短期氮添加對荒漠草原土壤微生物特征的影響

　　摘要:為探究荒漠草原土壤微生物特征對短期氮添加的響應(yīng),以寧夏荒漠草原為對象,參照國內(nèi)外同類研究和當(dāng)?shù)氐牡�沉降�?設(shè)置 N0、N1、N2、N3、N4的5個(gè)處理,其純氮添加量分別為0,2.5,5,10,15g/(m2·a),以尿素為氮源進(jìn)行為期2年的氮添加試驗(yàn),對不同氮添加處理下荒漠草原淺層土壤微生物特征進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:(1)隨氮添加量的增加,荒漠草原0—20cm 土層土壤銨態(tài)氮含量呈升高的變化趨勢,硝態(tài)氮含量呈先升高后下降的變化趨勢。在0—10cm 土層,N1、N2、N3、N4處理草地銨態(tài)氮含量較 N0處理分別增加了109.61%,136.52%,197.19%,198.88%,硝態(tài)氮含量以 N2處理草地最高,顯著高于 N0、N3、N4處理(P<0.05)。(2)與 N0相比,施氮后0—10cm 土層土壤微生物量氮含量顯著下降,N1、N2、N3和N4處理分別較 N0處理降低了37.54%,38.11%,28.56%,29.81%。(3)隨氮添加量的增加,荒漠草原0—10cm 土層土壤真菌數(shù)量呈逐漸減少的變化趨勢,N0、N1處理草地顯著大于 N3、N4處理草地(P<0.05)。PcoA 分析顯示高氮添加處理(N3、N4)對荒漠草原土壤amoA 區(qū)、nirK 區(qū)微生物的群落結(jié)構(gòu)有顯著改變。高氮添加(N3,N4)會(huì)對荒漠草原土壤微生物群落產(chǎn)生負(fù)面影響,具體表現(xiàn)為真菌數(shù)量減少,硝態(tài)氮含量降低,氮轉(zhuǎn)化微生物的α 多樣性和優(yōu)勢菌豐度降低、群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變。

　　關(guān)鍵詞:氮添加;荒漠草原;酶活性;微生物特征;氮轉(zhuǎn)化微生物

　　土壤是一切陸地植物賴以生存的基礎(chǔ),也是陸地生態(tài)系統(tǒng)中最大的氮沉降承受者。在過去的一個(gè)世紀(jì)里,由于工業(yè)和農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展,全球氮沉降量增加了3~5倍[1]。已有研究[2]表明,短期或少量 N 沉降在一定程度上可緩解植物生長所受的 N限制,但持續(xù)的外源氮輸入會(huì)造成土壤養(yǎng)分流失,微生物群落結(jié)構(gòu)改變和多樣性的喪失的嚴(yán)重后果。土壤微生物具有生命周期短,生存環(huán)境敏感的特點(diǎn),它們驅(qū)動(dòng)土壤養(yǎng)分循環(huán),并對土壤環(huán)境變化迅速做出反應(yīng),最終發(fā)生結(jié)構(gòu)組成上的改變[3]。

　　王志瑞等[4]、Zhao等[5]認(rèn)為,長期氮添加會(huì)降低土壤微生物生物量,但短期氮添加對土壤微生物生物 量 的 影 響 至 今 仍 沒 有 一 致 的 結(jié) 論。Zhang等[6]綜合分析了來自全球的151項(xiàng)研究結(jié)果認(rèn)為,氮添加降低了總微生物生物量、細(xì)菌生物量、真菌生物量、生物量碳和微生物呼吸,且這些負(fù)面效應(yīng)隨著氮的施用速率和試驗(yàn)時(shí)間的延長而增加。

　　土壤微生物驅(qū)動(dòng)的氮素轉(zhuǎn)化過程主要包括生物固氮 和 氨 化、硝 化、反 硝 化 作 用,固 氮 菌 相 關(guān) 基 因nifH、氨氧化古菌基因amoA—AOA、氨氧化細(xì)菌基因amoA—AOB 和反硝化相關(guān)基因 nirK 被廣泛應(yīng)用于氮轉(zhuǎn)化微生物的研究[7]。Shi等[8]研究發(fā)現(xiàn),連續(xù)施氮6年后,中國亞熱帶森林土壤中 AOA 豐度顯著增加,且施氮對 AOA 驅(qū)動(dòng)的自養(yǎng)硝化存在潛在的促進(jìn)作用。

　　在內(nèi)蒙古貝加爾針茅草原,低氮添加顯著增加了nirK 的相對豐度,高氮添加顯著抑制了 nirK的相對豐度[9]。與以上研究結(jié)果不同,Zhang等[6]分析了大量氮添加對土壤微生物影響的資料認(rèn)為,氮添加對陸地生態(tài)系統(tǒng)中所有土壤微生物的生長、組成和功能均具有一定程度的負(fù)面影響,且隨著氮沉降速率和持續(xù)時(shí)間的增加,影響愈發(fā)顯著,結(jié)構(gòu)方程模型表明,施氮對土壤微生物數(shù)量和組成的負(fù)面影響可能導(dǎo)致土壤微生物呼吸的減弱。

　　在相關(guān)機(jī)制的研究方面,薛璟花等[10]認(rèn)為,過量氮沉降會(huì)減少土壤微生物量、真菌生物量和真菌/細(xì)菌生物量比率,改變土壤pH,進(jìn)而導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。土壤呼吸率,土壤酶活性的減少和微生物對底物的利用模式的改變也會(huì)導(dǎo)致微生物功能的改變�？偟膩碚f,氮添加對土壤微生物的影響和驅(qū)動(dòng)因素存在很大不確定性,需要更多的研究驗(yàn)證和發(fā)現(xiàn)。荒漠草原占寧夏天然草地面積半數(shù)以上,是典型的干旱生態(tài)系統(tǒng),也是防風(fēng)固沙、保持水土的重要生態(tài)屏障。

　　目前,有關(guān)氮添加對荒漠草原土壤影響的研究主要集中在土壤結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的方面[11],有關(guān)土壤微生物特征的研究還相對較少。為探究荒漠草原土壤微生物特征對短期氮添加的響應(yīng),本研究對不同氮添加量下荒漠草原土壤氨硝態(tài)氮含量、微生物數(shù)量進(jìn)行了測定,對amoA—AOA、nirK 基因進(jìn)行了測序分析,并結(jié)合土壤環(huán)境因子的變化,探討荒漠草原土壤微生物特征對短期氮添加的響應(yīng),以期為荒漠草原生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)和科學(xué)管理提供理論依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 研究區(qū)概況

　　研 究 區(qū) 位 于 寧 夏 東 部 的 鹽 池 縣 四 墩 子 行 政 村(37°04'—38°10'N,106°30'—107°41'E),海拔 1430m,地勢為緩坡丘陵,土壤類型為灰鈣土、淡灰鈣土,土壤質(zhì)地以沙壤、粉沙壤為主,屬中溫帶大陸性氣候、干旱、少雨、多風(fēng),晝夜溫差大。年平均氣溫9.1 ℃,最熱月(7 月)平均氣溫 23.9 ℃;當(dāng)年降水量 205.2mm,較歷年平均雨量偏少77.1mm;年均無霜期180天,年均蒸發(fā)量1231.5mm,年均日照時(shí)間2769h。草地類 型 為 荒 漠 草 原,主 要 物 種 有 草 木 樨 狀 黃 芪(Astragalus melilotoides),華 北 白 前 (Cynanchumkomarovii),牛枝子(Lespedezapotaninii)等。

　　1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

　　選取較為平坦的荒漠草原為研究對象,于2018年5月開始進(jìn)行氮添加處理,參照國內(nèi)外同類研究[12]和當(dāng)?shù)氐牡�沉降量設(shè)5個(gè)施氮梯度,即 N0、N1、N2、N3、N4,其純氮添加量分別為0,2.5,5,10,15g/(m2·a),使用尿素(CO(NH2)2)作為 N源,將每個(gè)小區(qū)每次所需噴施的尿素溶解于等量水中,每月1次,分5次均勻噴灑在各小區(qū)內(nèi)。按照處理水平的要求,對照小區(qū)(N0)噴灑相同量的水。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),每個(gè)梯度重復(fù)3次,總計(jì)15個(gè)小區(qū),每小區(qū)面積5m ´4 m,氮添加后各處理的土壤理化性質(zhì)。

　　1.3 植被調(diào)查與樣品采集

　　2020年7月,在每個(gè)小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取3個(gè)取樣點(diǎn),用滅過菌的鏟子分0—10,10—20cm 采集土壤樣品,去除雜物及植物殘?bào)w等,將同層的3個(gè)樣品混合均勻,迅速裝入滅菌袋中帶回實(shí)驗(yàn)室。一部分用液氮冷凍后進(jìn)行測序分析;另一部分置于4 ℃冰箱中保存,用于土壤生物學(xué)指標(biāo)的測定;部分風(fēng)干后過2mm 篩,用于土壤pH 及養(yǎng)分指標(biāo)測定。同時(shí),用環(huán)刀分層采集土壤樣品,用于土壤容重和含水率的測定。2020年8月,在每個(gè)小區(qū)隨機(jī)設(shè)置1個(gè)1m×1m 的樣方,調(diào)査植物群落物種組成,分種測定各個(gè)物種的生物量。其中,地上生物量以1 m2 樣方中各物種的風(fēng)干重量計(jì)測,根系生物量采用根鉆法測定。

　　1.4 測定指標(biāo)與方法

　　土壤理化性質(zhì)的測定參照《土壤農(nóng)化分析》[13],土壤容重(BD)采用環(huán)刀法測定;土壤pH 采用酸度計(jì)測定(土水比為 1∶5)。土壤有機(jī)碳(SOC)采用ElementalrapidCScube元素分析儀(德國 Elementar公司)測 定;土 壤 全 氮 (STN)采 用 KjeltecTM8400全自動(dòng)凱氏定氮儀(瑞典 Foss公司)測定。土壤微生物量碳(MBC)和土壤微生物量氮(MBN)均采用氯仿熏蒸浸提法,MBC采用 TOC—VCPH 總有機(jī)碳分析儀(日本島津公司)測定,MBN 采用 AutoAnalyzer3—AA3流動(dòng)分析儀測定(德國Seal公司);土壤銨態(tài)氮(NH4+ -N)和硝態(tài)氮(NO3- -N)均采用1mol/L的氯化鉀浸提,AutoAnalyzer3—AA3流動(dòng)分析儀測定。

　　土壤微生物數(shù)量采用平板涂抹培養(yǎng)計(jì)數(shù)法測定,以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌,馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)真菌,改良的高氏一號(hào)放線菌培養(yǎng)基培養(yǎng)放線菌。土壤氮轉(zhuǎn)化微生物采用 DNA 測序方法測定。由上海天昊生物科技有限公司對樣本進(jìn)行 DNA提取和質(zhì)量檢測(Nanodrop+瓊脂糖電泳)、PCR 擴(kuò)增、文庫構(gòu)建和上機(jī)測序(Illumina2×250bp)。

　　1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用 Excel2010 軟 件 對 數(shù) 據(jù) 進(jìn) 行 基 礎(chǔ) 處 理,SPSS23軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析,Origin2018和R軟件進(jìn)行制圖;采用 one-wayANOVA 和 Duncan法進(jìn)行方差分析和多重比較。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 對土壤微生物量碳、氮的影響0—10cm 土層,MBC含量以 N2處理草地最高,為180.17mg/kg,N3處理草地最低,為142.01mg/kg。氮添 加 顯 著 降 低 了 荒 漠 草 原 土 壤 MBN 含 量(P<0.05),與 N0相比,N1、N2、N3和 N4處理草地土壤 MBN含量分別降低了37.54%,38.11%,28.56%,29.81%,但各處理草地間差異不顯著(P>0.05)。10—20cm土層,MBC含量以 N3處理草地最高,為175.59mg/kg,N0處理草地最低,為124.00 mg/kg。土壤MBN 隨氮添加量的增加呈波動(dòng)性變化,N1處理草地的12.17 mg/kg 顯 著 高 于 N0 處 理 草 地 的 7.81mg/kg(P<0.05)。這說明氮添加主要對0—10cm土層土壤微生物生物量產(chǎn)生影響,且土壤 MBN 對氮添加的敏感程度高于 MBC。

　　2.2 對土壤微生物數(shù)量的影響

　　荒漠草原土壤微生物以細(xì)菌為主,約占微生物總量的 68.86% ~81.59%;其次為放線菌,約占微生物總量的17.42%~31.01%;真菌占微生物總量的比例最小,僅為0.05%~0.16%。氮添加顯著抑制了荒漠草原0—10cm 土層土壤真菌、細(xì)菌的生長,但對放線菌的影響未達(dá)到差異顯著性水平。

　　0—10cm 土層,隨氮添加量的增加,荒漠草原土壤真菌數(shù)量的變化范圍為17.70×102 ~58.30×102 cfu/g,呈逐漸下降趨勢,N0、N1處理草地顯著大于 N3、N4處 理 草 地 (P <0.05);細(xì) 菌 數(shù) 量 的 變 化 范 圍 為17.70×102~35.70×102cfu/g,N0處理顯著大于 N3處理(P<0.05)。放線菌數(shù)量的變化范圍為59.00×104~94.00×104cfu/g。10—20cm 土層,不同氮添加處理對荒漠草原土壤真菌、細(xì)菌、放線菌數(shù)量均無顯著影響(P>0.05)。

　　2.3 氮添加對土壤氮轉(zhuǎn)化微生物的影響

　　2.3.1 對土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮的影響

　　氮添加增加了荒漠草原土壤 NH4+ -N 含量,在0—10cm 土層,與 N0相比,N1、N2、N3、N4處理草地土壤的 NH4+ -N 含量分別增加了109.61%,136.52%,197.19%和198.88%;10—20cm 土層,NH4+ -N 含量增 長 較 緩,N1、N2、N3、N4 處 理 草 地 分 別 增 加 了4.71%,34.90%,96.47%和92.55%。

　　從剖面變化看,N0處理草地10—20cm 土層 NH4+ -N 含量顯 著 高 于0—10cm 土層(P<0.05),其他氮添加處理草地均以0—10cm 土層最高,但與10—20cm 土層之間差異不顯著。

　　NH4+ -N/STN 的變化趨勢與 NH4+ -N含量的變化趨勢基本一致,在0—20cm 土層土壤中均以 N4處理草地最高,顯著高于 N0和 N1處理草地,N3處理草地顯著高于 N0處理草地(P<0.05)。各處理草地0—10cm 土層土壤 NH4+ -N/STN 總 體 高 于10—20cm土層,其間差異不顯著(P>0.05)。

　　隨氮添加量的增加,荒漠草原0—10cm 土層土壤NO3- -N含量呈先上升后下降的變化趨勢,變化范圍為7.15~13.61mg/kg,以 N2處理草地最高,顯著高于N0、N3、N4 處 理 草 地;NO3- -N/STN 為 1.23% ~2.22%,N1處理草地顯著高于 N0、N3處理草地(P<0.05)。10—20cm 土層土壤 NO3- -N 含量為3.59~7.47mg/kg;NO3- -N/STN 變 化 范 圍 為 0.43% ~1.13%,N1處理草地顯著高于 N0處理草地(P<0.05)。各氮添加處理草地中,土壤 NO3- -N 含量和 NO3- -N/STN均表現(xiàn)為0—10cm 土層高于10—20cm 土層�；哪�草原土壤NO3- -N主要分布在0—10cm土層,且在低氮添加條件(N1,N2)下含量最高。

　　2.4 土壤微生物特征與土壤環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系

　　土壤 NH4+ -N 含量與土壤 pH、amoA—AOA 優(yōu)勢菌豐度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系;與nirK 優(yōu)勢菌豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01),與真菌數(shù)量(FM)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。土壤amoA—AOA 優(yōu)勢菌豐度與 nirK 優(yōu)勢菌豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01),與細(xì)菌數(shù)量(BM)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。土壤pH 與amoa—AOA優(yōu)勢菌豐度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01),與nirK優(yōu)勢菌豐度和 FM 呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系 (P <0.05)。說明影響amoA—AOA 和 nirK 優(yōu)勢菌豐度的主要因素有土壤真菌數(shù)量、細(xì)菌數(shù)量、pH 和 NH4+ -N含量,且土壤pH、NH4+ -N 含量對土壤真菌數(shù)量有顯著影響。

　　3 討 論

　　3.1 氮添加對荒漠草原土壤微生物量碳、氮及微生物數(shù)量的影響

　　土壤微生物生物量指土壤微生物體內(nèi)的碳、氮總和,是評價(jià)土壤生物學(xué)性狀和養(yǎng)分狀況的常用指標(biāo)。本研究中,氮添加顯著降低了0—10cm 土層土壤真菌數(shù)量和 MBN 含量,此結(jié)果與 Zhou[14]等的研究結(jié)果基本一致,真菌群落的生物量 C∶N 顯著高于細(xì)菌群落,而氮添加可能減少真菌群落生物量,進(jìn)而降低土壤微生物量。

　　土壤真菌數(shù)量的下降可能與土壤性質(zhì)的改變和養(yǎng)分的不均衡分配相關(guān)[18],細(xì)菌比真菌更適宜堿性土壤環(huán)境,氮添加導(dǎo)致土壤pH 的增加對真菌的發(fā)育更為不利,本研究相關(guān)分析中,土壤真菌數(shù)量與pH、銨態(tài) 氮 的 負(fù) 相 關(guān) 關(guān) 系 也 證 實(shí) 了 這 一 結(jié)論。但氮素不是影響土壤微生物生物量的唯一因子,當(dāng)?shù)�添加量增加時(shí),過量的氮輸入可能造成土壤氮飽和,使土壤微生物受到 pH、水分、SOC 等因子的制約,造成 MBC 含量不顯著變化[15]。

　　從剖面變化上看,本研究0—10和10—20cm 土層 MBC、MBN 含量沒有顯著差異,但多數(shù)研究[16]認(rèn)為,表層土壤中含有更多的植物凋落物和有機(jī)質(zhì),可用于促進(jìn)土壤微生物的 生 長,故 無 論 添 加 氮 素 與 否,0—10cm 土 層MBC、MBN 含量都應(yīng)高于10—20cm 土層,原因可能是荒漠草原植被稀疏,表層土壤風(fēng)蝕嚴(yán)重、蒸發(fā)強(qiáng)烈,植物凋落物等輸入表層土壤的有機(jī)質(zhì)較少,加之土壤結(jié)構(gòu)松散,保水保肥能力差,養(yǎng)分流失和水分蒸發(fā)的雙重限制降低了荒漠草原土壤表層的微生物量。

　　3.2 氮添加對荒漠草原土壤氮轉(zhuǎn)化微生物的影響

　　氮添加增加了土壤無機(jī)態(tài)氮含量,有利于微生物的生長[17],同時(shí)會(huì)使土壤微生物 數(shù) 量 下 降、活 性 降低。尿素能夠分解釋放銨根離子,增加土壤中銨態(tài)氮含量,在微 生 物 群 落 的 驅(qū) 動(dòng) 下 發(fā) 生 硝 化 反 應(yīng),有 研究[19]認(rèn) 為,氮 添 加 會(huì) 增 加 土 壤 中 NH4+ - N 和NO3- -N 含量,并促進(jìn)土壤氨化和硝化作用。本研究中隨氮添加量的增加,荒漠草原土壤 NH4+ -N含量逐漸增加,但 NO3- -N 含量先增加后減少,此結(jié)果與上述研究結(jié)果部分相同,但存在一定差異。

　　一是適宜濃度的氮添加可以補(bǔ)充受氮素限制生態(tài)系統(tǒng)中的氮素,但添加量的增加可能會(huì)使植物群落對無機(jī)氮的需求達(dá)到飽和,若受氮素限制的生態(tài)系統(tǒng)能夠有效地固定外源氮素,并且植物有較強(qiáng)的吸收利用能力,則多數(shù)進(jìn)入土壤的 NH4+ -N 和 NO3- -N 會(huì)被植物吸收而退出土壤生態(tài)系統(tǒng)[20];二是植物會(huì)優(yōu)先吸收土壤中的 NO3- -N 作為生長發(fā)育所需的養(yǎng)分,從而降低土壤中 NO3- -N 的凈剩余量;三是相較于帶正電荷的 NH4+ -N,帶負(fù)電荷的 NO3- -N 更容易通過淋溶作用而損失[21]。

　　4 結(jié) 論

　　(1)氮添加顯著增加了荒漠草原土壤的銨態(tài)氮含量,同時(shí)降低了0—10cm 土層土壤真菌數(shù)量和微生物量氮含量(P<0.05)。

　　(2)與 N0相比,低氮添加處理(N1、N2)的荒漠草原土壤含有較多的硝態(tài)氮和微生物量碳氮,氮轉(zhuǎn)化微生物的優(yōu)勢菌豐度較高,且群落結(jié)構(gòu)無明顯改變,高氮添加處理(N3、N4)的荒漠草原土壤銨態(tài)氮含量較高,但氮轉(zhuǎn)化微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著改變。

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　　作者：宋珂辰1,王 星1,許冬梅1,2,李永康1,撒春寧1,馬 霜1

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