本文摘要：摘 要：為了明確十字花科與茄果類蔬菜作物根腫菌侵染根細(xì)胞的變化特征，本試驗(yàn)選取十字花科蔬菜青花菜品種中青 10號(hào)和中青 16 號(hào)(感病組)，番茄品種中雜 302 和辣椒品種中椒 115(對(duì)照組)進(jìn)行比較試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)兩組試驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行根部染色及細(xì)胞學(xué)觀察，揭示青花菜、番茄和
摘 要：為了明確十字花科與茄果類蔬菜作物根腫菌侵染根細(xì)胞的變化特征，本試驗(yàn)選取十字花科蔬菜青花菜品種中青 10號(hào)和中青 16 號(hào)(感病組)，番茄品種中雜 302 和辣椒品種中椒 115(對(duì)照組)進(jìn)行比較試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)兩組試驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行根部染色及細(xì)胞學(xué)觀察，揭示青花菜、番茄和辣椒在根腫菌侵染過(guò)程中的根部特征和差異變化。分子輔助鑒定結(jié)果表明，供試菌株(河南新野)為 4 號(hào)生理小種。以水培法培育青花菜、番茄和辣椒幼苗，在根腫菌接種后 14 d 內(nèi)，根腫菌侵染途徑基本一致：根腫菌最先進(jìn)入 3 種蔬菜作物的根毛區(qū)，然后繼續(xù)侵入根部皮層細(xì)胞，形成分生孢子或孢子囊。在根腫菌侵染率方面，青花菜與番茄、辣椒存在明顯差異：根腫菌在接種后 7 d 和 14 d 能夠快速侵染青花菜，并在 14 d 時(shí)的皮層細(xì)胞內(nèi)形成大量的分生孢子和孢子囊;根腫菌侵染番茄的速率明顯低于青花菜，且根腫菌侵染數(shù)量明顯減少，僅在根毛區(qū)形成分生孢子，能侵染皮層細(xì)胞但不能形成孢子囊;辣椒根毛區(qū)根腫菌侵染速率最慢，且根腫菌侵染效率最低，只在根毛區(qū)形成少量的分生孢子，極少數(shù)孢子能進(jìn)入皮層細(xì)胞，但不能形成孢子囊。本試驗(yàn)揭示了我國(guó)主要根腫病致病菌(4 號(hào)生理小種)在水培環(huán)境下侵染青花菜、番茄和辣椒的變化特征，為科學(xué)解釋茄果類蔬菜抗根腫病機(jī)理提供了依據(jù)，也為創(chuàng)制十字花科抗根腫病種質(zhì)開辟了一條新途徑。
關(guān)鍵詞：青花菜;番茄;辣椒;水培法;根腫菌;分子鑒定;侵染過(guò)程
根腫病是一種土傳病害，對(duì)世界范圍內(nèi)的十字花科作物危害嚴(yán)重，該病可由蕓薹根腫菌(Plasmodiophora brassicae)侵染植株根系引發(fā)，根腫菌在土壤中可存活數(shù)年，傳播方式呈現(xiàn)多樣化。近些年，我國(guó)青花菜(Brassica oleracea L. var.italic)栽培面積逐年增加(李占省 等，2021)，根腫病也開始在部分地區(qū)發(fā)生且呈擴(kuò)大趨勢(shì)，目前已在浙江、云南、湖北、河南、重慶等地發(fā)生。
根腫病會(huì)造成青花菜商品性降低，甚至難以形成正�；ㄇ颍绊懏a(chǎn)量和質(zhì)量，嚴(yán)重時(shí)造成絕收。十字花科根腫病的防治方法有物理防治(撒石灰、石灰氮等)和化學(xué)防治(氟啶胺)等，但最根本的方法是選育抗性品種(Webster & Dixon，1991;Wallenhammar et al.，2008)。
目前，根腫菌在土壤中侵染十字花科作物的生活史已很清楚(楊曉琴，2015)。十字花科根腫病鑒定方法主要分為兩類，一是建立在病圃基礎(chǔ)上的鑒定技術(shù)，二是離體接種鑒定。兩種方法鑒定周期均較長(zhǎng)，管理風(fēng)險(xiǎn)大，耗費(fèi)大量的人力與物力，故探索和建立十字花科根腫病快速鑒定方法將極大地提高鑒定效率(Deora et al.，2012)。
根腫菌生理小種的鑒定方法主要有兩種：Williams 鑒定系統(tǒng)和歐洲根腫病 ECD 鑒定系統(tǒng)(Williams，1966;Buczackl et al.，1975)。Williams 鑒定系統(tǒng)具有寄主少、簡(jiǎn)單易操作等優(yōu)點(diǎn)，在國(guó)際上被廣泛使用。然而，Williams 鑒定系統(tǒng)只能鑒別出 13 個(gè)生理小種，且當(dāng)多個(gè)生理小種混雜時(shí)，采用 Williams 鑒定系統(tǒng)并不能夠準(zhǔn)確地將優(yōu)勢(shì)小種鑒別出來(lái)，所以該方法存在一定的局限性(Feng et al.，2016;白宇鵬，2019)。
ECD 鑒定系統(tǒng)具有較好的實(shí)用性，準(zhǔn)確度較高，且能夠更加細(xì)致地劃分生理小種，但 ECD 鑒定系統(tǒng)寄主較多，存在難收集、工作量較大和操作程序較為復(fù)雜的問題(丁云花 等，2013;朱翠娟，2016)。原玉香等(2017)研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)同一地區(qū)的 2 份菌株進(jìn)行鑒定時(shí)，采用 Williams 鑒定系統(tǒng)和 ECD 鑒定系統(tǒng)鑒定的結(jié)果不一致，表明兩種鑒定系統(tǒng)對(duì)同一地區(qū)生理小種的鑒定結(jié)果存在差異。
近些年，水培接種法作為一種快速鑒定根腫病抗性的技術(shù)逐漸顯現(xiàn)其優(yōu)越性，具有操作簡(jiǎn)單、方便快捷等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)離體接種和染色觀察(杜艷 等，2016)，可以從細(xì)胞學(xué)水平上快速鑒定十字花科作物根腫病抗性，應(yīng)用前景廣闊。相比十字花科作物，根腫病不會(huì)對(duì)茄果類作物造成危害，探尋及利用該抗性機(jī)理選育抗根腫病的十字花科作物新品種具有極其重要的意義和科學(xué)價(jià)值。因此，揭示并闡明十字花科和茄果類作物在根腫菌侵染過(guò)程及其防御能力上的差異，將為創(chuàng)制十字花科抗根腫病種質(zhì)資源提供新思路。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
本試驗(yàn)于 2019 年 7—9 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所進(jìn)行，種子均為商品種，青花菜品種為中青 10 號(hào)和中青 16 號(hào)，番茄(Solanumlycopersicum)品種為中雜 302，辣椒(Capsicumannuum L.)品種為中椒 115，均由本所自主育成。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 種子預(yù)處理
2019 年 7 月將青花菜、番茄和辣椒種子撒播在浸濕的濾紙上，將濾紙放入培養(yǎng)皿中催芽，6 d 后將幼苗移到 15 mL 的離心管中，每管加入 14 mL 蒸餾水，只放入 1 株幼苗用泡沫篩固定，離心管用錫箔紙包裹進(jìn)行遮光處理，根腫菌侵染過(guò)程在水培溶液中進(jìn)行。
1.2.2 根腫菌分子輔助鑒定
供試根腫菌菌株來(lái)自河南新野青花菜、大白菜腫塊，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所魏小春老師提供并已鑒定為生理小種4 號(hào)，將根腫病腫塊洗凈風(fēng)干后超低溫(-80 ℃)保存?zhèn)溆�。采�?CTAB 法提取腫塊 DNA(李占省，2012)。
根據(jù)已報(bào)道的根腫菌生理小種特異引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增和鑒定(Zheng et al.，2018)。PCR 反應(yīng)體系：5.0 μL 的 2× Taq Plus Master Mix，2.0 μL 的 ddH2O，2.0 μL DNA，正反引物各 0.5μL，總體積 10.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 5min;94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，35 個(gè)循環(huán);72 ℃后延伸 5 min，10 ℃保存。采用 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，每孔點(diǎn)入 5 μL PCR 產(chǎn)物，在 150 V 恒壓下電泳 25 min，后置于自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)中成像觀察。
1.2.3 根腫菌菌液制備
將 -80 ℃冰箱中的根腫病腫塊在室溫下解凍，稱取 10.0 g，用刀片將根腫病腫塊切成小片后放入研磨機(jī)，加入 1.0 L 蒸餾水機(jī)械研碎成漿液，時(shí)間為 3 min。將磨好的漿液用8 層尼龍網(wǎng)布過(guò)濾，以 500 r · min-1 的轉(zhuǎn)速離心 5min，取上清液，最后，用血球計(jì)數(shù)板和光學(xué)顯微鏡將孢子濃度稀釋至 4 × 107 個(gè) · mL-1，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.4 根腫菌侵染
移至離心管的中青 16 號(hào)、中青 10 號(hào)、中椒 115 和中雜 302 幼苗水培 3 d 后，在離心管中加入 2 mL 孢子濃度為 4 × 107 個(gè) · mL-1 的根腫菌菌液，侵染處理過(guò)程參考張小麗(2014)的方法并進(jìn)行調(diào)整。將接種后的水培苗放入人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：16 h 光照，25 ℃ ;8 h黑暗，20 ℃ ;相對(duì)濕度 75%。
1.2.5 鏡檢觀察
在接種后 7、12、14 d，利用顯微鏡對(duì)供試對(duì)象根細(xì)胞進(jìn)行觀察，確定初級(jí)、次級(jí)侵染時(shí)期根腫菌侵染過(guò)程。首先，用蒸餾水清洗試驗(yàn)材料根上的附著孢子，然后將根切成 1～2 cm 長(zhǎng)的小段，用 FAA 固定 24 h，同時(shí)用熒光桃紅染液染色 15 min，染好的根部組織置于載玻片上用清水沖洗掉多余染液，最后進(jìn)行鏡檢觀察，分別統(tǒng)計(jì)侵染和未侵染的根毛數(shù)，計(jì)算根毛侵染率。每時(shí)間點(diǎn)選取 3 個(gè)單株分別觀察和拍照。根毛侵染率=(被侵染的根毛數(shù) / 觀察的總根毛數(shù))× 100%
2 結(jié)果與分析
2.1 生理小種的分子輔助鑒定
根據(jù)已報(bào)道的根腫菌生理小種特異引物對(duì)河南新野菌株進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，結(jié)果表明，6 對(duì)特異引物 Novel342-2、Novel407-2、PBRA_007750-2、PBRA_008439-1、PBRA_009348-1 和 Actin1 均能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。
通過(guò) Novel342-2、PBRA_009348-1 和 Novel407-2 PCR 擴(kuò)增結(jié)果可以確定 4 號(hào)、7 號(hào)和 9 號(hào)生理小種的存在情況，若特異引物 Novel342-2 能擴(kuò)增出特異產(chǎn)物，則可以鑒定存在根腫菌 4 號(hào)生理小種;若特異引物 Novel342-2 或 Novel407-2 不能擴(kuò)增出特異產(chǎn)物，則可以鑒定存在根腫菌 7 號(hào)生理小種;若特異引物 PBRA_009348-1 能擴(kuò)增出特異產(chǎn)物，且 Novel342-2 或 Novel407-2 不能擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物，則可以鑒定存在根腫菌 9 號(hào)生理小種。本試驗(yàn) 中， 特 異 引 物 Novel342-2、PBRA_009348-1和 Novel407-2 均能擴(kuò)增出特異片段，故可以確定該菌株存在 4 號(hào)生理小種。
不存在 7 號(hào)和 9號(hào) 生 理 小 種。 通 過(guò) 特 異 引 物 PBRA_007750-2、PBRA_009348-1 和 PBRA_008439-1 的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果可以判斷 11 號(hào)生理小種的存在情況，若特異引物 PBRA_009348-1 未擴(kuò)增出特異產(chǎn)物而PBRA_007750-2 或 PBRA_008439-1 可以擴(kuò)增出特異產(chǎn)物，則可以推斷存在根腫菌 11 號(hào)生理小種，但本試驗(yàn)中，特異引物 PBRA_009348-1 能擴(kuò)增出特異產(chǎn)物，可推斷該供試菌株中不存在 11 號(hào)生理小種。綜上所述，推斷該根腫菌只存在 4 號(hào)生理小種，這與河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所原圖 3 根腫菌生理小種 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 玉香等(2017)的報(bào)道結(jié)果一致。
2.2 青花菜、番茄和辣椒根腫菌侵染過(guò)程觀察
比較水培青花菜根腫菌侵染過(guò)程顯示，青花菜根部用熒光桃紅染液染色后，被根腫菌侵染的根毛呈紅色，未被侵染的根毛為無(wú)色。在接種后 7 d，青花菜根毛細(xì)胞內(nèi)有大量分生孢子侵入，表明根腫菌已侵染根毛，此時(shí)中青 16 號(hào)的根毛侵染率為 46.62%。在青花菜根腫菌侵染過(guò)程中，中青 16 號(hào)比中青 10 號(hào)生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，接種后，中青 16 號(hào)能維持較長(zhǎng)一段時(shí)間的正常生長(zhǎng)，而中青 10 號(hào)在接種后死亡速度較快，故未能進(jìn)行觀察。
根部皮層細(xì)胞內(nèi)有大量的孢子囊形成。隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，接種后 12 d 比 7d 時(shí)的根毛侵染率明顯提高 25.38%。到接種后 14d 時(shí)，根毛侵染率上升減緩，比接種后 12 d 時(shí)提高了 11.40%，根毛侵染率達(dá)到 83.40%。由此可見，在接種后 7～14 d 根腫菌能夠快速侵染青花菜，且在不同基因型間存在侵染速率上的差異。本試驗(yàn)中，中青 16 號(hào)相比中青 10 號(hào)在接種后能夠延長(zhǎng)生存時(shí)間，滯緩根腫菌侵染速率，但在接種后 14d 時(shí)，中青 16 號(hào)根部皮層細(xì)胞內(nèi)仍形成大量的孢子囊。
番茄品種中雜 302 水培接種根腫菌侵染過(guò)程顯示，在接種后 7 d 時(shí)根腫菌開始侵染根毛，此時(shí)根毛侵染率較高，為 32.80%，但比青花菜中青 16 號(hào)的根毛侵染率低。接種后 12 d 時(shí)仍有部分番茄根毛被根腫菌侵染，相比接種后 7 d 的根毛侵染率提高不到 10%，部分根腫菌孢子已進(jìn)入根部皮層細(xì)胞，但明顯低于中青 16 號(hào)的侵染率。接種后 14 d 時(shí)番茄根毛發(fā)生明顯扭曲，根部皮層細(xì)胞可明顯觀察到侵入的根腫菌分生孢子，此時(shí)根毛侵染率為 48.21%。
3 結(jié)論與討論
近年來(lái)，十字花科作物受根腫病影響和危害越來(lái)越大，備受國(guó)內(nèi)外關(guān)注。青花菜在國(guó)內(nèi)外廣泛種植，2019年我國(guó)種植面積約8.67萬(wàn)hm(李占省 2 等，2019)。目前，根腫病已嚴(yán)重危害青花菜主產(chǎn)區(qū)的栽培，如浙江臺(tái)州、云南通海、河南新野等地，危害面積逐年增加。為了更好地挖掘和創(chuàng)制青花菜抗根腫病資源，本試驗(yàn)以抗根腫病的茄果類蔬菜作物番茄和辣椒為對(duì)照，以感病青花菜作為目標(biāo)研究對(duì)象，通過(guò)水培法觀察根腫菌侵染茄果類和十字花科類作物根部細(xì)胞的過(guò)程，來(lái)揭示對(duì)照組和感病組在根腫菌侵染過(guò)程中的差異變化，為十字花科選育抗根腫病資源提供一種新思路。
本試驗(yàn)為了準(zhǔn)確鑒定根腫菌生理小種的種類，結(jié)合國(guó)內(nèi)外報(bào)道，特選用根腫菌生理小種特異分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定，與原玉香等(2017)報(bào)道的河南新野菌株為 4 號(hào)生理小種的研究結(jié)果一致，表明分子鑒定可作為一種輔助手段實(shí)現(xiàn)根腫菌生理小種的快速鑒定。
不同青花菜基因型間以及不同科屬作物間根腫菌的侵染過(guò)程均存在顯著差異，但相同的是番茄、辣椒與青花菜一樣，在水培條件下都能夠被根腫菌侵染，且其侵染過(guò)程與十字花科作物青花菜相似，都是從進(jìn)入根毛開始，再侵染根部皮層細(xì)胞，形成分生孢子或孢子囊，但在根腫菌侵染率方面，三者存在明顯差異：青花菜上根腫菌的根毛侵染率明顯高于番茄和辣椒。
從觀察結(jié)果來(lái)看，雖然后期中青16 號(hào)、中雜 302 和中椒 115 的根毛侵染率均有所增加，但番茄和辣椒明顯低于青花菜，與接種后 12 d相比，接種后14 d時(shí)番茄根毛侵染率提高了6.41%，辣椒根毛侵染率提高了 1.80%，而青花菜根毛侵染率提高了 11.40%;從進(jìn)入根毛的根腫菌孢子數(shù)量來(lái)看，中青 16 號(hào)也明顯多于中雜 302 和中椒 115。綜上所述，青花菜與番茄、辣椒在根腫菌侵染率方面存在明顯差異，青花菜根腫菌侵染速率和侵染率最高，其次是番茄，辣椒最低，且番茄、辣椒根部皮層細(xì)胞不能形成孢子囊。
本試驗(yàn)中，番茄和辣椒根際分泌物可能發(fā)揮了根腫菌防御作用，但在水中根際分泌物可能有別于土壤(Gossen et al.，2019)，水中番茄和辣椒的根際分泌物會(huì)被稀釋，因此根腫菌能夠侵染根毛和皮層。土壤栽培環(huán)境下根腫病并不會(huì)對(duì)番茄和辣椒造成危害，從而驗(yàn)證了茄果類蔬菜根際分泌物的重要性，暗示了可以通過(guò)在土壤中增施茄果類蔬菜根際分泌物的方式來(lái)預(yù)防和降低十字花科蔬菜根腫病的危害，這將是一種更加綠色、環(huán)保和高效的方法(張婷玉 等，2014;韓旭 等，2015;楊丹丹 等，2018;Fu et al.，2019)。
此外，高附加值的十字花科作物或許可以通過(guò)嫁接茄果類作物優(yōu)良砧木來(lái)預(yù)防根腫病的發(fā)生。本試驗(yàn)結(jié)果為以上兩種方法提供了一定的科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐，為選育十字花科高抗和免疫根腫病材料提供了新思路。目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的十字花科蔬菜抗根腫病基因主要來(lái)自蕪菁、蘿卜和大白菜(Suwabe et al.，2003，2006;Zhanget al.，2015)，其中蕪菁報(bào)道最多，發(fā)現(xiàn)了 11 個(gè)主效基因或 QTL(Piao et al.，2004)，茄果類蔬菜尚未見抗根腫病基因的相關(guān)報(bào)道，其免疫機(jī)理有待深入研究與利用。
參考文獻(xiàn)
白宇鵬.2019.蕓薹根腫菌生理小種鑒別系統(tǒng)的建立〔碩士論文〕.沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué).
丁云花，簡(jiǎn)元才，余陽(yáng)俊，汪維紅，耿麗華，康俊根.2013.我國(guó) 8 省市十字花科蔬菜根腫病菌生理小種的鑒定.中國(guó)蔬菜，(16)：85-88.
杜艷，劉郵洲，劉永鋒，李建斌，喬俊卿，許凌宇.2016.甘藍(lán)根腫病菌休眠孢子的生物學(xué)特性及侵染寄主的顯微觀察.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，29(6)：1323-1327.
韓旭，牛玉，杜公福，曹振木.2015.水培黃燈籠辣椒根系分泌物的化學(xué)成分鑒定.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，43(12)：151-156，160.
李占省.2012.青花菜中萊菔硫烷含量遺傳分析、QTL 定位及相關(guān)基因研究〔博士論文〕.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院.
李占省，劉玉梅，方智遠(yuǎn)，楊麗梅，莊木，張揚(yáng)勇，呂紅豪，王勇.2019.我國(guó)青花菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀、存在問題與應(yīng)對(duì)策略.中國(guó)蔬菜，(4)：7-11.
李占省，劉玉梅，韓風(fēng)慶，方智遠(yuǎn)，楊麗梅，莊木，呂紅豪，王勇，季家磊.2021.“十三五”我國(guó)青花菜遺傳育種研究進(jìn)展.中國(guó)蔬菜，(1)：33-40.
楊丹丹，胡承孝，程勤，賈瑋，趙小虎.2018.根腫菌與根系互作效應(yīng)及其影響因素研究進(jìn)展.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，35(34)：77-81.
作者：謝 琪 劉玉梅 韓風(fēng)慶 莊 木 李占省
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