真菌為致病菌。F.lateritium分離率最高，為優(yōu)勢病原菌。但在鐮孢菌類菌株致病性測定試驗(yàn)中，F(xiàn).lateritium的致病力卻最低。F.fujikuroi與F.proliferatum的致病性差異不大，明顯高于F.lateritium與F.oxysporum兩類菌株。但鐮孢菌種類病原菌無論分離率還是致病性均低于葡萄座腔菌。

　　本實(shí)驗(yàn)中，鐮孢菌類菌株的分離比率明顯低于葡萄座腔菌菌株，并且在分離過程中發(fā)現(xiàn)，鐮孢菌類菌株與葡萄座腔菌菌株全部相伴而生，沒有發(fā)現(xiàn)鐮孢菌類菌株單獨(dú)被分離的現(xiàn)象，由此推論葡萄座腔菌類菌株是肥桃流膠病主要病原菌，鐮孢菌類菌株是伴生病原菌，可混合侵染危害。

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　　[5]蓋鳳珍.疑似桃流膠病病菌侵染新梢形態(tài)觀察及鑒定[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

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　　摘要：我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，也是一個(gè)人口大國，保證農(nóng)產(chǎn)品的綠色健康關(guān)系到人民的身心健康發(fā)展，而農(nóng)業(yè)發(fā)展中的一個(gè)巨大威脅就是病蟲害帶來的威脅，在傳統(tǒng)的方法下，通過農(nóng)藥噴灑來殺蟲的方法會(huì)帶來較大的化學(xué)殘留，這不僅有損群眾的身體健康，還嚴(yán)重降低了我國的農(nóng)業(yè)發(fā)展水平，降低了農(nóng)產(chǎn)品在世界范圍上的競爭力，因此發(fā)展綠色的防控技術(shù)，是對(duì)當(dāng)下時(shí)代新農(nóng)業(yè)的發(fā)展要求。

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